多环芳烃(PAHs)是一类具有致癌、致畸、致突变效应的中性或非极性的持久性有机污染物. 环境中的PAHs主要赋存于土壤中^[1,2]. 由于其对脂肪和碳水化合物的亲和力强，因而会在植物体内积累并沿着食物链进入人体，进而危害人类健康. 据报道，非吸烟者体内的PAHs 主要来自摄取的农产品^[3]. 因此，研究植物根系对生长介质中PAHs的吸收转运及其机制对于阻控PAHs 进入食物链就显得非常重要.

尽管国内外关于植物根系对介质中PAHs的吸收已有颇多研究^[4,5,6]，但是关于植物根系吸收PAHs的确切过程和机制的报道却较为鲜见，如质外体在根系PAHs吸收过程中有何作用和贡献等. 质外体是指原生质以外的结构部分及空间，包括细胞壁、细胞间隙和木质部的导管等组成的体系^[7]. 质外体内存在着大量的水分、矿质离子以及有机物质. 质外体是一个动态空间，其内部会发生许多重要的生理生化过程，如溶质和水分的运输、组织形态的维持、内环境动态平衡的维持、生长与发育、信号转导以及抵抗逆境、光合作用的气体交换等^[8]. 水分、矿质营养元素和污染物等都可以通过质外体途径进行运输. 植物质外体物理、化学和生物化学功能的探究已经成为近年的研究热点^[9,10]，物质质外体运输的研究对于阐明物质在植物体内的运输过程及其调控具有重要意义.

虽然质外体运输的作用早已为人们所认识，但迄今关于质外体运输的研究还极为少见. 究其原因主要是尚无成熟、可靠的植物根系质外体溶液物质的提取方法. 目前质外体溶液物质的提取方法有压力法^[11]、淋洗法^[12]、离子选择电极法^[13]、微透析法^[14]和真空渗透离心法^[15]. 这些方法中，压力法可能会使质外体溶液提取不完全；淋洗法容易造成细胞膜的破裂和质外体溶液被严重稀释；离子选择电极法和微透析法比较耗时，并对操作技术要求较高，重复性差. 由于真空渗透离心法具有简便、高效和重现性好等特点，其已在一些植物叶片质外体溶液物质的提取中进行了尝试^[16,17,18]. 然而，真空渗透离心法也存在细胞膜破裂导致质外体溶液被原生质污染的问题^[19]. 为解决此问题，需要对真空渗透离心法影响质外体溶液组分的参数(真空度、真空时间、离心速率和离心时间)进行优化分析，以便在质外体溶液受原生质影响可忽略的情况下尽可能完全地提取质外体溶液中的物质.

菲是优先控制的16种PAHs中的一种，由于其大量用于染料和农药生产，具有一定的致癌、致畸作用；且此种化合物在环境中的含量和检出率高，从而成为众多研究者研究PAHs的代表物^{[20,21,22,23]}. 为此，本研究以小麦为材料，菲为PAHs的代表，采用真空渗透法提取小麦根系质外体液，测定其中的菲含量，并对影响提取的各因素进行优化，通过建立可靠的植物根系质外体溶液的分离方法，以期为揭示根系质外体内PAHs的运输过程及其调控提供方法依据.

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试小麦(Triticum aestivum L.)品种为南农9918(江苏地区主要的栽培品种之一)，购于江苏省农业科学院种子站. 1.2 试验设计 1.2.1 小麦培养

选取一定量比较均一的小麦种子用去离子水浮选去除瘪粒，然后用3% H₂ O₂消毒5 min. 消毒后的小麦种子置于底部铺有用去离子水浸湿的滤纸的搪瓷托盘中，并放入恒温培养箱中，在黑暗、25℃条件下进行催芽. 种子出芽后转移至底部铺有石英砂的搪瓷托盘中，并放入人工气候箱(白天/晚上温度分别为25℃/20℃，光照强度为400 μmol ·(s ·m²)^-1，光周期为16 h，相对空气湿度为75%)内用去离子水培养7 d. 选择长势比较一致的植株幼苗移入水培箱内进行连续曝气培养，先后在1/2浓度和全浓度的Hoagland营养液(pH 5.50)中各培养3 d. 接着用去离子水饥饿培养1 d，然后在Hoagland营养液(含菲1.0 mg ·L^-1)中培养4 h. 营养液中菲用甲醇溶解后加入，且各处理均含有等量的甲醇(控制甲醇浓度小于0.1%，在此浓度范围内甲醇对植物生长无影响^[24]). 上述处理结束后，植株根系用超纯水洗净后，放入甲醇中浸泡1-2 min，然后再用纯水洗净备用. 1.2.2 质外体溶液真空渗透离心法提取参数的优化

真空渗透离心法的主要流程为：称取一定量的植物根系鲜样于烧杯中 加入缓冲液 在真空干燥器中进行真空渗透 渗透后的根系进行离心 收集溶液. 上述流程中能导致质外体溶液被原生质污染的环节是真空渗透和离心，涉及参数有真空度、真空时间、离心速率和离心时间. 参数设置依据参考文献^[15]. (1) 真空度对小麦根系质外体溶液提取的影响

擦干小麦根系表面水分后，称取1 g根(鲜重)于50 mL烧杯中，向烧杯中加入足量的50 mmol ·L^-1 HCl-Tris(pH 8.0),0.6 mol ·L^-1 NaCl,0.1% β-巯基乙醇缓冲液. 将烧杯放入真空干燥器中，在真空度分别为10、30、40、50、70、90 kPa下抽10 min. 取出根系用吸水纸擦干后放入5 mL注射器内，再把注射器放入50 mL离心管中，在4℃、离心速率3 068 r ·min^-1条件下离心15 min，质外体浸提液收集于离心管内，收集到的质外体液立即分析或者-20℃保存.

(2) 真空时间对小麦根系质外体溶液提取的影响

抽提步骤同(1)，但真空度为70 kPa，真空时间分别设置为5、10、15、20、25、30 min. (3) 离心速率对小麦根系质外体溶液提取的影响

抽提步骤同(2)，但真空时间为10 min，离心速率分别为2 170、3 068、3 758、4 339、4 852、5 315 r ·min^-1. (4) 离心时间对小麦根系质外体溶液提取的影响

抽提步骤同(3)，但离心速率为3 068 r ·min^-1，离心时间设置为5、10、15、20、25、30 min. 1.3 测定方法 1.3.1 质外体溶液中菲的测定

1.2.2节中经抽提后的根系用5 mL甲醇洗涤根系表面，将洗涤液和质外体提取液混合作为质外体浸提液. 将质外体浸提液过无水Na₂SO₄柱后转移到50 mL圆底烧瓶，在40℃下用真空旋转蒸发仪蒸干，然后用正己烷溶解后转移至装有2 g硅胶的玻璃柱净化,并用25 mL 体积比为1 ∶1的正己烷和二氯甲烷混合液淋洗,洗脱液收集至圆底烧瓶,再次蒸干后,用2 mL甲醇溶解,过0.22 μm滤膜后用HPLC分析.

HPLC分析条件：HPLC为美国Waters公司生产,泵的型号为1525,紫外检测器型号为2487,色谱柱是Waters 4.6 mm×150 mm C₁₈反向柱,柱温30℃,流动相为甲醇/水(80/20，体积比),流速为1.0 mL ·min^-1. 进样量为10 μL,菲的紫外检测波长为254 nm. 该方法菲的最低检出限为48.5 pg，测定的相对标准偏差(n=5)＜2.85%. 在样品测定前进行分析标准的测定，采用内标法定量，菲的回收率为90.67%. 根系质外体菲含量以鲜重计. 1.3.2 六磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性测定

通常采用G6PDH活性判断质外体组分受原生质污染的程度.

(1) 根系总蛋白的提取 称取小麦根系1 g(鲜重),加入3 mL提取液(100 mmol ·L^-1 HCl-Tris pH 7.5,0.2 mol ·L^-1 KCl，20 mmol ·L^-1 MgCl₂,2 mmol ·L^-1 EDTA，1% TX-100，5 mmol ·L^-1 DTT，1 mmol ·L^-1 PMSF)和0.2 g硅胶进行冰浴匀浆. 然后在10 629 r ·min^-1、4℃离心20 min，上清液置冰上备用.

(2) G6PDH活性检测 G6PDH作为原生质的内标酶其活性检测是通过检测25℃条件下，5 min内340 nm处吸光值的变化来衡量^[25]. 向1 mL石英比色皿中加入750 μL反应液(100 mmol ·L^-1 HCl-Tris pH 7.5,65 mmol ·L^-1 MgCl₂,3 mmol ·L^-1 G6P，1.2 mmol ·L^-1 NADPH)和50 μL质外体提取液或总蛋白提取液，迅速混匀，立即测定. G6PDH的活性以鲜重计.

G6PDH的活性(U ·g^-1)=(反应后吸光度数值－反应前吸光度数值)×反应总体积(μL)÷样本体积÷反应时间(min)÷NADPH消光系数(0.00622)÷样品鲜重(g ·mL^-1). 1.4 数据统计分析

采用Excel及Origin 8.5软件对试验结果进行统计分析，数据以平均值±标准差(SD)表示，数据平行测定的样品数n=5. 2 结果与讨论 2.1 真空度对小麦根系质外体溶液提取的影响

真空渗透是对整个系统抽真空(旨在把细胞间隙中存在的空气抽出)，解除真空后，渗透液借助外部大气压力进入根系质外体空间. 体系的真空程度用真空度衡量. 真空度为大气压强与系统实际压强的差值(单位为kPa). 真空度越高，系统内压强越小，解除真空后渗透越彻底，质外体溶液物质离心提取就越完全. 然而，真空度过高会导致细胞膜的破裂，造成原生质外渗，进而污染质外体溶液，使得质外体溶液中溶质浓度升高. 因此，需探索适宜的系统真空程度. 在此真空度下，既尽可能完全地提取质外体溶液，又可避免细胞膜的破裂. 小麦根系质外体菲提取量随真空度的变化如图 1所示. 在溶液中菲浓度为1.0 mg ·L^-1条件下，小麦根系质外体菲的提取量随真空度的增高而增大，增加幅度也随真空度的增高而增加. 真空度从70 kPa增高到90 kPa时，根系质外体内菲提取量增加迅速，由2.34 mg ·kg^-1增到2.90 mg ·kg^-1；而真空度从10 kPa增高到70 kPa时，根系质外体内菲提取量增加缓慢，差异不显著(P>0.05).

图 1

Fig. 1

图 1 不同真空度下小麦根系质外体菲的提取量和G6PDH活性 Fig. 1 Changes of phenanthrene extraction amount and G6PDH activity in wheat root apoplast under different vacuum degree

G6PDH是存在于原生质体内的一种酶，通过检测质外体内G6PDH的活性，可以判断质外体组分受原生质污染的程度^[26]. 污染程度通常用污染率表示，污染率为根系质外体提取液G6PDH活性/根系总蛋白提取液G6PDH活性. 一般地，污染率低于1% 即认为原生质对质外体溶液的污染可忽略不计^[27]. 不同真空度下小麦根系质外体溶液G6PDH的活性如图 1. 从中可以看出，当真空度由10-70 kPa不断升高时，G6PDH的活性变化差异不显著(P>0.05)，这说明原生质对质外体溶液的影响很小. 当真空度由70 kPa继续升高时，G6PDH的活性显著增强(P<0.05)，这是由于真空度继续增高时，细胞膜的破裂导致了原生质对质外体溶液的污染所致. 本研究中小麦根系G6PDH总活性(以鲜重计)为(177.4±11.2) U ·g^-1. 结合图 1可知：真空度为90、70、50、40、30、10 kPa时质外体液受原生质体污染的程度(污染率)分别为8.9%、0.48%、0.41%、0.41%、0.32%、0.32%. 为了质外体液尽可能提取完全而又不受原生质的污染，小麦根系质外体溶液提取的适宜真空度为70 kPa. 2.2 真空时间对小麦根系质外体溶液提取的影响

通常真空时间越长，小麦根系抽提的质外体溶液的体积也越大；但是超过一定程度，可能会导致根系细胞破裂，进而使得胞内原生质外渗. 因此，必须选择适宜的真空时间. 小麦根系质外体内菲提取量与真空时间关系如图 2所示. 在不同真空时间下小麦根系质外体对菲的提取量有较大差异，其范围是2.23-3.26 mg ·kg^-1，其中真空时间为5 min和10 min时，根系质外体菲提取量较低，分别为2.23 mg ·kg^-1与2.32 mg ·kg^-1；随着真空时间的延长，根系质外体菲提取量显著增加(P<0.05).

图 2

Fig. 2

图 2 不同真空时间下小麦根系质外体菲提取量和G6PDH活性 Fig. 2 Changes of phenanthrene extraction amount and G6PDH activity in wheat root apoplast after different vacuum time

真空时间的不同会使质外体溶液受到不同程度的污染. 不同真空时间小麦根系质外体溶液G6PDH活性变化如图 2. 在5-10 min内，小麦根系质外体液内G6PDH活性增加，但差异不显著(P>0.05). 由图 2和根系G6PDH总活性可知：真空时间为5 min、10 min时质外体溶液受原生质污染的程度分别为0.24%、0.41%. 当真空时间由10 min增至30 min时，G6PDH活性快速增加，真空时间为15、20、25、30 min时质外体液受原生质污染的程度各为0.81%、1.0%、1.2%、1.3%. 因此，10 min是提取小麦质外体溶液的最佳真空时间. 2.3 离心速率对小麦根系质外体溶液提取的影响

不同离心速率对小麦根系质外体菲提取量的影响见图 3. 统计分析显示不同离心速率下，质外体菲提取量明显不同，且随着离心速率的增大菲的提取量明显升高. 离心速率为2 170 r ·min^-1和5 315 r ·min^-1时，质外体菲提取量分别为2.21 mg ·kg^-1和3.35 mg ·kg^-1，后者是前者的1.5倍. 离心速率为3 068 r ·min^-1时，质外体菲提取量为2.33 mg ·kg^-1，其与离心速率2 070 r ·min^-1的处理差异不显著(P>0.05)，而与其它处理间差异显著(P<0.05).

图 3

Fig. 3

图 3 不同离心速率下小麦根系质外体菲提取量和G6PDH活性 Fig. 3 Changes of phenanthrene extraction amount and G6PDH activity in wheat root apoplast under different centrifugal speed

离心速率作为质外体溶液菲真空渗透离心法提取的主要影响因素之一，其与真空度和真空时间一样，离心速率过高会导致细胞膜的破裂，造成原生质外渗，进而污染质外体溶液. 离心速率对小麦根系质外体溶液G6PDH活性的影响如图 3. 离心速率在2 170-3 068 r ·min^-1范围内，G6PDH活性随离心速率的增大逐渐增加，但差异不显著(P>0.05)；而在离心速率大于3 068 r ·min^-1时，G6PDH活性增加明显(P<0.05)，这是由于细胞膜受损导致原生质进入质外体溶液所致. 由图 3和根系G6PDH总活性可知：离心速率为2 170、3 068、3 758、4 339、4 852、5 315 r ·min^-1时质外体溶液的污染率分别为0.32%、0.41%、1.70%、4.3%、7.5%、8.2%. 为了避免原生质对质外体溶液的影响，宜选择3 068 r ·min^-1作为真空渗透离心法提取小麦根系质外体溶液菲的离心速率. 2.4 离心时间对小麦根系质外体溶液提取的影响

随着离心时间的延长，小麦根系质外体菲提取量有增加的趋势(图 4). 在5-15 min内，根系质外体菲提取量缓慢增加(P>0.05)；从15-30 min，根系质外体菲提取量显著增加(P<0.05). 离心时间为5、15、30 min时的根系质外体内菲含量分别为1.96、2.23、3.02 mg ·kg^-1，15 min、30 min时根系质外体内菲含量分别是5 min时的1.5倍、1.1倍.

图 4

Fig. 4

图 4 不同离心时间下小麦根系质外体菲提取量和G6PDH活性 Fig. 4 Changes of phenanthrene extraction amount and G6PDH activity in wheat root apoplast after different centrifugal time

离心时间的不同也会使质外体溶液受到原生质不同程度的污染，需要选择合适的离心时间减少原生质对质外体溶液的影响. 不同离心时间小麦根系质外体G6PDH活性变化如图 4. 其结果表明，在5-15 min内，小麦根系质外体G6PDH活性差异不显著(P>0.05). 由图 4和根系G6PDH总活性可知：离心时间为5、10、15 min时质外体溶液的污染率分别为0.24%、0.32%、0.48%. 当离心时间由15 min增至30 min时，G6PDH活性快速增加；离心时间为20、25、30 min时质外体溶液受原生质污染率为3.4%、4.1%、6.8%. 因此，离心时间为5-15 min时，原生质对质外体溶液的影响可忽略不计；15-30 min时，原生质对质外体溶液的影响较大，在用真空渗透离心法提取小麦根系质外体溶液菲时离心时间应选用15 min. 3 结论

(1)小麦根系质外体菲提取量随真空度、真空时间、离心速率和离心时间的增加而增大. 小麦根系质外体G6PDH的活性随真空度、真空时间、离心速率和离心时间的增加而升高.

(2)在真空度为70 kPa、真空时间为10 min、离心速率为3 068 r ·min^-1、离心时间为15 min条件下，小麦根系质外体菲的提取量分别为2.34、2.32、2.33、2.23 mg ·kg^-1.

(3)在质外体溶液受原生质污染程度小于1%且尽量提取完全的前提下，质外体溶液中菲提取的适宜参数为真空度70 kPa、真空渗透时间10 min、离心速率3 068 r ·min^-1、离心时间15 min.