量子点(quantum dots,QDs)是一种由Ⅱ~Ⅵ或Ⅲ~Ⅴ族元素构成的半导体纳米材料，粒径介于1~100 nm之间，由半导体纳米晶体核心和外壳组成. 核心多为金属与非金属形成的化合物，如硒化镉(CdSe)、 硫化镉(CdS)、 磷化铟(InP)、 碲化镉(CdTe)^[1,2]等，其外壳具有结合功能集团的作用，使得QDs具有良好的光学稳定性、 荧光性和生物兼容性等^[3]，被广泛应用于荧光探针、 多功能药物传递、 医学成像、 生物芯片和环境监测等领域^[4,5]. 随着QDs的广泛运用，其生物学毒性效应和环境影响成为人们关注的焦点. 近年来，许多学者就QDs的毒性机制、 生物毒性效应以及其对环境的危害等方面进行了研究. 结果发现，QDs的毒性取决于自身理化性质的诸多因素，包括QDs尺寸大小、 核心镉离子的释放、 表面电荷、 壳层稳定性、 表面修饰聚合物^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}等. 量子点的毒性研究主要集中在体外细胞上^[6,7]，活体试验主要是以鼠类的研究甚多^[12]. 然而在自然环境中，这种人工合成的以镉系量子点为原料的产品可能随着产品的使用，丢弃使其释放、 掺入或流入等多种途径进入水体，不可避免地对水生生态系统造成一定的危害，并可通过食物链在鱼类等水生生物体内富集并最终进入人体，对人体健康构成威胁^[13]. 有研究指出纳米材料TiO₂在地表水中的浓度为21 ng ·L^-1，C₆₀在污水厂出水中的浓度为 4 ng ·L^-1[14]； 但这些纳米材料与环境接触的过程能使其形成更高浓度的悬浮液，如无限搅拌，可使 C₆₀在淡水中的浓度达到 35 mg ·L^-1[15]. 量子点在水环境中的监测数据鲜见报道，甚至其对水生生物毒理学的研究资料也较少^[16]，李鸿程等^[17]研究了QDs对雄性泥鳅的毒性试验，陈幕飞等^[18]报道了QDs对稀有鮈鲫胚胎发育的毒性. 因此，评价量子点对水生生物尤其是鱼类发育的安全性问题已引起众多学者们的关注.

本研究选用模式生物斑马鱼为试验对象，选取斑马鱼胚胎发育过程中的形态毒理学终点^[19]、 体内氧化应激指标(SOD和MDA)和分子标志物(MT和Hsp 70 基因)mRNA表达量作为毒性指标，初步探讨CdSe/ZnS QDs对斑马鱼胚胎发育的影响，通过揭示CdSe/ZnS QDs对鱼类早期发育的毒性效应，旨在为鱼类的毒理学研究提供参考，也为量子点对生物的安全性评估提供基础资料. 1 材料与方法 1.1 试验用量子点

本试验所用量子点为水溶性聚乙二醇(PEG)修饰的非靶向CdSe/ZnS QDs，浓度为8 μmol ·L^-1，粒径为8~12 nm，单分散性一致，颗粒之间独立存在，荧光最大发射波长为613 nm，购于武汉伽源量子点技术开发有限公司. 1.2 受精卵获取

试验亲鱼为本实验室长期饲养的斑马鱼(Danio rerio，AB系)，从养殖群体中挑选出性成熟斑马鱼雌雄分缸，在标准化斑马鱼培养系统中养殖，培养液[58 mmol ·L^-1 CaCl₂，0.7 mmol ·L^-1 KCl，0.4 mmol ·L^-1 MgSO₄ ·7H₂O，0.6 mmol ·L^-1 Ca(NO₃)₂ ·4H₂O，0.5 mmol ·L^-1 HEPES，pH 7； ionic strength (I)=0.18 mol ·L^-1]加入0.6%商业化海盐，流水养殖系统中饲养，水温控制于28℃±0.5℃，光照周期为14 L ∶10 D. 收集胚胎的前一天晚上，将雌雄以1 ∶2配对移入交配盒，待其自然产卵受精. 1.3 试验设计

根据预试验的结果，设置1个空白对照组(浓度为0 nmol ·L^-1)、 4个CdSe/ZnS QDs 浓度组：分别为50、 100、 200和400 nmol ·L^-1，以及浓度为2 mg ·L^-1 Cd²⁺作为阳性对照组(Cd²⁺浓度等同于50 nmol ·L^-1 QDs含镉量)，用斑马鱼培养液稀释成相应的浓度梯度. 为了减少试验误差以及避免受精过程的不确定性，在囊胚期于显微镜下挑选出发育正常的斑马鱼胚胎，并从囊胚期(2.5~3 h)开始染毒. 用24孔细胞培养板作为染毒试验容器，每孔放入20枚胚胎，分别加受试液1 mL，将24孔细胞培养板置于精密恒温水浴锅中，水温控制在28℃±0.5℃. 试验重复3次，每个浓度设3组平行. 试验期间，及时剔除死亡个体，每间隔12 h换1/2同等浓度的溶液，光照周期为14 L ∶10 D. 1.4 显微观察

每间隔6 h记录各浓度组胚胎死亡、 畸形、 孵化的情况，用LEICA Mz16FA荧光体视显微镜和Nikon SMZ 1000体视显微镜观察胚胎并照相. 用Image-pro plus 6.0图像软件分析72 hpf仔鱼体长. 孵化抑制率=[(空白对照组胚胎孵化数－处理组胚胎孵化数)/空白对照组胚胎孵化数]×100% 1.5 抗氧化指标测定

斑马鱼胚胎发育至72 hpf时，用4℃的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗受试斑马鱼胚胎，去除表面附着的QDs，置于离心管中，吸去残余水分，加入预冷的PBS缓冲液冰浴匀浆，4℃ 12000 r ·min^-1离心15 min，取上清液. 样品总蛋白含量和氧化应激指标(SOD和MDA)测定均按照试剂盒的说明书(南京建成生物工程研究所)进行. 1.6 MT和Hsp 70 mRNA定量分析

根据GenBank中斑马鱼MT基因序列和Hsp 70 基因序列，用斑马鱼管家基因β-actin作为内参，设计MT、 Hsp 70 和β-actin基因引物(如表 1). 所有引物由Invitrogen公司合成，选取发育至24 hpf和72 hpf试验组与对照组斑马鱼的胚胎，参照Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂提取总RNA，D260/D₂₈₀ 为1.90左右. 根据PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa 公司)试剂盒将各样品RNA进行逆转录.

表 1(Table 1)

表 1 real-time PCR 所用到的引物 Table 1 Primers sequences used for real-time PCR 基因 序列号 5′-3′ MT BC-045879 Forward CTTGGGTATGGAATCTTGCG Reverse AGCATTTGCGGTGGACGAT Hsp70 NM-194273 Forward GCCAAGACTGGAACTTGCAAC Reverse CGCAGCCAGAGGCACACT β-actin NM-131397 Forward ATCACAGTTCCAGCCTATTTCAAA Reverse TGCCGTCTTCGATGGTCAG

表 1 real-time PCR 所用到的引物 Table 1 Primers sequences used for real-time PCR

荧光定量RT-PCR反应体系(20 μL)：SYBR Green Realtime PCR Master Mix(2×) 10 μL、 正向及反向引物各0.8 μL、 cDNA模板1.6 μL、 补充无菌水至总体积. 扩增条件为：预变性95℃ 5 min，40个循环(95℃ 20 s，58℃ 25 s，72℃ 25 s)，反应结束后制备溶解曲线. 每个反应设3复孔，所有检测样品均包含1个无模板的阴性对照以排除假阳性结果. 采用2^-ΔΔCT 法分析荧光定量结果^[20]，并利用统计学软件进行单因素方差分析. 1.7 数据处理

用SPSS 17.0统计软件进行数据统计和分析，采用t检验进行比较，P<0.05表示差异显著. 结果以平均值±标准误(Mean±SE)来表示.

2 结果与分析 2.1 斑马鱼胚胎形态观察

CdSe/ZnS QDs 暴露对斑马鱼胚胎和孵出仔鱼产生多种毒性效应[图 1(e)~1(k)]. 从毒物暴露开始到24 hpf，Cd²⁺对照组的胚胎已出现明显的中毒症状，呈现出卵凝集现象[图 1(f)]，荧光体视显微镜下观察到QDs已通过卵膜进入胚胎体内[图 1(a)和1(b)]； 除空白对照组和50 nmol ·L^-1 QDs 浓度组胚胎发育正常外[图 1(e)]，其余QDs浓度组胚胎开始出现中毒症状，个别胚胎出现不同程度的卵凝集现象. 36 hpf，QDs浓度组和Cd²⁺阳性对照组部分胚胎出现胚体畸形[图 1(h)]. 48 hpf，200 nmol ·L^-1和400 nmol ·L^-1 QDs浓度组有胚胎部分提前出膜，但提前出膜的仔鱼大多畸形[图 1(i)]. 60 hpf，QDs浓度组和Cd²⁺阳性对照组孵出仔鱼出现不同程度上的畸形，主要表现为心包与卵黄囊水肿，尾部和脊柱弯曲等现象[图 1(i)~1(k)]. 暴露至72 hpf时QDs主要集中在孵出仔鱼的头部及心脏周围[图 1(c)和1(d)]； 浓度组和Cd²⁺阳性对照组未出膜的胚胎大多数在膜内死亡，已孵出的仔鱼行动能力较弱，体长明显缩短，畸形加重，有些胚胎还出现多种畸形并存现象.

图 1

Fig. 1

a、 b：暴露至24 hpf QDs已进入胚胎内(箭头所示为同一位置)； c、 d：暴露至72 hpf QDs在孵出仔鱼体内的分布(箭头示同一位置)； e：正常胚胎(囊胚期)； f：卵凝集； g：正常胚胎； h：胚体畸形； i：心包囊肿、 卵黄囊肿与短尾； j、 k：尾部、 脊柱弯曲 图 1 CdSe/ZnS QDs 对斑马鱼胚胎/仔鱼的致死及致畸效应 Fig. 1 Effects of exposure to CdSe/ZnS QDs on developing zebrafish embryos/larva

斑马鱼胚胎发育至24 hpf时，表现出胚体的自主运动，每个浓度组随机选6枚胚胎记录30 s胚体自主运动次数，取均值进行比较(图 2). QDs浓度组斑马鱼胚胎的自主运动频率均较空白对照组有所增加，尤其是200 nmol ·L^-1 QDs浓度组的胚胎自主运动频率增加明显(P<0.05). QDs各浓度组虽有一定程度上的波动但均与Cd²⁺阳性对照组的差异不明显(P>0.05).

图 2

Fig. 2

*表示QDs浓度组与空白对照组差异显著 图 2 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼24 hpf自主运动频率的影响 Fig. 2 Effects of QDs on spontaneous movement frequency of zebrafish embryos at 24 hpf

QDs对斑马鱼孵化率的影响见图 3. 200 nmol ·L^-1 QDs浓度组斑马鱼胚胎最早出膜时间为48 hpf，比空白对照组、 Cd²⁺阳性对照组都提前6 h； 54 hpf时，200 nmol ·L^-1和400 nmol ·L^-1 QDs浓度组出膜率明显较空白对照组与Cd²⁺阳性对照组高，但出膜的仔鱼大多呈畸形； 72 hpf时，各试验组的胚胎最终孵化率均较空白对照组明显的降低，计算其孵化抑制率发现，QDs浓度组胚胎的孵化抑制率随着试验浓度的增加均有不同程度上升高，其中200 nmol ·L^-1和400 nmol ·L^-1 QDs浓度组胚胎孵化 抑制率分别为28.33%、 36.67%，Cd²⁺阳性对照组胚胎孵化抑制率为30.43%.

图 3

Fig. 3

*表示QDs浓度组与空白对照组差异显著 图 3 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼胚胎72 hpf孵化率的影响 Fig. 3 Effects of CdSe/ZnS QDs on hatching success of zebrafish embryos at 72 h

对各组斑马鱼胚胎发育至72 hpf的畸形率与死亡率进行统计(表 2). 从表 2可以看出，随着QDs浓度的升高，胚胎畸形率与死亡率均显著性升高，各浓度组的畸形率与死亡率较空白对照组升高显著(P<0.05). Cd²⁺阳性对照组较50 nmol ·L^-1和100 nmol ·L^-1 QDs浓度组胚胎畸形率和死亡率均显著性升高(P<0.05)，而比400 nmol ·L^-1 QDs浓度组的畸形率和死亡率却显著的降低(P<0.05). 采用概率单位法，得出斑马鱼胚胎72 hpf的EC₅₀为316.994 nmol ·L^-1，其95%置信区间为：264.976~398.263 nmol ·L^-1.

表 2(Table 2)

表 2 不同浓度 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼胚胎死亡率和畸形率的影响 Table 2 Mortalities and malformation rates during embryonic development of zebrafish under QDs exposure 组别 CdSe/ZnS QDs 浓度/nmol·L-1 Cd2+对照组 0 50 100 200 400 畸形率/% 0 6.67±1.67*# 18.33±4.41*# 45.00±2.87*# 56.67±3.33*# 33.33±2.87 死亡率/% 0 6.67±1.67*# 15.00±2.89*# 23.33±1.67* 33.33±1.67*# 23.33±1.67 1)*表示QDs浓度组与空白对照组差异显著；# 表示QDs浓度组与阳性对照组差异显著(P<0.05),下同

表 2 不同浓度 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼胚胎死亡率和畸形率的影响 Table 2 Mortalities and malformation rates during embryonic development of zebrafish under QDs exposure

QDs暴露至72 hpf时，随着QDs浓度的增加，斑马鱼仔鱼体长呈不同程度上的缩短(图 4)，100、 200和400 nmol ·L^-1 QDs浓度组的仔鱼体长较空白对照组均显著性降低(P<0.05)； Cd²⁺阳性对照组斑马鱼仔鱼体长与空白对照组、 50 nmol ·L^-1 QDs浓度组降低显著(P<0.05)，与其余浓度组仔鱼体长差异不明显(P>0.05).

图 4

Fig. 4

图 4 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼 72 hpf 仔鱼体长的影响 Fig. 4 Effects of CdSe/ZnS QDs on body length of zebrafish larva at 72 hpf

QDs对斑马鱼胚胎的影响还体现在氧化损伤方面(图 5). 对发育至72 hpf斑马鱼的抗氧化酶测定显示，100 nmol ·L^-1和200 nmol ·L^-1 QDs浓度组斑马鱼SOD 活性较空白对照组升高明显(P<0.05)，然而随QDs浓度的增加，400 nmol ·L^-1浓度组SOD活性却显著性的降低(P<0.05)； Cd²⁺阳性对照组较空白对照组相比，SOD活性降低明显，其活性与400 nmol ·L^-1QDs浓度的SOD活性相接近. 斑马鱼体内 MDA 含量随QDs浓度升高而升高(图 5)，各QDs浓度组的MDA含量均较空白对照组显著性升高(P<0.05)； Cd²⁺阳性对照组MDA含量为4.22 mmol ·mg^-1，显著高于QDs浓度组(P<0.05).

图 5

Fig. 5

图 5 CdSe/ZnS QDs 对72 hpf 斑马鱼SOD活性和MDA含量的影响 Fig. 5 Effects of CdSe/ZnS QDs on SOD activities and MDA contents of zebrafish at 72 hpf

荧光定量的结果显示(图 6)，胚胎发育至24 hpf时，MT基因随QDs浓度的增加总体表现出上调趋势，其中高浓度组(200 nmol ·L^-1和400 nmol ·L^-1) MT基因表达量较空白对照组上调极为明显(P<0.05). 随着胚胎发育的继续，在受精后72 h时，MT基因表达量略有下降，但仍较空白对照组有显著性的差异. 相比Cd²⁺阳性对照组在胚胎受精24 h时，MT基因表达量与各浓度组之间有着极显著的差异(P<0.05)，但随着胚胎发育的继续，在受精72 h时，其MT基因表达量降低明显与空白对照组无显著性差异.

图 5

Fig. 6

图 6 CdSe/ZnS QDs 对斑马鱼MT和Hsp 70 基因mRNA表达的影响 Fig. 6 Effects of CdSe/ZnS QDs on MT and Hsp 70 mRNA of zebrafish

在Hsp 70 基因表达方面(图 6)，24 hpf时，QDs浓度组Hsp 70 基因表达量较空白对照组呈上调趋势，100、 200和400 nmol ·L^-1 QDs浓度组的Hsp 70 基因表达量上调显著(P<0.05)； 胚胎发育至72 hpf 时，Hsp 70 基因表达量与浓度组之间呈不同程度上的变化，其中50 nmol ·L^-1和100 nmol ·L^-1 QDs浓度组Hsp 70 基因表达量与较空白对照组上调显著(P<0.05)； Cd²⁺阳性对照组随着胚胎发育的继续，Hsp 70 基因表达量明显上调，其中72 hpf时其表达量是空白对照组的8.74倍，较QDs浓度组有着明显的上调(P<0.05).

3 讨论 3.1 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼胚胎发育的影响

有研究指出，胚胎的孵化是由于孵化酶、 胚体扭动以及膜脂质的过氧化共同作用，来减弱卵膜的脆性，从而使胚胎破裂出膜^[16]. 关于QDs的毒性作用机制研究表明，由于生物体或外界环境的氧化作用，QDs壳层结构受到破坏，壳层氧化脱落，进而引起中心核的氧化以及Cd²⁺释放，从而产生毒性； 另外其毒性还与QDs的纳米性质等有关^[8,21,22]. 本试验采取低于QDs实际应用浓度的较低剂量浓度，对斑马鱼初期发育进行持续暴露72 hpf. 结果显示，在CdSe/ZnS QDs暴露至24 hpf 时，可观察到QDs已进入斑马鱼胚胎内，进入胚体的QDs导致其发育形态、 死亡率、 畸形率、 孵化率、 自主运动和体长发生了变化，并造成心包、 卵黄囊水肿等多种毒性现象. 此外，200 nmol ·L^-1和400 nmol ·L^-1浓度的QDs促使胚胎提前出膜，但在其72 hpf的孵化抑制率均高于空白对照组. 这表明CdSe/ZnS QDs较易(粒径小于8~12 nm)通过卵膜渗透进入胚胎^[23]，QDs降解释放出的Cd²⁺，可能影响到其孵化酶、 渗透功能和生物物理学等一方面或多方面的正常功能^[24]，从而导致胚胎畸形或死亡； 同时，进入胚胎的QDs聚集在细胞膜上，造成膜脂质过氧化和膜渗透功能的改变，使卵膜脆性减弱^[25]，再加上胚体的扭动，进而改变胚胎的孵化出膜的时间和孵化率. 本研究还表明，无论从斑马鱼畸形和死亡情况还是氧化应激以及基因标志物的变化情况来看，Cd²⁺阳性对照组(等同于50 nmol ·L^-1 QDs的含镉量)对斑马鱼胚胎的毒性作用远远大于50 nmol ·L^-1 QDs，这可能是因为QDs外壳的保护作用，其核心Cd²⁺在斑马鱼胚胎体内只有部分被释放出来，释放出的Cd²⁺对鱼体造成了一定程度的伤害^[10]. 3.2 CdSe/ZnS QDs 对斑马鱼的氧化应激作用

正常情况下机体的氧化系统处于动态平衡中，但当机体在遭受各种有害物质刺激时，体内的活性氧自由基(ROS)就会产生过多，超出机体的自我清除能力，导致体内的氧化系统和抗氧化系统失去平衡，造成机体组织损伤、 脂质过氧化，从而引起机体生理机能的改变^[26]. SOD作为鱼类体内普遍存在的一种清除生物氧化产生的ROS^[27]的抗氧化酶，在保护生物体正常机理功能和控制膜脂质过氧化等方面扮演着重要的角色. 本研究结果表明，低浓度(50、 100和200 nmol ·L^-1)QDs暴露下斑马鱼胚胎体内的SOD活性较空白对照组和Cd²⁺阳性对照组明显升高，可能的原因是生物体酶活性在低浓度暴露物作用下升高的一种刺激反应，称此反应为“毒物兴奋效应”^[28]； 然而400 nmol ·L^-1 QDs浓度组和Cd²⁺阳性对照组SOD 活性均较空白对照显著性降低，这可能是因为QDs进入机体后，核心镉离子部分释放与氧分子发生作用，机体受到损伤，产生过量的ROS^[29]，导致体内的氧化系统和抗氧化系统失去平衡，致使SOD大量的消耗，超出机体的自我清除能力. MDA是机体脂质过氧化作用的产物，作为反映机体氧化损伤程度的指标之一，其含量的变化可在一定程度上反映出生物机体细胞受损伤的程度. 本研究发现，QDs暴露72 hpf时，斑马鱼机体MDA含量明显增加. 这些结果表明，CdSe/ZnS QDs 暴露导致了斑马鱼体内产生过量的ROS，体内脂质过氧化反应加强，机体抗氧化系统失衡而遭受严重的氧化损伤. 3.3 CdSe/ZnS QDs对斑马鱼MT与Hsp 70 基因表达的影响

目前关于鱼类对重金属的解毒机制有大量的研究，并认为MT蛋白作为调节生物机体内重金属的水平以及保护机体免受有毒金属和氧化应激诱导药物的损伤方面有很大的作用^[30]. QDs其核心物质主要为镉离子，QDs穿过细胞膜进入细胞后，镉离子被释放到细胞质中，游离的镉离子会引发 MT 蛋白家族上调等一系列自我保护反应^[31]. 本研究结果显示QDs从一定程度上影响了斑马鱼胚胎MT基因表达的上调，尤其是24 hpf QDs浓度组胚胎MT基因表达量上升极为明显，400 nmol ·L^-1 QDs浓度组MT基因表达量较72 hpf 上调5倍左右，原因可能是由于该时期QDs刚通过卵膜进入斑马鱼胚胎，胚胎体内对QDs产生的一种自我保护反应； 72 hpf 时，由于胚胎的发育，其体内逐步形成了一种自我反应体系来降低QDs对其的毒性作用. 这一损伤结果在一定程度上表明，氧化损伤产生的ROS或许在量子点引发的细胞毒性中起着重要作用^[25]. 有研究指出，Cd²⁺暴露会诱导斑马鱼类胚胎MT基因的过量表达，本研究不论QDs浓度组还是Cd²⁺阳性对照组都明显的诱导了MT基因的表达，这可能是由于QDs的核心Cd²⁺部分释放所致^[16].

有研究表明，Hsp可作为受污染土壤与海洋中生物所产生的受胁迫标记^[32]. Blechinger等^[33]在转基因斑马鱼胚胎试验中证实了Cd²⁺明显的诱导Hsp 70 基因表达水平的上调. 本研究结果显示QDs在一定程度上影响了斑马鱼胚胎Hsp 70 基因表达情况，72 hpf时低浓度(50 nmol ·L^-1和100 nmol ·L^-1)QDs试验组Hsp 70 基因表达水平显著提高，其原因除了释放出的Cd²⁺影响外，还可能与该时期胚胎孵化出膜对外界的适应性有关.

4 结论

(1)CdSe QDs暴露明显影响了斑马鱼胚胎死亡率、 畸形率、 孵化率、 自主运动和体长的变化，引起多种毒性效应； 导致抗氧化系统失衡，诱导MT与Hsp 70 基因的表达.

(2)CdSe QDs的发育毒性可能与其纳米性质(如粒径较小、 易吸附性等)以及核心Cd²⁺的释放有关，但更重要原因可能是QDs的纳米性质与自身释放的Cd²⁺共同作用导致的脂质过氧化反应.