空气微生物不仅具有极其重要的生态功能，还与空气环境质量、 空气污染和人体健康密切相关^[1]. 生活污水在处理过程中由于污水流动、 溢流跌落、 搅拌或曝气可增加周边环境空气微生物浓度，进而影响污水处理厂工作人员及周边人群健康^{[2, 3, 4]}. 流行病学研究显示，污水处理环境会对长期工作生活人群产生一系列健康效应，特别是会导致污水工作者综合症(sewage workers syndrome)^{[5, 6]}.

人工湿地利用基质、 植物、 微生物的物理、 化学和生物三重协同作用净化污水，在污水处理、 污染物控制和改善环境等方面应用广泛^{[7, 8]}. 与传统污水处理工艺相比，人工湿地空气微生物对环境空气质量和人群健康的影响更应该引起足够重视^[9]. 主要表现在：①随着城市化进程加快，人工湿地距离商业居住区越来越近，随之带来的环境卫生安全问题也应引起关注. ②与传统污水处理工艺的严格封闭式管理不同，人工湿地是相对开放的生态系统，部分人工湿地还作为旅游景点. ③人工湿地污水和基质中存在一定数量的病原微生物^{[10, 11]}，使得在特殊情况下，人工湿地有可能成为周围环境病原微生物的源，并以微生物气溶胶形式传播^[12]. ④人工湿地内恒温动物和鸟类也可能成为病原微生物的源，并且存在季节性变化，有较大的不确定性. ⑤人工湿地植物叶片可以成为真菌孢子栖息和繁殖场所，使得人工湿地既是真菌孢子的汇也是周边环境的源^[13].

目前，已有部分学者采用传统培养方法对人工湿地空气微生物进行研究^{[14, 15]}，由于“可培养类”微生物仅占微生物总数的不到1%^{[16, 17]}，并且还有部分处于活的不可培养状态(viable but noncuturable，VBNC)，同时培养结果受培养基组分影响较大，导致测得的数据与实际情况有较大偏差. Biolog方法是利用微生物对碳源的利用程度来反映微生物生理活动的轮廓(community level physiological profiles，CLPPs)以及描述微生物群落功能多样性的分析方法^[18]. 该方法能够弥补传统方法的不足，较全面地表征微生物群落结构、 总体代谢活性与功能信息，已在微生物鉴定、 环境微生物群落比较、 污染物对微生物群落影响评价以及环境修复效果评价等方面得到广泛应用^{[19, 20, 21, 22]}. 本研究采用BIOLOG方法，分析人工湿地空气微生物群落碳源代谢特征以及代谢功能与环境因子的相关性，对于阐明人工湿地对环境空气质量和人群健康的影响具有重要意义.

人工湿地位于青岛市黄岛区，属自由表面流人工湿地，其东面和南面临黄海，西面为倒置A²O二级污水处理工艺区，北面为住宅区. 人工湿地由99个并联运行湿地单元组成，每个单元大小为140 m×32 m，总占地面积76.7 hm²，处理规模3×10⁴ m³ ·d^-1，污水来源为生活污水和工业废水(约1 ∶1). 湿地植物主要为芦苇，每年11月进入芦苇收割期，停止进水，次年3月开始进水.

采用SAS ISO 100空气微生物采样器分别于2013-01-05、 2013-05-01、 2013-08-10和2013-11-15采集人工湿地空气微生物样品，空气流量100 L ·min^-1，采样时间30 min，采样高度距地面1.5 m. 每次采样设定两个采样点，相距约10 m，采样点在人工湿地中的具体位置见文献^[14]. 采样期间同时利用TASI-620数字式温、 湿度计测定采样环境温度和湿度，利用TASI-641风速仪测定风速. 表 1为采样期间环境因子情况.

表 1(Table 1)

表 1 采样期间环境因子情况 Table 1 Environmental factors during sampling period 季节 风向 风速/m·s-1 温度/℃ 湿度/% 春季 东南 1.61 15.0 62.4 夏季 东南 1.09 33.8 60.5 秋季 东南 0.92 13.5 51.7 冬季 西北 2.45 -2.5 37.7

表 1 采样期间环境因子情况Table 1 Environmental factors during sampling period

采样后取下凝胶膜，加到100 mL灭菌生理盐水中，摇床振荡10 min，待凝胶膜溶解后作为接种液接种至BIOLOG-GN板中，每孔接种量为125 μL，将BIOLOG-GN板置于25℃恒温培养箱中培养，每隔24 h于BIOLOG读数器上读取数据，波长590 nm，整个培养过程共持续10 d.

平均光密度值(average well color development,AWCD)计算方法^[23]：

AWCD=∑(C-R)/n

平均光密度值(AWCD)反映了空气微生物利用单一碳源的能力，是空气微生物活性及群落功能多样性的重要指标，能够从代谢水平上揭示空气微生物群落功能多样性. 人工湿地不同季节AWCD值均随培养时间延长而增大，其中，夏季AWCD值24 h进入指数增长期，72 h后达到稳定期，其后数值维持在1.2左右； 春季AWCD值48 h内变化很小，之后进入对数增长期，192 h后达到稳定期，数值与夏季基本相同； 秋季和冬季AWCD值明显低于春季和夏季，并且随培养时间延长上升缓慢，稳定时AWCD值分别为0.172和0.063(图 1). 方差分析表明，人工湿地春季和夏季空气微生物碳源代谢强度与秋季和冬季存在显著性差异(P＜0.01).

图 1

Fig. 1

图 1 人工湿地不同季节空气微生物AWCD变化Fig. 1 AWCD changes of airborne microbes in different seasons of constructed wetlands

BIOLOG-GN板中95种碳源可根据碳源官能团划分为6类，其中糖类(carbohydrates)30种、 羧酸类(carboxylic acids)24种、 氨基酸类(amino acids)20种、 胺/氨类(amines/amides)6种、 聚合物类(polymers)5种、 其他(miscellaneous)10种. 从图 2可以看出，人工湿地不同季节空气微生物对碳源利用水平不同，夏季空气微生物对6类碳源的利用水平明显高于其他季节(P＜0.05)，春季次之，而秋季和冬季均较低. 同一季节对不同碳源的利用也存在差异，夏季对糖类代谢水平最高，平均吸光值为1.614，对胺/氨类代谢水平最低，平均吸光值0.494； 春季对羧酸类碳源代谢水平最高，平均吸光 值0.522，对聚合物类碳源代谢水平最低，平均吸光 值0.076； 秋、 冬季对各类碳源代谢水平均较低，代谢水平最高的碳源分别为聚合物、 羧酸类(图 2).

图 2

Fig. 2

图 2 人工湿地不同季节空气微生物群落对碳源利用情况Fig. 2 Relative utilization ratios of carbon sources in BIOLOG plate by airborne microbes in different seasons of constructed wetlands

群落多样性指数可用来表征空气微生物利用碳源的程度，采用Shannon指数、 Simpson指数和McIntosh指数分析人工湿地不同季节空气微生物群落多样性，其中，Shannon指数反映了微生物群落物种种数及种间个体分配的均匀性； Simpson指数反映了群落中最常见的物种，是评估微生物群落优势度的指标； McIntosh指数则是度量群落物种均一度的指标. 可以看出，不同季节Simpson指数基本相同，Shannon指数冬季略高(4.32)，春季(4.02)和夏季(3.97)基本相同，秋季较低(2.77)，McIntosh指数随季节变化较大，夏季明显高于其他季节(表 2).

表 2(Table 2)

表 2 人工湿地不同季节空气微生物群落多样性指数Table 2 Diversity index of airborne microbial community in different seasons of constructed wetlands 多样性指数 春季 夏季 秋季 冬季 Shannon指数(H′) 4.02±0.037 2 3.97±0.038 9 2.77±0.063 2 4.32±0.025 0 McIntosh指数(U) 0.80±0.022 2 9.56±1.421 6 1.19±0.060 3 0.69±0.006 2 Simpson指数(D) 0.93±0.000 9 0.98±0.000 3 0.92±0.003 5 0.98±0.000 2

表 2 人工湿地不同季节空气微生物群落多样性指数Table 2 Diversity index of airborne microbial community in different seasons of constructed wetlands

利用主成分分析法对人工湿地不同季节空气微生物群落代谢功能进行分析，共提取2个主成分，其中，主成分1(PC1)方差贡献率72.5%，主成分2(PC2)方差贡献率23.1%，累计方差贡献率95.6%，可以表征不同季节空气微生物群落代谢能力. 主成分分析中的因子荷载可反映不同季节空气微生物碳源代谢差异，绝对值越大表明该基质的影响越大. 分析发现，在PC1上载荷大于0.9的基质有53种，主要是糖类和胺类； 在PC2上载荷大于0.9的基质有7种，主要是氨基酸和羧酸类(图 3)，因此，不同季节人工湿地空气微生物群落代谢功能差异主要体现在主成分1的高荷载基质上.

图 3

Fig. 3

图 3 人工湿地空气微生物碳源代谢特征主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of community metabolism of constructed wetlands

人工湿地不同季节空气微生物群落碳源代谢分析结果显示(图 4)，秋季和冬季空气微生物碳源代谢特征较相似，但与春季和夏季存在较大差异，其中，夏季与春季、 秋季和冬季空气微生物群落碳源利用谱在PC1上容易区分，考察成分载荷矩阵可知，胺类在PC1上载荷较大，在PC2上载荷较小，是区分人工湿地夏季与春季、 秋季和冬季空气微生物群落碳源代谢差异的主要碳源类型. 春季与秋季、 冬季空气微生物群落碳源利用谱在PC2上容易区分，考察成分载荷矩阵可知，羧酸类在PC2上载荷较大，在PC1上载荷较小，是区分人工湿地春季与秋季、 冬季空气微生物群落碳源代谢差异的主要碳源类型.

图 4

Fig. 4

图 4 人工湿地不同季节两因子得分变量散点图Fig. 4 Scatter of two factor score variables of constructed wetland in different seasons

许多非生物因素(温度、 湿度、 海拔、 风速、 风向等)可以影响人工湿地空气微生物群落碳源代谢强度和利用能力^{[26, 27, 28]}. CCA典范对应分析能够从统计学角度分析环境因子和空气微生物群落碳源代谢相关性，揭示不同环境条件下微生物群落结构变化原因. 人工湿地不同季节碳源代谢与环境因子相关性存在差异，其中，春季与湿度、 风速等呈正相关，受风速影响相对较大，与温度呈负相关； 夏季与温度、 湿度呈正相关，与风速呈负相关，但总体受三者影响相对较小； 秋、 冬季与温度、 湿度呈负相关，受风速影响较小，秋季受湿度影响大于冬季(图 5).

图 5

Fig. 5

图 5 人工湿地不同季节碳源代谢强度与环境因子CCA分析排序Fig. 5 A two-dimensional graph analysis of CCA coordination for AWCD and environment factors in different reasons of constructed wetlands

存在于大气中的微生物除受采样区域人为活动、 土壤状况、 污水水质和植被影响外，还受大气温度、 湿度、 紫外线、 风速、 风向和降水等气象参数的影响^{[13, 29, 30, 31, 32, 33]}. 研究表明，温度是决定不同环境空气微生物群落结构的最主要因素^{[34, 35, 36, 37]}，但也有学者认为空气微生物群落时间和空间变化是由气象因素、 颗粒物化学组成、 颗粒物主要源等多种因素作用的结果，而不仅仅是温度作用^{[36, 37]}. 在大陆和温带地区温暖季节，植物是空气细菌的重要来源，寒冷季节空气细菌主要来源于土壤，沿海区域则来源于海洋的种类较丰富^{[38, 39]}. 生活污水也是空气微生物的重要来源，研究发现，污水中细菌含量越大，其上空微生物气溶胶的数量越高^[4].

本研究地点位于海滨区域，污水、 基质、 植被、 鸟类与恒温动物、 海洋以及气象因子等都可对空气微生物群落结构产生影响^{[40, 41]}，其空气微生物来源更为复杂且存在明显的季节变化. 春季和夏季人工湿地均处于布水季节，湿度较高，碳源代谢强度明显大于秋季和冬季. 于淼等^[14]研究发现，人工湿地进水前(3~4月)空气细菌和空气真菌数量较低，进水后(5~8月)逐渐升高，之后又出现下降趋势(9月)，与本研究结果吻合. 尽管春季和夏季空气微生物AWCD值在稳定期基本相同，但进一步比较碳源代谢优势群落和群落多样性发现，二者存在较大差异，分析可能与采样期间温度、 风速和植被等方面的差异有关. 夏季温度、 湿度有利于空气微生物生长繁殖，湿地中芦苇高度在2.5~3.0 m，能够阻碍空气微生物传播，使得人工湿地空气微生物受外部因素影响较小，空气微生物主要来源于湿地本身(基质、 污水和植物叶片)，群落结构相对简单均一. 与夏季相比，春季人工湿地温度低，芦苇刚开始生长(高度＜ 0.5 m)，周围环境较为开阔，加上采样期间风速较大，有利于空气微生物扩散，增加了人工湿地空气微生物来源，群落均一度指数较低.

秋季和冬季人工湿地空气微生物碳源代谢特征较相似，但与春季和夏季存在较大差异. 秋季和冬季人工湿地分别处于芦苇待割期和土地裸露状态，环境温度、 湿度低，不利于微生物生长. 研究表明，高辐射、 寡营养及干燥环境使得一些生长缓慢、 产孢子和芽孢的类群(如放线菌和芽孢杆菌)占优势，导致碳源利用能力降低^[42]，而BIOLOG方法对生长缓慢、 不能很好利用BIOLOG板中碳源的微生物反映能力较差^[43]. 秋季芦苇长势茂盛，能够形成阻挡作用，同时人工湿地处于停止布水状态，限制了空气微生物来源； 与秋季相比，冬季人工湿地周围环境开阔，有利于空气微生物传播和扩散，采样期间风从城区方向吹来，增加了人工湿地空气微生物来源. 从群落多样性指数看，秋季Shannon指数小于冬季，但McIntosh指数较冬季大，说明秋季空气微生物群落结构较冬季简单均一. 另外，尽管春季和秋季采样期间温度情况相似，但两个季节碳源代谢强度、 Shannon指数、 碳源利用水平和主成分分析结果都存在较大差异，说明除温度外，植被、 湿度、 风速等因素在空气微生物群落结构中也发挥重要作用. 另外，本污水处理系统二级处理工艺区位于人工湿地西侧(1 km)，当风向为西和西南时，可能会对湿地空气微生物群落结构产生影响，但在本研究期间风向为东南和西北，其对人工湿地空气群落结构产生的影响较小.

(1)不同季节人工湿地空气微生物AWCD值、 优势群落及McIntosh指数均存在差异，春季和夏季空气微生物碳源代谢强度明显高于秋季和冬季，夏季空气微生物对6类化合物的利用水平高于其他季节.

(2)秋季和冬季空气微生物碳源代谢特征相似，但与春季和夏季差别较大，胺类是区分人工湿地夏季与春季、 秋季、 冬季的主要碳源类型，羧酸类是区分春季与秋季、 冬季空气微生物代谢差异的主要碳源类型.

(3)不同季节人工湿地空气微生物群落结构主导影响因子存在差异.