细胞壁是金属离子进入植物细胞的第一道屏障，在植物对重金属抗逆解毒方面起着重要作用^[1,2,3,4]. 有研究表明，超积累植物Thlaspi goesingense中70%的Ni与细胞壁物质结合^[2]；Austromyrtus bidwillii叶片中60%的锰累积在细胞壁中^[3]. 垂序商陆(Phytolacca americana L.)是中国境内发现的一种典型的锰超积累植物，叶片是其累积锰的主要器官，自然条件下(锰矿废弃地)其叶片中锰含量(以干重计)可高达19 300 mg ·kg^-1，水培条件下可达36 380 mg ·kg^-1[5,6,7]，叶片总锰含量的14.7%-19.6%积累在细胞壁中^[4]，因此细胞壁在垂序商陆累积解毒锰的过程中发挥了一定作用. 植物细胞壁含有蛋白质和多糖如纤维素、半纤维素、木质素、果胶质等，这些物质有许多有机配位基团如羧基、羟基、氨基等，可以参与一系列反应如离子交换、吸附、络合、沉淀及结晶等，改变金属元素在植物体内的蓄积行为^[8,9]. 对于不同的生物，它们的细胞壁上主要组成成分的差异导致了它们吸附能力及吸附机制的不同^{[10,11,12,13]}. 此外，溶液中的重金属离子、pH、温度等一些因素在一定程度上对生物体吸附也存在影响^[12,14]. 本研究拟采用垂序商陆叶片离体细胞壁为实验材料，分析其对锰的吸附能力，并采用红外光谱技术和同步辐射技术探讨了其吸附机制，以期为垂序商陆超积累锰的机制提供一定的科学依据. 1 材料与方法 1.1 植物培养

种子在湿沙里萌芽后，将其转移到1/2 Hoagland^[15]营养液中培养7 d，为避免锰在细胞壁的积累，选择生长一致的幼苗在不含MnCl₂的Hoagland营养液中继续培养28 d. 实验在人工智能温室(14 h光照，25℃白天/20℃晚上，相对湿度55%-60%)内进行，每3 d更换一次营养液，持续通气. 植物收获后洗净，液氮迅速冷冻，保存于-70℃冰箱备用. 1.2 细胞壁的提取

采用Zhong等^[16]方法：将冷冻的垂序商陆叶片在液氮中磨成粉末状，加入遇冷的75%乙醇混匀后冰浴静止20 min后3 000 r ·min^-1离心10 min，沉淀依次用遇冷的丙酮、甲醇-氯仿(1 ∶1，体积比)、甲醇各洗1次，最后用蒸馏水清洗2次，弃掉上清液，将沉淀冷冻干燥后再次研磨得到粗提的细胞壁，4℃下保存备用. 1.3 吸附实验

pH影响吸附实验: 选定浓度为0.6 mmol ·L^-1 的MnCl₂溶液作为吸收液(含0.01 mol ·L^-1 KNO₃，作为支持电解质)，用0.1 mol ·L^-1的KOH和HNO₃调节其pH至2、3、4、4.5、5、5.5、6和7. 取吸收液20 mL,加入细胞壁0.02 g，平衡24 h后在8 000 r ·min^-1下离心5 min,离心后取其上清液用原子吸收分光光度计(AAS，Thermo Sollar M6，USA)测定其中的Mn含量.

吸附等温实验：配置不同浓度MnCl₂(mmol ·L^-1) 吸收液：0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2，每个浓度3个重复. 准确称取细胞壁0.02 g，吸收液20 mL(含KNO₃ 0.01 mol ·L^-1，pH 5.0)，放于离心管中，振荡平衡24 h后8 000 r ·min^-1下离心5 min，离心后取其上清液测定其Mn含量. 其吸附过程用Langmuir和Freundlich模型拟合.

Langmuir方程表达式为：

Freundlich方程表达式：

式中，c_s为吸附量，c_e为平衡液的浓度，c_F和n为吸附特征常数. 1.4 傅立叶红外光谱(FTIR)测定 取粗提的垂序商陆叶细胞壁，分别加入10 mmol ·L^-1 的MnCl₂溶液摇匀，振荡1 h 后取出，离心，弃去上清液，重复一次. 再加入去离子水洗，振荡2 min，离心，去除上清液，重复洗3次. 将吸附锰后的细胞壁冷冻干燥备用. 分别称取粗提的叶细胞壁和结合Mn后的叶细胞壁2 mg，加入KBr (1 ∶100，质量比)混匀，压片，用傅立叶红外光谱仪(FTIR,Shimadzu 8900，Japan)测定，扫描波长为400-4 000 cm^-1. 1.5 X-射线吸收精细结构(XAFS)测定

将1.4节中结合Mn细胞壁冷冻干燥，压片后用于XAFS测定. 样品中Mn的K边吸收谱在北京同步辐射国家重点实验室BSRF的4W1A光束线(XAFS实验站)上测量. 储存环能量和最大电流强度分别为2.2 GeV和140 mA. 单色器为Si (111)平面双晶. 用荧光法探测Mn的K边吸收谱信号(Mn的K边为6 539 eV). Mn的参比物质如MnSO₄、 Mn(CH₃COO)₂和MnO₂粉末用透射法进行测定.

采用Athena (8.050)软件对本实验所得的XAFS谱进行解析. 获得的K边吸收谱XAFS经过边前背景扣除(Background Correction)、归一化(Normalization),提取X射线吸收近边结构谱(XANES)；再经E-K转化(Conversion)得到扩展X射线精细结构谱(EXAFS)，然后经过傅立叶变换(Fourier Transformation)得到径向分布函数(RDF)谱图. 采用Artemis (8.050)软件对EXAFS图谱进行理论计算和拟合，设定S₀=0.7，得到供试细胞壁吸附锰的第一壳层的配位数(N)，对应的原子间距(R)和Debye-Waller因子(σ²)等结构参数. 2 结果与分析 2.1 溶液pH对细胞壁吸附锰的影响

由图 1可见，不同pH条件下，垂序商陆叶细胞壁对锰的吸附量不同：当pH小于4.5时，细胞壁对锰的吸附随pH的增加而迅速增加，当pH大于6时，细胞壁对锰的吸附随pH的升高而下降(图 1). 细胞壁吸附锰的最适pH范围为5-6，pH值过高或者过低都不利于细胞壁对锰的吸附. 因此，为保证细胞壁对锰的吸附量，以下实验都在pH为5条件下进行.

图 1

Fig. 1

图 1 pH对垂序商陆叶细胞壁吸附锰的影响 Fig. 1 Effect of pH on the binding of Mn by leaf cell wall of P. americana

图 2结果表明，在溶液锰浓度低于0.3 mmol ·L^-1 时，垂序商陆叶细胞壁对锰的吸附量随着吸收液中锰浓度的增加而呈线性急速增加；当溶液锰浓度为0.3-1 mmol ·L^-1 时，这种增加趋势变缓；当吸收液中的锰浓度达到1 mmol ·L^-1 及以上时，垂序商陆叶细胞壁对锰的吸附量无明显变化，表明吸 附量已达到饱和. 采用2种最常用的吸附等温式Langmuir和Freundlich模型来拟合细胞壁对Mn的吸附过程，拟合参数见表 1. 由拟合结果可知，Langmuir方程和Freundlich方程均能较好地拟合细胞壁吸附Mn的过程，其决定系数(R²)分别为0.978 5、0.925 6 (P<0.01)，其中，Langmuir方程拟合效果更好. 由Langmuir方程拟合结果得叶细胞壁对Mn的最大吸附量为62.50 μmol ·g^-1.

图 2

Fig. 2

图 2 锰初始浓度对叶细胞壁吸附锰的影响 Fig. 2 Effect of Mn concentration on the binding of Mn by leaf cell wall of P. americana

表 1(Table 1)

表 1 垂序商陆叶细胞壁吸附锰的等温方程参数1) Table 1 Isotherm parameters of Mn adsorption on leaf cell wall of P. americana Langmuir方程 Freundlich方程 csmax/μmol·g-1 b/L·μmol-1 R2 cF/g·L-1 n(dimensionless) R2 62.50 0.003 8 0.978 5 0.582 0 0.666 6 0.925 6 1)csmax为最大吸附量，b和cF为平衡常数

表 1 垂序商陆叶细胞壁吸附锰的等温方程参数1) Table 1 Isotherm parameters of Mn adsorption on leaf cell wall of P. americana

傅里叶红外光谱法(FTIR)是一种基于化合物中功能团和极性键振动的结构分析技术，在判定官能团的存在及物质结构变化方面具有优越性^[17]. 叶细胞壁吸附锰前后的红外光谱见图 3，通过对比叶细胞壁吸附锰前后的红外光谱发现谱形没有变化，表明吸附Mn后细胞壁的结构未发生改变. 但是细胞壁结合Mn后，一些官能团的位置和强度发了明显的变化： 分别是3 418 cm^-1的吸收峰向低频移动，峰强度降低；1 647 cm^-1和1 373 cm^-1处的吸收峰强度减弱. 3 418 cm^-1处的强吸收峰是羟基伸缩振动带(—OH)，主要来自细胞壁结构中果胶、木质素、纤维素^[18]. 1 647 cm^-1是细胞壁蛋白质的酰胺Ⅰ带的—C O的伸缩振动峰^[13]. 1 373 cm^-1处是细胞壁果胶中的羰基(—C O)^[19]. 由此可见，细胞壁中的羟基和羰基在结合锰的过程中起了重要作用.

图 3

Fig. 3

图 3 垂序商陆叶细胞壁吸附Mn前后的FTIR图 Fig. 3 FTIR spectrum of P. americana leaf cell wall before and after Mn adsorption

同步辐射XAFS技术包括XANES和EXAFS技术，XANES可用来原位表征Mn在细胞壁吸附样品中的氧化态，而EXAFS通过与理论计算和拟合相结合则可进一步揭示Mn的微域分子结构及配位环境. 由图 4的XANES谱可见，Mn的XANES谱图的主峰位置与价态存在一定的关系，不同价态的Mn的主峰位置不同，随价态的增加其主峰的位置向高能方向偏移，四价的Mn(-6 550 eV)比二价态的Mn(-6 540 eV)的主峰位于更高的能量端. 垂序商陆叶细胞壁中Mn的主峰位置与MnSO₄和Mn(CH₃COO)₂的Mn较为一致，而低于MnO₂的Mn的吸收边能量，表明细胞壁结合的Mn是以＋2价态存在. 进一步采用Artemis软件对细胞壁吸附Mn的EXAFS谱图(图略)进行理论计算和拟合，得到第一配位层的结构参数(见表 2)，结果表明细胞壁吸附产物的第一配位层主要是Mn—O键，在Mn(Ⅱ)原子周围有6.3个氧原子与之配位，Mn—O平均键长为0.216 nm.

图 4

Fig. 4

图 4 垂序商陆叶细胞壁Mn的K-边X射线 吸收近边结构谱(XANES) Fig. 4 Normalized Mn K-edge XANES spectra of P. americana leaf cell wall

细胞壁对重金属的吸附受很多因素的影响，pH值是影响重金属吸附能力的主要因素之一. 本研究中，随pH增加，细胞壁对Mn的吸附量增加，在pH 5-6时，细胞壁对Mn的吸附量达最大值. 有研究 表明pH既能影响吸附剂表面的吸附位点，也能影 响溶液中重金属的化学形态^[12,14]. 本研究采用MINTEQA2模型，计算了溶液中Mn的化学形态，结果表明，在pH 2-7范围内，本实验溶液中Mn的形态98%以上为离子态(Mn²⁺). 因此，本实验中，pH对吸附量的影响主要是对细胞壁表面吸附位点上官能团的影响. 当pH小于4.5时，溶液呈酸性状态，细胞壁表面官能团较多的吸附位点被H₃O⁺占据，阻碍配位原子与Mn结合，溶液中高浓度的H⁺与Mn²⁺竞争细胞壁表面吸附位点是导致细胞壁对Mn的吸附量减小的主要原因^[12]；随着pH的逐渐增大，H₃O⁺逐渐减少，细胞壁表面官能团的吸附位点被释放出来，配位原子与Mn结合机会增加，同时随pH值的增大细胞壁表面的负电性官能团也增加，因此细胞壁对Mn的吸附量增加，在pH 5-6时，细胞壁对Mn的吸附量达最大值. 但当pH值大于6时，—OH的增多会阻碍官能团结合Mn，因此细胞壁对Mn吸附量降低. 有关pH影响生物材料对金属离子的吸附的研究已有很多报道，如Witek-Krowiak 等^[12]研究发现黄豆残渣对铜和铬的吸附量在pH 3-5范围内随pH增大而增加，在pH 5时吸附量达到最大；胡桃核对锰的吸附最大量发生在pH 为5-6范围内. 本研究结果与上述结果一致.

Langmuir和Freundlich等温方程是两种最常用的等温吸附模型，可用来解释其吸附机制. Langmuir方程是基于单层扩散吸附理论，假设吸附剂的量是有限的，吸附剂表面上的吸附位点是均匀的，并且吸附的能量保持恒定^[20]，它属于理论推导公式，适用于短时间的单组分重金属的生物吸附. Freundlich方程是一个非线性的经验公式，假定吸附发生在非均相吸附剂表面上，可以用于各种非理想条件下的表面吸附以及多分子层吸附^[21]. 本研究中，细胞壁对Mn²⁺的吸附行为可用Langmuir和Freundlich等温方程拟合，但Langmuir方程拟合的效果(R²=0.978 5)优于Freundlich方程(R²=0.925 6)，表明垂序商陆叶细胞壁表面的活性吸附位点是单层均匀分布的. Langmuir吸附等温方程还可以定义一个无量纲的平衡常数R^L，R^L=1/(1+bc0). R^L表示吸 附剂对吸附质的亲和力，可用来表征是否有利于等温吸附过程. 一般情况下，在0<R^L<1时，有利于吸附；R^L>1时，吸附性能不好；R^L=1时呈线性关系；R^L=0则表示吸附过程不可逆^[22]. 由方程计算的R^L值为0.1159，表明叶细胞壁对Mn的吸附性能较好.

植物细胞壁表明的纤维素、果胶、蛋白质等成分含有的活性官能团在对重金属的吸附过程中有着重要作用^[9]. FTIR分析是判定物质官能团的一种重要手段，从垂序商陆叶细胞壁的FTIR谱(图 3)中可以发现，叶细胞壁含有羰基、羟基、氨基、—C—O—C、—C—H键等，它们主要来自细胞壁的主要组分纤维素(或半纤维素)、果胶以及蛋白质等^[23]. 从细胞壁吸附Mn后的FTIR分析，可以发现羟基和羰基在叶细胞壁结合锰的过程中发挥了主要的作用，这表明Mn²⁺的主要吸附位点有可能是存在于垂序商陆叶细胞壁上的纤维素、木质素、果胶质等物质中的—OH、—C O等含氧活性基团上. 已有研究表明—OH在浮萍结合Zn的过程中起了重要作用^[10]；—OH、—C O参与了黄豆残渣吸附Cr(Ⅲ)和Cu(Ⅱ)的过程^[12]；Deng等^[13]的FTIR研究结果也表明来自水生植物Ruppia maritima体内的糖类，果胶和蛋白质中的—OH和—C O在对重金属离子的吸附过程中发挥了重要作用. XAFS是一种针对特定元素的原位分析方法，可在分子水平上识别目标元素周围的局部化学信息，在非破坏性、原位直接表征等方面体现出其独特的优越性^[24,25]. 本研究结果表明，叶细胞壁上Mn周围的O的配位数是6.3，Mn—O键长为0.216 nm(表 2)，这与文献^[26]报道的Mn—O键特征是一致的. 通过Mn—O键键长可推断，Mn与叶细胞壁的功能位点以内配层模式(inner-sphere complexation)相结合，叶细胞壁对Mn的吸附固定能力强；同时根据O的配位数为6.3可知，供试叶细胞壁结合的Mn主要与6个氧原子配位形成八面体构型，而实验得到的6.3个配体可能主要是由于配位数(N)和Debye-Waller因子(σ²)在拟合时具有较高的相关性以及生物样品的复杂性所致^[27]. Merdy等^[11]用扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)和X射线吸收近边结构(XANES)对Cu(Ⅱ)与小麦麦杆细胞壁的结合形态进行了研究，结果表明，Cu周围有4个氧原子包围，Cu—O键的平均键长为0.194 nm. 由此可见，植物对重金属的吸附能力及吸附机制会因植物以及重金属种类不同而有差异.

表 2(Table 2)

表 2 垂序商陆叶细胞壁中Mn的K边EXAFS拟合结果(第一配层) Table 2 Fitting results of Mn K-edge EXAFS spectra of P. americana leaf cell wall 样品 配位键 配位数 键长/nm σ2 1) E0 shift2) R3) 细胞壁-Mn Mn—O 6.3 0.216 0.006 3 -4.377 0.005 1) Debye-Waller因子，表示分子热振动和结构无序的参数；2) 拟合过程中Mn吸收边能量偏移；3) 拟合残差因子，表示拟合误差大小

表 2 垂序商陆叶细胞壁中Mn的K边EXAFS拟合结果(第一配层) Table 2 Fitting results of Mn K-edge EXAFS spectra of P. americana leaf cell wall

pH是影响细胞壁吸附能力的重要因素，垂序商陆叶细胞壁吸附锰的最适pH值为5-6. 在本实验研究浓度(0.01-2 mmol ·L^-1)范围内，叶细胞壁对锰的吸附性能较好，其热力学吸附行为可用Langmuir方程较好的描述，细胞壁表面的活性吸附位点呈单层均匀分布，当pH值为5时，细胞壁对锰的最大吸附量为62.50 μmol ·g^-1. 羟基(—OH)和羰基(—C O)在细胞壁结合锰的过程中发挥了主要的作用，锰周围第一配层为氧原子，其配位数是6.3，Mn—O键长为0.216 nm，细胞壁与锰主要以内配层模式相结合，对锰的吸附固定能力强.