截至2014年3月底，全国设市城市、 县累计建成城镇污水处理厂3622座，日处理污水能力约1.53×10⁹ m^3[1]，污水处理厂每年产生超过600万t污泥(以干重计)^[2,3]. 但是,目前城镇污水处理厂产生的浓缩污泥含水率通常高达97％左右，如此高的水分含量导致污泥体积庞大，给污泥的转运、 后续处理处置都带来了很大的困难^[4]. 因此,寻找合适的方法大幅降低污泥水分含量，是解决污泥出路的关键所在. 当前，添加各种化学絮凝剂并辅以机械脱水以实现“泥水分离”的方法普遍应用于我国污水处理厂，这些絮凝剂包括聚丙烯酰胺(PAM)、 氯化铁、 聚合硫酸铝或聚合三氯化铝和助凝剂如石灰等^[5]. 但在此方法中，投入的大量无机絮凝剂，会大幅增加整个污水处理过程的成本，降低污泥中有机物含量和热值，并增加最终的污泥质量，而部分有机絮凝剂的添加则会带来潜在的二次污染风险^[6].

生物法强化污泥脱水是近年来发展起来的一种污泥调理方法，其主要原理是通过微生物自身或微生物的代谢产物来改善污泥的脱水性能^[7]，与添加各种絮凝剂的化学法相比，生物法具有效率高、 二次污染小等特点^[8]. 其中，由于良好的改善污泥脱水性能的效果，应用丝状真菌处理剩余污泥的方法已经引起了一些学者的关注^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}. 例如，Mannan等^[14]的研究表明，丝状真菌Penicillium corylophilum(WWZP1003)和Aspergillus niger (SCahmA103)分别处理灭菌的剩余污泥(含固率为0.5%~1%)2 d后，污泥的比阻从未处理时的1.36×10¹² m ·kg^-1 降至0.093×10¹² m ·kg^-1和0.13×10¹² m ·kg^-1，分别减少93.20%和90.10%； Subramanian 等^[15,16]从污泥中分离到1株丝状真菌Penicillium expansum BS30，研究发现用此菌株处理含固率为1%的剩余污泥，可使污泥的毛细吸水时间 (CST) 从80~245 s降至12.6~16 s，使污泥的脱水性能得到显著改善. 但目前所分离到的丝状真菌通常只能处理含固率低于1%的污泥，同时处理污泥时需先将污泥进行灭菌预处理并添加外源碳源，极大地提高了处理成本^{[8, 9, 10, 11]}. 因此，本研究尝试从污泥中分离丝状真菌，并在污泥不灭菌和不添加外源碳源的情况下处理高含固率污泥，从而阐明此类丝状真菌改善污泥脱水性能的基本机制及影响因素，以期为生物法强化污泥脱水技术的发展提供参考依据. 1 材料与方法 1.1 供试污泥

供试污泥取自江苏省无锡市太湖新城污水处理厂的污泥浓缩池. 采集后立即测定污泥pH、 含固率、 有机质含量、 污泥比阻、 Zeta电位和污泥体积指数. 污泥基本理化性质如下：pH 7.43，含固率3.7%，有机质含量46.5%，污泥比阻1.71×10¹³ m ·kg^-1，Zeta电位-31.8 mV，污泥体积指数(SVI)为34.6 mL ·g^-1. 采集的污泥保存于4℃冰箱中待用. 1.2 培养基

马丁氏固体培养基：磷酸二氢钾1.0 g，七水合硫酸镁0.5 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g和琼脂15~20 g. 将各成分溶解后加蒸馏水补充体积至1000 mL，115℃高压蒸汽灭菌30 min. 土豆葡萄糖液体培养基(PDA)：取去皮土豆200 g，切成小块，加蒸馏水1 000 mL煮沸30 min，用8层纱布过滤土豆汁，滤去土豆块，加蒸馏水补充滤液体积至1 000 mL，加葡萄糖20 g，115℃高压蒸汽灭菌30 min. 1.3 丝状真菌的分离筛选

采得污泥立即进行微生物分离. 将部分浓缩污泥置于28℃，180 r ·min^-1摇床中培养12 h，之后梯度稀释至10^-3、 10^-4和10^-5，再分别涂布到马丁氏平板(真菌选择性培养基)上，放置到28℃恒温培养箱中培养数天，得到多株真菌，再分别进行分离纯化，选择1株具有较好污泥脱水性能的真菌作为本试验所用真菌菌株.

分子生物学鉴定：采用OMG公司产生的真菌DNA试剂盒快速提取该真菌的基因组DNA，并进行PCR扩增18S rDNA-ITS序列，引物采用真菌ITS序列扩增通用引物ITS1-Forward (5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′)和ITS4-Reverse (5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′). PCR反应体系为：反应液总体积为20 μL，含有10×Ex Taq buffer 2.0 μL，dNTP Mix (2.5 mmol ·L^-1) 1.6 μL，5p Primer 1 0.8 μL，5p Primer 2 0.8 μL，Template 0.5 μL，5u Ex Taq 0.2 μL，超纯水14.1 μL. PCR反应条件为：95℃预变性5 min，24个循环(95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s)，最终72℃延伸10 min. PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序. 之后将18S rDNA测序结果提交到NCBI数据库进行BLAST比对，找到典型的菌株系列用Clustal X2.0软件进行同源性比较，并采用Mega 4.0软件构建系统发育树，确定该菌株的分类地位.

孢子悬液的配置：在无菌环境下，加数毫升无菌水至长有真菌的平板中，用玻璃凃棒搅动使真菌孢子冲洗下来，用4层擦镜纸过滤，滤液置于离心管中，4℃保存待用，用血球计算板计数. 将孢子悬液稀释至10⁷个 ·mL^-1，取1 mL稀释后孢子悬液接种至土豆液体培养基中，置于28℃，120 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养2 d后获得菌丝悬液. 分别设置孢子接种和真菌菌丝接种2种不同的接种方式接种至污泥中，接种比例均为体积比5%，接种后体系总体积为300 mL，每个处理设置3个平行，置于28℃，180 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养，反应3 d后，每个处理取样涂布至马丁氏培养基中，根据真菌生长状况确定其最适接种方式. 1.4 丝状真菌接种量对污泥脱水性能的影响试验

将孢子悬液稀释至10⁷个 ·mL^-1，取1 mL孢子悬液接种至土豆液体培养基中，置于28℃，120 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养2 d后获得菌丝悬液. 向剩余污泥中接入此菌丝悬液，依体积比设计6个不同的接种量处理，分别为CK(不接菌)、 1%、 3%、 5%、 10%和20%，总体积为300 mL，每个处理设置3个平行，置于28℃，180 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养，每天定时取样测定污泥比阻值，以确定最适真菌接种量. 1.5 污泥含固率对污泥脱水性能的影响试验

将孢子悬液稀释至10⁷个 ·mL^-1，取1 mL稀释后孢子悬液接种至土豆液体培养基中，置于28℃，120 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养2 d后获得菌丝悬液. 将原始污泥分别稀释至含固率为0.5%、 2%和3.7%(未稀释)3个浓度梯度，然后分别向其中接入10%菌丝悬液，并分别设置不加菌丝悬液的空白处理，总体积为300 mL，每个处理设置3个平行，置于28℃，180 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养，每天定时取样测定污泥比阻，以确定真菌处理的最适污泥含固率.

在确定最适接种方式、 最适接种浓度和最适污泥含固率的基础上，进一步阐明丝状真菌促进污泥脱水性能改善的机制，试验设置接种最适量真菌和不接菌两个处理，每个处理3个平行，置于28℃，180 r ·min^-1恒温振荡摇床中培养，每天定时取样测定污泥pH、 污泥比阻、 CST、 Zeta电位、 污泥体积指数、 污泥上清液COD和污泥EPS含量. 1.6 测定方法

采用pHS-3C精密pH计(上海雷磁厂)测定污泥的pH值； Zeta电位值通过Colloidal Dynamic Zeta电位测定仪测定； 污泥的比阻(SRF)采用布氏滤斗-真空抽滤法测定^[17,18]； 污泥毛细吸水时间(CST)采用CST测定仪(TYPE 304M，英国Triton公司)测定； 污泥体积指数(SVI)：取100 mL污泥摇匀后，倒入100 mL量筒中，静止沉降30 min后，记录污泥体积V(mL)，烘干测定污泥质量m(g)，则SVI=V/m(以TSS计，mL ·g^-1)； COD采用Orion COD Thermoreactor分析仪测定.

EPS的提取与测定^[19]：将污泥在15 000 r ·min^-1，4℃下离心20 min，上清液过0.45 μm滤膜，所得滤液即为污泥总EPS，EPS含量通过TOC分析仪(SHIMADZU TOC-5000A)测定. 2 结果与讨论 2.1 丝状真菌的分离及其最适接种方式的确定

采用马丁氏培养基从污泥中筛选菌种，将获得的不同真菌进行分离纯化后，进行液体培养，然后采用液体培养液分别做真菌污泥脱水试验. 通过比较污泥在不同真菌处理下的的脱水性能，最后选定1株有最佳污泥脱水效果的真菌菌株，通过测序和同源性比较对其进行鉴定，确定该真菌为毛霉属. 该丝状真菌菌株编号为Mucor circinelloides ZG-3(下文中简称为M. circinelloides ZG-3)，进化树如图 1所示. 该菌在马丁氏培养基上菌丝为淡黄色，菌丝较长，在土豆液体培养基中培养2 d后，菌丝分散均匀，不相互缠绕成菌丝球.

图 1

Fig. 1

图 1 M. circinelloides ZG-3及其相关菌株的ITS系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree of M. circinelloides ZG-3 and related strains based on ITS sequence

分别以真菌孢子和真菌菌丝形式将此菌接种至剩余污泥中，培养3 d后，将污泥样品涂布于PDA平板上，培养后发现，以菌丝接种的真菌生长状况良好，而以孢子悬液接种的真菌则生长缓慢(图 2). 因此，菌丝接种是将M. circinelloides ZG-3接种至污泥中的最适接种方式.

图 2

Fig. 2

图 2 以真菌孢子和真菌菌丝形式接种M. circinelloides ZG-3至污泥并培养3 d后的生长情况 Fig. 2 Growth of M. circinelloides ZG-3 inoculated into sludge in the forms of fungal spores and fungal mycelia

丝状真菌接种量对污泥脱水性能的提高有重要影响，主要表现在过低的丝状真菌接种量对污泥脱水性能的提高作用不显著，而过高的丝状真菌接种量则有可能使污泥的脱水性能在处理后出现恶化^[14]. 图 3为采用不同接种量的丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理剩余污泥过程中比阻和比阻降低率的变化. 如图 3(a)所示，在不接种丝状真菌而只对污泥进行好氧培养的空白对照中，污泥的比阻值在培养的过程中先降低后升高，此结果与其他学者的研究结果一致，其原因可能是好氧培养条件下污泥中微生物胞外聚合物发生降解，从而在一定程度上改善了污泥的脱水性能^[20]. 接种1%、 3%、 5%和20%的丝状真菌的处理中污泥比阻值的变化趋势与空白对照一致，在培养的第3 d达到最低污泥比阻值，之后逐渐上升. 而接种10%丝状真菌的处理中污泥比阻值则在6 d的培养期内一直呈下降趋势，第6 d时污泥的比阻值降为5.23×10¹² m ·kg^-1.

污泥的比阻降低率可以从另一方面有效地反映污泥脱水性能的改善效果^[21]. 图 3(b)为不同菌丝体接种浓度下比阻降低率的变化. 从中可知，接种量为1%、 3%和5%的处理的比阻降低率略高于不接丝状真菌的空白对照，但明显低于接种量为10%和20%的处理. 尽管接种量为20%的处理中，比阻降低率在第5 d可达到最大的78.4%，但培养最后1 d降至57.7%. 而接种量为10%的处理中比阻降低率持续上升，并在第6 d达到最大值75.1%. 因此，对于采用丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理剩余污泥而言，采用10%的接种量可以在培养过程中有效改善污泥的脱水性能，降低污泥的比阻值.

图 3

Fig. 3

图 3 不同菌丝体浓度的M. circinelloides ZG-3处理污泥过程中污泥比阻及比阻降低率的变化 Fig. 3 Changes of sludge SRF and the reduction rate of sludge SRF during sludge treatment by M. circinelloides ZG-3 with different inoculum sizes

采用丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理不同含固率(0.5%、 2%、 3.7%)污泥过程中，污泥比阻值的变化如图 4所示. 从中可知，当污泥含固率为0.5%时，丝状真菌处理不能有效促进污泥比阻的降低，达不到改善污泥脱水性能的目的. 其原因可能与丝状真菌接种增大污泥的初始比阻值有关，因为在0 d时向含固率为0.5%的污泥中接种丝状真菌后，其比阻值达到1.313×10¹³ m ·kg^-1，是未接种的空白污泥的5倍. 在其后的培养过程中，对于含固率为0.5%和2%的两个处理，虽然接种丝状真菌的处理中污泥的比阻值明显降低，但仍未明显低于不接种丝状真菌的对照污泥的比阻. 因此，采用丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理低含固率的污泥时，对污泥脱水性能的改善效果不明显，甚至有可能使污泥脱水性能恶化. 而采用M. circinelloides ZG-3对3.7%的原始剩余污泥进行处理时，污泥的脱水性能则可以得到大幅度的改善. 如图 4所示，在0 d时向3.7%的污泥中接种丝状真菌后，污泥的比阻值为2.87×10¹² m ·kg^-1，明显低于未接种的空白对照. 其后，随着反应的进行，污泥的比阻值进一步降低，在处理3 d时降为最低，仅为8.4×10¹¹ m ·kg^-1，与原始剩余污泥的比阻值相比降低了74%，显示出丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理高含固率污泥时良好的效果. 因此，采用丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理污泥从而改善污泥脱水性能时，可直接对含固率为4%左右的原始污泥进行处理，而处理含固率为0.5%~2%的污泥时，则需先将污泥浓缩至4%左右，然后再进行丝状真菌处理.

图 4

Fig. 4

图 4 丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理不同含固率污泥过程中污泥比阻的变化 Fig. 4 Change of SRF of sludge with different solid content treated by the filamentous fungus M. circinelloides ZG-3

为了进一步阐明丝状真菌促进污泥脱水性能改善的机制，研究了接种10%丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理含固率为3.7%的原始剩余污泥过程中污泥pH值、 污泥Zeta电位、 污泥中微生物胞外聚合物(EPS)总量的变化，结果如图 5所示. 由图 5(a)可知，10%丝状真菌处理原始剩余污泥的过程中，污泥的pH值逐渐降低，其降低幅度大于未接种丝状真菌的对照处理，处理6 d后，污泥pH值从初始的7.09降低至4.97.其原因可能是M. circinelloides ZG-3生长过程中可以代谢污泥中的有机物从而分泌一些酸性代谢物^[22]，另一方面有研究发现污泥pH值的降低可以促进部分污泥EPS的分解，从而有助于污泥脱水性能的改善^[20]. 图 5(b)为处理过程中污泥Zeta电位的变化，从中可知，由于接入了丝状真菌M. circinelloides ZG-3，导致0 d时污泥Zeta电位值升高，但随着反应进行，处理与对照之间Zeta电位值变化无差异，两者均是逐渐上升. 根据DLVO理论，Zeta电位是反映胶体和悬浮物稳定性的重要指标，Zeta电位负值越大，说明污泥絮体间静电排斥越大，最终导致污泥絮体颗粒变小不易絮凝，使得沉降及脱水性能变差^[23]. 因此好氧培养过程中，污泥Zeta电位值的升高对于污泥脱水性能的改善应该也有一定程度的贡献，但并非是导致接种丝状真菌处理优于未接种的空白对照处理的主要原因，因为在两个处理过程中污泥Zeta电位的差异并不明显. 目前，已有大量研究表明，污泥中存在的大量污泥EPS是其脱水困难的主要原因^{[19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26]}. 本研究发现，在丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理剩余污泥的过程中，接种丝状真菌的处理和未接种的空白对照中污泥EPS总量在培养过程中都是逐步降低，培养2 d后接种丝状真菌处理中的EPS总量已经低于空白对照中EPS的总量. 结合其他学者的研究，可以推测，丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理剩余污泥过程中，污泥EPS的降解也是污泥脱水性能改善的原因之一^[20]. 因此，丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理改善污泥脱水性能的机制主要包括污泥pH值的降低和污泥中总EPS的降解.

图 5

Fig. 5

图 5 丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理污泥过程中污泥pH值、 污泥Zeta电位及污泥EPS含量的变化 Fig. 5 Changes of pH,Zeta potential and EPS content of sludge treated by the filamentous fungus M. circinelloides ZG-3

污泥上清液COD值和污泥体积指数(SVI)可以分别衡量处理后污泥上清液水质情况和污泥沉降性能. 如图 6(a)结果显示，由于加入真菌培养液，导致真菌处理前期污泥上清液中COD量远高于空白处理，但随着反应的进行，丝状真菌快速利用污泥中的有机物，培养1 d后丝状真菌处理中的污泥上清液COD值大幅降低，并在处理后期开始低于空白处理，处理5 d后，其上清液COD值仅为310 mg ·L^-1左右. 该结果与众多研究者的结果一致^{[14, 21, 28]}，显示丝状真菌处理可以达到去除污泥溶液中COD的目的. 另一方面，如图 6(b)所示，接种丝状真菌的处理污泥的SVI值在培养的第1 d由34.6 mL ·g^-1上升至37.9 mL ·g^-1，之后则保持不变，而对照组的SVI值一直稳定在35 mL ·g^-1左右，说明丝状真菌处理污泥过程中，污泥仍具有良好的沉降性能，丝状真菌处理并未导致污泥恶化，引起污泥膨胀的问题^[29].

图 6

Fig. 6

图 6 丝状真菌M. circinelloides ZG-3处理污泥过程中出水COD和污泥SVI的变化 Fig. 6 Changes of supernatant COD and sludge SVI during the treatment of sludge by M. circinelloides ZG-3

从剩余污泥中成功分离到1株可以提高污泥脱水性能的丝状真菌M. circinelloides ZG-3，该丝状真菌处理剩余污泥过程中污泥的脱水性能改善效果主要受到接种方式、 接种浓度和污泥含固率的影响，其最适接种方式为菌丝体接种，体积接种浓度为10%，最适污泥含固率约为4%. M. circinelloides ZG-3处理剩余污泥过程中，污泥脱水性能的改善主要与污泥EPS的降解和污泥pH的降低有关.