人工纳米颗粒(ENPs)是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1～100 nm)的人工材料^[1]，已被广泛地应用于电子工业、 生物医药、 化妆品、 环境修复及材料科学等不同领域^[2]. 通过人类活动进入大气的ENPs可随大气环流进行迁移扩散，并可随着大气沉降等活动沉降至地面或水面进行交换；进入土壤的ENPs，则在土壤中通过地表/地下径流等途径迁移扩散/渗透进入水体，或通过吸收和积累等途径进入陆生生物体内^[3]. 因此，水体是ENPs的主要最终归宿(图 1)，其在水体中的行为和生物安全性也引起了人们的极大讨论与关注.

浮游植物是水体中重要的初级生产者，其光合作用占据全球的二分之一^[4]，因此，浮游植物的生长状况对更高营养级的生物、 水生态系统，乃至全球地化循环都有着至关重要的作用. 越来越多的研究表明，ENPs能直接或间接对浮游植物的生长、 生理及基因各个水平产生重要影响.

图 1

Fig. 1

①浸出; ②自聚集; ③异聚集; ④沉积; ⑤溶解; ⑥与NOM作用 图 1 ENPs的迁移途径及其行为 Fig. 1 Transport pathways and behavior of ENPs

ENPs进入水体后，呈胶体悬浮或聚集成更大的颗粒^[5]，其行为部分遵循传统的力学理论，如Smoluchovskys方程和DLVO(Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek)胶体稳定理论^[6]. 但是利用DLVO的胶体稳定理论只能半定量地解释纳米材料的聚集和沉积现象，Petosa等^[7]的综述预示了非胶体稳定行为(non-DLVO behavior)在自然环境中广泛存在的可能性. ENPs在水体中除了受到物理因子(如温度、 离子强度、 粒径和浓度等)的影响，同时也受其它因素，如ENPs本身的表面性质、 环境中天然有机物(natural organic matter，NOM)以及与其他污染物相互作用的影响. 因此，ENPs在水环境中的行为规律较为复杂，主要包括 浸出(leaching)、 自聚集(homoaggregation)、 异聚集(heteroaggregation)、 沉积(deposition)、 溶解(dissolution)和与NOM的相互作用等(图 1). 1.1 浸出

排入土壤的ENPs在微生物的分解作用和其它外界条件下，会以聚集物或颗粒的形式随雨水冲刷、 离子浓度骤降、 氧化还原点位变化或是离子吸附等过程从土壤或底泥浸出到孔隙水中^[8]，最终随径流进入水体. Henderson等^[9]发现，淹水条件下，土壤中的胶体-纳米颗粒结合态的磷更倾向于被释放到水体中. 1.2 自聚集

根据DLVO胶体稳定理论预测，水体中ENPs最终会相互碰撞并聚集，这个过程称为自聚集. 自聚集速率随静电能障的增加而减小，因此不同的pH和离子强度可以通过影响静电能障而改变自聚集的速率. Cornelis等^[8]在其综述中通过模拟纳米TiO₂自聚集速率随不同pH和离子强度的变化，发现当环境的pH越接近ENPs的零电点，离子强度越接近电解质的临界凝聚浓度，纳米TiO₂自聚集的速率越快. 天然地表水的pH一般在6~9之间，因此当ENPs的等电点在6~9之间时，颗粒之间就容易因自聚集而沉降^[3]. 1.3 异聚集

异聚集是指ENPs与环境中其它物质或是其它种类的ENPs发生聚集的现象，发生的频率要显著高于自聚集^[8]. Unrine等^[10]的研究发现，自然环境中异聚集比自聚集更容易发生，且多数是和有机物质发生. 纳米金属颗粒往往通过改变覆盖在表面的无机物 或有机物(如柠檬酸盐、 半胱氨酸)或表面活性剂，控制纳米颗粒表面的结构和状态，从而改变纳米颗粒的聚集程度^[11]. 例如，PVP覆盖的Ag纳米颗粒 比阿拉伯胶覆盖的Ag纳米颗粒更易产生异聚集^[10]. 1.4 沉积

ENPs通过布朗运动或直接捕获粘附于其它物质表面或由于重力而沉降的过程，称为沉积. 当ENPs聚集物的粒径大于1μm时，较容易发生重力沉降^[12]. 粘附过程则类似于一个小颗粒与另一个粒径比其大得多的颗粒发生异聚集的过程. 沉积和聚集是两个联系紧密的过程，因此纳米颗粒的沉积也受到粒径、 浓度、 水体性质、 流速及表面性质等因素的影响. Chen等^[13]通过动态光散射和石英晶体微天平观测不同电解质浓度下富勒烯(C₆₀)的沉积速率，发现C₆₀的沉积速率随电解质浓度的增加而增加，但当电解质浓度接近或超过临界凝聚浓度时，沉积速率骤降. 1.5 溶解

除聚集、 沉积等现象，ENPs进入水体后还会溶解. 一方面，ENPs的溶解会降低颗粒本身在环境中的持久性和长期的生物可利用性^[14]; 另一方面，ENPs的 溶解释放到环境中的有毒离子，可能对生物产生毒性风险^[15]. 溶解的速率和程度同样受到许多因素的影响，如温度、 压强、 pH、 ENPs的大小、 可溶性以及环境中其它物质(如NOM、 金属离子螯合剂等)的存在等^[16]. Zhang等^[17]通过研究3种不同粒径的纳米Ag在不同浓度下的离子释放动力学变化，发现粒径越小，初始浓度越高的纳米Ag溶解速率越快，并且程度越高. 1.6 与NOM的相互作用

NOM普遍存在于水生生态系统中，一方面，NOM可以通过在ENPs表面包裹负电荷和空间排斥作用，增加纳米颗粒的稳定性; 另一方面，NOM还可能通过一些其它的机制，如桥连作用(bridging)^[18]和“珍珠串联”方式(pearls-on-a-string formation)^[19]来降低纳米颗粒的稳定性. 此外，NOM中 存在大量金属离子配位点，能与ENPs释放的金属离子配位，减少金属离子在环境中的积累，从而间接地改变纳米颗粒对生物的影响^[20].

越来越多的学者认为NOM可能是降低ENPs毒性的重要机制之一，尤其在营养条件受到限制的条件下^[21]. 例如，富里酸在淡水中能降低纳米二氧化钛对生物的毒性^[22]; 藻类在ENPs存在的条件下会增加胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)的分泌，可能通过吸附ENPs释放的有毒金属离子以减少其毒性作用^{[21, 23]}.

2 ENPs对浮游植物的生物效应 2.1 ENPs进入浮游植物细胞的途径

细胞壁是ENPs与浮游植物接触的第一场所，也是防止ENPs进入细胞内部的第一道屏障. 高等植物和浮游植物的细胞壁都是由纤维素构成，比较特别的是浮游植物的细胞壁还有糖蛋白和多糖，而硅藻的细胞壁还含有水合二氧化硅. 植物 细胞壁上存在直径不等的孔径(一般<10 nm)^[24]，因此理论上只能允许直径小于细胞壁孔径的ENPs或ENPs聚合物进入^[25]. 但越来越多的研究表明ENPs穿透细胞壁的能力主要依赖其表面性质，ENPs甚至能穿透孔径小于其直径的细胞壁^[26]. Chen等^[27]发现亲水性富勒烯[C₆₀(OH)₂₀，直径≤24 nm]能穿过洋葱细胞的细胞壁并进入细胞质，而疏水性富勒烯(C₇₀，直径为18.2~100 nm)只能悬浮在细胞壁和细胞膜之间的有机聚合物中，因此也有理由推断ENPs的表面性质对其进入浮游植物细胞也有着重要影响. 在某些特殊时期，如细胞复制时，细胞壁的通透性会发生变化，新合成的胞壁渗透性增加^[28]. 此外，当细胞与ENPs相互作用时，ENPs会诱导细胞壁产生直径更大的孔隙，从而影响进入细胞的ENPs的大小^[25]. 一般地，对于没有细胞壁的细胞，粒径范围在20~50 nm的吸收速率最快，并且表面带正电的颗粒被吸收的效率更高^[29]. 有意思的是，在Rhder等^[30]的实验中，发现有细胞壁和无细胞壁的Chlamydomonas reinhardtii对纳米CeO₂颗粒的敏感度并无明显差异，意味着细胞壁在藻类对纳米颗粒的防御上可能起着相对次要的作用.

如图 2所示，ENPs一旦穿过细胞壁，ENPs将与细胞膜相互作用: ①当ENPs粒径足够小，就可能直接通过细胞膜进入细胞; ②大部分ENPs通过内吞作用进入细胞，其中通过网格蛋白小窝(clathrin-coated pits)或裸露小窝(uncoated pits)进入细胞的ENPs将被转移到溶酶体中，而随小窝(caveolae)进入细胞的ENPs则会转移到内质网、 高尔基体上，或是发生转胞吞作用(transcytosis)而避免被降解^{[31, 32]}，也有的ENPs通过大胞饮(macropinocytosis)进入细胞，而较大的颗粒/聚集物(直径>0.5 μm)则可通过吞噬作用进入细胞(phagocytosis)^[29]; ③此外，ENPs还可能通过镶嵌蛋白载体和离子通道通过细胞膜^[25]; ④或损伤细胞膜的完整性，多项研究发现，纳米颗粒与细菌细胞膜的接触可能改变膜的孔隙度，从而促进ENPs进入细胞^{[33, 34]}，类似的机制可能也存在于浮游植物细胞中. Wang等^[24]利用量子点良好的发光性质，证实了量子点CdTe(粒径范围 88.9 nm±13.1 nm) 确实进入Ochromonas danica细胞内部并聚集，并通过6种抑制剂证明了大胞饮是CdTe进入该细胞的主要途径，但在该实验中并未发现明显的毒性作用. ENPs进入到细胞内部，就可能与多种细胞器结合，干扰代谢过程而造成更严重的细胞损伤.

图 2

Fig. 2

①细胞壁直接进入; ②内吞作用; ③载体蛋白和离子通道; 修改自文献[31] 图 2 ENPs进入浮游植物的途径及对浮游 植物的直接和间接致毒机制 Fig. 2 Pathways of ENPs entering the phytoplankton and the direct and indirect toxication mechanisms

绝大多数ENPs都会对浮游植物的生长造成明显影响，影响程度随浮游植物种类、 ENPs种类、 粒径、 表面性质以及剂量发生变化. 在Sadiq等^[35]用纳米Al₂O₃(<50 nm)同时对Scenedesmus sp. 和Chlorella sp.进行胁迫，结果显示它们72 h EC₅₀分别是39.35 mg ·L^-1和45.4 mg ·L^-1; 相比之下，粒径更大的Al₂O₃颗粒(<5 μm)的毒性效应则更小(72 h EC₅₀分别是100.4 mg ·L^-1和110.2 mg ·L^-1)，类似的结论在Clément等^[36]的研究中也得到验证. 对于不同种的ENPs，Miller等^[37]分别用纳米TiO₂和纳米ZnO同时对Dunaliella tertiolecta、 Isochrysis galbana、 Skeletonema marinoi和Thalassiosira pseudonana进行毒性实验，发现纳米TiO₂对这4种藻的生长几乎没有影响，而纳米ZnO则会明显抑制它们的生长. Castro-Bugallo等^[38]分别用纳米ZnO和纳米Y₂O₃对3种海洋浮游植物进行胁迫，发现对于细胞较小的藻类(Phaeodactylum tricornutum和Tetraselmis suecica)，分裂速率较快而单个细胞的生物量降低(减少约40%)，而细胞较大的Alexandrium minutum则更倾向于降低分裂速率而使生物量不受影响甚至增加，且纳米ZnO的毒性效应相对要强于纳米Y₂O₃. Van Hoecke等^[39]还发现表面被聚乙二醇化的纳米Au对Pseudokirchneriella subcapitata的毒性要小于表面被两亲性分子包被的纳米Au. 此外，当纳米TiO₂的浓度比较低时，还可能对藻类的生产出现促进作用^[36](表 1).

表 1(Table 1)

表 1 ENPs对浮游植物的毒性效应 1) Table 1 Toxic effects of ENPs on phytoplankton 纳米材料 ENPs直径/nm 测试藻种 EC50/mg ·L-1 毒性效应 抑制生长 抑制光合 细胞结构受损 氧化应激反应 TiO2[36, 37, 40, 41, 42, 43] 5~10 Gymnodinium breve 9.7* √ — — √ 10 Anabaena variabilis — — — √ √ 15 Phaeodactylum tricornutum 10.91* √ — — — 15~20 Dunaliella tertiolecta — × — — — Isochrysis galbana — × — — — Skeletonema marinoi — × — — — Thalassiosira pseudonana — × — — — 21 Pseudokirchneriella subcapitata 2.53* √ — — — 21 Chlamydomonas reinhartii — — — — √ 25 Phaeodactylum tricornutum 11.30* √ — — — 32 Phaeodactylum tricornutum 14.30* √ — — — ZnO[37, 38, 41, 44] 20~30 Dunaliella tertiolecta — √ — — — Isochrysis galbana — √ — — — Skeletonema marinoi — √ — — — Thalassiosira pseudonana — √ — — — 25 Phaeodactylum tricornutum — √ √ — √ Tetraselmis suecica — × √ — √ Alexandrium minutum — √ √ — √ <100 Pseudokirchneriella subcapitata <0.05* √ — √ — 100 Dunaliella tertiolecta 1.94 ** √ — — — Al2O[35]3 ＜50 Scenedesmus sp. 39.35* √ √ — — Chlorella sp. 45.40* √ √ — — NiO[45] 20 Chlorella vulgaris 32.28* √ — √ — SiO2[46] 10~20 Scenedesmus obliquus 388.1* √ √ — — CeO2[30] 25 Chlamydomonas reinhartii — — √ — × Y2O3[38] 30~50 Phaeodactylum tricornutum — √ √ — × Tetraselmis suecica — √ √ — √ Alexandrium minutum — √ √ — √ Ag[47, 48] 20~50 Microcystis aeruginosa — √ — — — 50 Chlorella vulgaris — √ √ — √ Dunaliella tertiolecta — √ √ — √ Au[39] 4~5 Pseudokirchneriella subcapitata 1.2~7.5* √ — — — 碳纳米管[49] <200 Chlorella vulgaris 1.8 ** √ × — — Pseudokirchneriella subcapitata 20 ** √ × — — 量子点[21, 42, 50] 3.5~4.5 Chlamydomonas reinhartii — — — — √ 11.69 Chlamydomonas sp. — — √ — — 23 Thalassiosira pseudonana — × — — — 1)√表示存在，×表示不存在，—表示文献中未测定; *表示暴露时间为72 h，**表示暴露时间为96 h

表 1 ENPs对浮游植物的毒性效应 1) Table 1 Toxic effects of ENPs on phytoplankton

ENPs穿透细胞壁和细胞膜，通过图 2所示途径 进入细胞后，直接对浮游植物的光合作用产生影响. 许多研究表明，不论是纳米氧化金属(如Al₂O₃和SiO₂)还是纳米金属(如Ag)，都会引起藻叶绿素含量的减少^{[35, 46, 47]}. Lin等^[50]通过测定CO₂的消耗量与O₂的生成量，发现量子点CdSe/ZnS对Chlamydomonas sp. 的光合作用产生明显的抑制作用，当量子点浓度达到5 mg ·L^-1时，氧气的生成率几近于零. Schwab等^[49]用碳纳米管对Chlorella vulgaris和P. subcapitata进行毒性实验时，则发现碳纳米管对受试藻类的光合作用几乎没有影响(表 1). 2.3 ENPs对浮游植物的间接毒性效应 2.3.1 物理抑制

以遮蔽效应为例，大量ENPs吸附于浮游植物细胞表面，将减少浮游植物可获得的光能，从而抑制其光合作用活性及生长. Schwab等^[49]用碳纳米管对C. vulgaris和P. subcapitata进行胁迫，发现藻类生长的抑制程度与碳纳米管的遮蔽程度呈正相关. 不仅如此，大量ENPs附着在精细胞表面还将降低海藻的受精成功率，阻碍营养物质的吸收^[25]. 2.3.2 释放有毒的金属离子

纳米金属/金属氧化物主要通过3种途径释放有毒离子: 以游离状态溶解在培养基中，附着在细胞表面缓慢释放，以及直接进入细胞在胞内释放^[51]. ENPs对浮游植物的毒性效应是否来自溶出金属离子目前仍存在争议，He等^[52]和Miao等^[23]分别用纳米Ag对Chattonella marina和Thalassiosira weissflogii进行研究，发现纳米Ag对藻类的生长和生存能力的影响主要来自溶出的Ag⁺; Franklin等^[53]也将纳米ZnO对Selenastrum capricornutum的毒性主要归结于溶解产生的Zn²⁺. 然而，也有实验表明，当纳米ZnO的浓度大于50 mg ·L^-1时，纳米ZnO的毒性大于Zn^2+[54]. Manzo等^[44]用不同粒径的ZnO颗粒(直径分别为100 nm和200 nm)和Zn²⁺对D. tertiolecta进行胁迫，发现纳米ZnO颗粒对藻类生长产生明显抑制，但这种抑制并不完全归结于释放的Zn²⁺的影响. 就目前而言，缺乏更为直接有效的证据证明这些纳米颗粒的毒性是否完全归结于金属离子的释放^{[44, 55]}. 2.3.3 产生活性氧类(reactive oxygen species，ROS)造成氧化损伤

这是目前被广泛认可的ENPs(尤其是具有光催化性质的ENPs，如TiO₂)的致毒机制. 以TiO₂为例，足够的光能会推动电子从价带迁移到导带，形成单电子和带正电的空穴，这两者能很快地再结合，也能迁移到颗粒表面，在一定条件下，电子和空穴能分别与氧气和氢氧离子/水形成超氧化物和羟基自由基这些外源ROS^[56]. 当外源ROS进入细胞后，和质膜上的磷脂等大分子发生反应，可引起脂质过氧化反应而造成细胞膜损伤. 关于外源ROS引起浮游植物细胞膜损伤的报道较少，Cherchi等^[40]用TiO₂对Anabaena variabilis进行胁迫，发现其脂质过氧化产物丙二醛含量增加，推测其致毒机制为外源ROS的产生.

此外，ENPs还能诱导浮游植物细胞内ROS的产生和聚集^[57]，低浓度ENPs诱导产生的内源ROS能通过细胞内的抗氧化机制(如抗坏血酸盐、 维他命E、 抗氧化酶等)将其还原，消除ROS毒害. Oukarroum等^[47]发现纳米Ag会增加ROS的形成; 在基因水平上，Landa等^[58]在纳米ZnO和TiO₂对Arabidopsis thaliana的研究中发现，这两种纳米颗粒能够引起参与氧化应激反应的基因上调; 而暴露于高浓度的ENPs时，纳米颗粒将抑制抗氧化酶活性，使ROS的毒害作用明显^{[43, 59]}(表 1). 2.3.4 携带其它污染物进入细胞

在真实的环境中，多种污染物往往混合存在，ENPs和其它污染物的相互作用使得它们在环境中的行为及毒性效应更加复杂，不同材料的纳米颗粒能促进或抑制其它污染物的毒性. 含氧化涂层的ENPs较易与微量金属离子反应，而疏水的ENPs则更易与有机污染物相互作用^{[60, 61, 62]}. 研究表明，黑碳能降低敌草隆对绿藻的毒性作用^[63]，富勒烯则能降低多种化学物质对水蚤及藻类的毒性^[64]，而低浓度的纳米TiO₂会降低六价铬对Scenedesmus obliquus的毒性^[65]. 与之相反的是，C₆₀和纳米TiO₂会分别增加菲对P. subcapitata和浮游动物以及镉和砷对鲤鱼的毒性^{[64, 66, 67]}. 也有一些纳米颗粒对其它污染物的毒性无明显作用，如纳米Al₂O₃并不影响六价铬对S. obliquus的毒性^[65]. 2.4 ENPs对更高营养级生物的影响

ENPs可以通过浮游植物进入更高营养级的生物体内，并产生毒性效应. Jarvis等^[68]用在ZnO纳米颗粒中暴露7 d后的硅藻T. weissflogii喂养桡足动物Acartia tonsa，发现不仅T. weissflogii的生长受到抑制，A. tonsa的生殖力和存活率也大大降低. Gilroy等^[69]通过研究纳米Au在浮游植物Ankistrodesmus falcatus和浮游动物Daphnia magna中的行为，发现D. magna既能直接从水中摄取，也能通过吸附/吸收了纳米Au的浮游植物吸收纳米Au并富集在肠内，但在该胁迫浓度下(880 μg ·L^-1)，未对两者产生毒性效应. 而对于滤食性动物，如贝类，浮游植物在纳米颗粒的富集过程中可能起到比较次要的作用. Conway等^[70]分别用纳米CeO₂和经过纳米CeO₂处理的I. galbana直接和间接地对贝类Mytilus galloprovincialis进行5周喂养，发现这两种途径并未对贝类体内Ce的富集产生显著差异，且绝大多数随排泄物排出体外.

3 问题与展望

目前关于ENPs的环境效应特别是 对生物的毒性效应已经展开了较多的研究,但ENPs 进入浮游植物体内的机制以及ENPs在浮游植物体内的生物运输和转化的机制仍不甚明确. 随着纳米材料的广泛应用，纳米颗粒对水生系统以及浮游植物生理影响的研究仍将引起国际社会的热切关注. 水环境中，不同环境条件能够影响人工纳米颗粒进入水体后的理化性质以及环境行为，进而影响纳米颗粒进入水体后对水生生物尤其是初级生产者——浮游植物的毒性效应，为了更好地评价ENPs对浮游植物乃至其它水生生物潜在的健康风险和环境效应，人们有必要更深入地探索水体中控制和影响ENPs毒性的生化及物理因素. 目前有关的ENPs环境效应的研究还很多问题需要解决和开展进一步深入研究.

①绝大多数实验模拟单一物种在实验室条件控制下对ENPs的响应^{[45, 50, 53]}，而由于光照、 水流、 盐度、 温度、 离子强度以及种类繁多的污染物等因素，使得真实水体环境比实验条件要复杂得多，并且目前ENPs对水生生物的毒性研究主要为短期急性毒性研究^{[35, 41, 45]}，不能有效反映真实环境中长期低剂量暴露的情况. 因此，真实水环境中ENPs对浮游植物群落和不同营养级生物的毒性效应、 复合污染物与ENPs的相互作用机制以及其对水生生物的毒性效应是未来需要研究的一个重要方向.

②当前大多数研究集中关注在ENPs对浮游植物的生理毒理方面，例如生长速率、 光合作用和生理水平上的氧化胁迫^{[35, 36, 38]}等,较少从分子水平进行探讨，从而限制了对ENPs致毒机制的进一步理解; 因此，为了更加系统和全面地了解ENPs释放后对水生生态系统以及浮游生物的生态风险，建议进一步从分子水平上探索ENPs进入浮游植物的具体途径及其致毒机制.

③由于缺乏简单、 即时并有效技术支持，无法量化ENPs在浮游植物体内/表面附着的浓度，因而难以准确获知纳米颗粒的行为、 生物有效性及其影响，从而阻碍了人们对致毒机制(如纳米金属/金属氧化物的毒性主要来自释放的金属离子还是颗粒本身)的理解^[24]; 因此，迫切需要深化环境和生物样品中 ENPs的快速准确测定方法，推进纳米材料在大气、 土壤、 水体等环境中的转化、 运输、 降解和最终归 宿等行为，以及自然环境下纳米颗粒在食物链中的迁移转化积累、 对浮游植物的群落以及不同营养级生物的毒性效应等多方面的研究.

致谢： 感谢清华大学环境学院陈道毅教授在本文撰写过程中给予的宝贵建议.