由于化石能源资源短缺、 环境污染和气候变化等问题，可再生能源的供应问题越来越引起人们的重视^[1]. 在各种形式的可再生能源中，氢能被认为是最清洁的能源. 因为氢气燃烧之后的产物是水，对环境不会造成任何污染^[2]. 目前氢气主要从化石燃料中获得，不具有可再生性. 从长远来看，亟需一种以可再生资源为原料的制氢方式. 生物质厌氧发酵产氢由于原料来源广泛、 过程操作简单、 能耗低、 无污染，是一种理想的产氢方式，但是氢气浓度并不是很高. 如果可以利用生物质原料在产氢的过程中联产挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，则可以很好地提高其经济效益. 产氢发酵过程总是伴随着中间代谢产物的生产，中间代谢产物主要包括VFA如乙酸、 丙酸、 丁酸和有机溶剂如乙醇^{[3, 4, 5, 6]}. 厌氧发酵过程分为水解、 产酸、 产氢产乙酸和产甲烷这4个阶段，水解产酸阶段的最优条件与产甲烷阶段不一样，在最优的条件下2~3 d内就可以获得很高的酸产量，而在15~20 d的时间里才可以获得很高的甲烷产量，所以VFA的生产效率更高^[18]. 而近年来发现，VFA在催化剂的作用下加氢可以转化成混合醇燃料，例如异丙醇、 2-丁醇和3-戊醇等^[7]，是一种重要的化工中间体.

巨藻(Macrocystis pyrifera)属于褐藻门，是目前发现的体型最大的海洋藻类. 具有生长速率快和CO₂吸收率高等优点. 同时，由于其生长在海水中，不与人争粮，不与粮争田. 所以巨藻生物质作为一种能源生产的理想材料，近年来受到各国的广泛关注^[8]. 巨藻中虽然几乎不含有木质素，但是含有许多不同结构的多糖^[9]. 巨藻中的一些碳水化合物例如褐藻酸钠是不容易被微生物降解的，为了提高巨藻发酵产氢及产酸效率，必须筛选适用于巨藻发酵产氢产酸的最佳预处理条件.

目前，以海洋藻类作为原料进行生物发酵越来越受到重视. 国内外对于海带、 石莼、 紫菜、 裙带菜、 石花菜^[10,11]等发酵产氢的条件已经进行了一些研究，并且对海带、 浒苔^[12]等大型藻类发酵生产VFA的条件也有一定的报道，但是对藻类发酵联产氢气与VFA的技术工艺未见报道. 因此，本研究探讨了巨藻联产氢气与VFA的可行性，并从底物的预处理条件、 接种物底物比值、 初始pH值等几个方面进行了优化. 1 材料与方法 1.1 材料和接种物

接种物为厌氧消化污泥，取自青岛团岛污水处理厂厌氧消化工艺. 其pH值、 总固体(TS)和挥发性固体(VS)含量分别为6.90、 14.66%和59.44%. 为了抑制甲烷菌的耗氢活性,厌氧消化污泥使用前在95℃条件下处理30 min.

巨藻由黄海水产研究所提供，其TS含量为88.73%,其中VS含量为64.31%，主要成分为: 粗蛋白12.19%、 粗脂肪8.30%、 碳水化合物40.60%. 1.2 实验方法

恒温发酵装置如图 1所示，实验在300 mL的厌氧瓶中进行,其工作体积为100 mL. 每种条件下3个平行实验. 接种物TS浓度为30g ·L^-1,厌氧瓶用高纯氮气吹扫除掉厌氧瓶中残留的氧气,再用丁基橡胶塞封口,然后放到摇床上振荡发酵(37℃,180r ·min^-1). 培养基的组成为(mg ·L^-1): KH₂PO₄ 5356、 K₂HPO₄ ·3H₂O 164、 Na₂HPO₄ ·12H₂O 11867、 MgCl ₂ ·6H₂O 100、 NaHCO₃ 1000、 CaCl₂ ·2H₂O 66、 NH₄Cl 500、 蛋白胨1000、 酵母提取物600和1 mL浓缩的微量元素母液(MnSO₄ ·6H₂O 15、 FeSO₄ ·7H₂O 25、 CuSO₄ ·5H₂O 5、 CoCl₂ ·5H₂O 0.0125、 NiSO₄ 32、 ZnCl₂ 23、(NH₄)₆Mo₇O₂₄ ·4H₂O 14、 EDTA 50).

图 1

Fig. 1

1.恒温水浴摇床； 2.厌氧发酵瓶； 3.沼气发酵原料； 4.导气管； 5.水； 6.集气瓶； 7.导水管； 8.量筒 图 1 恒温发酵装置 Fig. 1 Anaerobic fermentation device with controlled and constant temperature

在比较不同的预处理方法时，以不经处理的底物为对照，底物热处理条件是在100℃下处理2.5 h^[13]，底物热碱处理的条件是用8g ·L^-1的NaOH在100℃下处理2.5 h. 在研究底物预处理碱浓度对厌氧发酵的影响时，底物分别用0、 2、 4、 8、 16g ·L^-1的氢氧化钠预处理2.5 h，温度控制在100℃，接种物底物比值(ISR)为1，初始pH值为7. 在上述最佳的预处理条件下，研究ISR对厌氧发酵的影响，ISR分别设定为1、 0.75、 0.5、 0.3、 0.2、 0.15，初始pH值为7. 在上述最佳的预处理条件下，研究初始pH值对厌氧发酵的影响，将初始pH值分别设定在4、 5、 6、 7、 8. 1.3 分析方法

产气量(P_s)的计算公式是：

P_s= H/S

式中，P_s为单位VS氢气产量(mL ·g^-1)，H为累积产氢量(mL)，S为巨藻的单位VS的初始添加量(g).

采用排水法测定气体体积，气相色谱(SP6890,山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司) 测定产生的氢气，色谱柱为2m长的不锈钢管，5A分子筛为填料，氮气作为载气. 进样口、 柱温和热导检测器(thermal conductivity detector,TCD)温度分别为80、 50和100℃. VFA和乙醇的检测: 使用美国瓦里安450GC气相色谱仪测定，色谱柱为30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱,氮气作为载气. 进样口和氢火焰检测器温度分别为220℃和240℃. 柱温采用程序升温，首先在80℃保持1 min，然后以25℃ ·min^-1速度上升到120℃，再以30℃ ·min^-1速度上升到135℃，最后以15℃ ·min^-1上升到180℃保持1 min. SCOD 的测定: 发酵液或者预处理液经过10000 r ·min^-1离心5 min后取上清. 然后用兰州连华环保科技有限公司的5B-3(B) COD 测定仪测定SCOD. TS和VS的测定参照文献^[14]. 发酵液的pH值使用精密pH计测定(Starious,德国). 2 结果与讨论 2.1 底物预处理条件对巨藻厌氧发酵的影响 2.1.1 不同的底物预处理方法的产氢结果

以不经处理的底物为对照，对热、 热NaOH处理两种方法处理后的巨藻的可溶性化学需氧量(SCOD)及累积产氢量进行了测定. 结果如图 2、 3所示. 与对照相比，热处理对巨藻的SCOD影响不大，仅提高了4.41%. 而热NaOH处理后，巨藻的SCOD浓度显著提高，达到12.59g ·L^-1，与未处理相比提高了136%. 同样，由图 3、 4所知，预处理后的巨藻累积产氢量及氢气含量有明显提高，尤其是热NaOH处理后，巨藻的产氢量及氢气含量分别提高了131%、 114%，单位VS产氢量及氢气含量分别达到了13.49 mL ·g^-1和11.14%. 同时，在所有的批次实验中，产生的气体均没有检测到CH₄，表明甲烷菌的活性受到了完全抑制. 发酵结束后TVFA浓度如图 4所示，热、 热NaOH处理均可以提高TVFA浓度，尤其是热碱处理后TVFA浓度有显著的提高. 这可能是因为巨藻中含有大量的海藻酸，其为巨藻细胞壁及细胞间基质的主要组成成分，一般以钠盐形式存在，有研究表明，其在高温条件下比常温下更容易溶解^[10]. 同时，海藻酸主要由β-D-甘露糖醛酸(M单元)与a-L-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接并由不同比例的GM、 MM和GG片段组成的共聚物，其中存在大量的醚键^[15]，而碱对破坏醚键有很好的效果，因此热碱联合处理可以大大提高有机质的溶解率. Yang等^[16]发现了热碱处理使提油后(Scenedesmus obliquus)藻渣累积产氢量提高了3倍. 李玉祥^[17]也发现了热NaOH处理不但能显著提高蓝藻的SCOD浓度，而且还能提高底物的溶解率.

图 2

Fig. 2

图 2 不同预处理方法处理后的SCOD Fig. 2 Values of SCOD after various pretreatments.

图 3

Fig. 3

图 3 不同预处理方法处理后的TVFA产率和累积产氢量 Fig. 3 Yield of TVFA and hydrogen after various pretreatments

图 4

Fig. 4

图 4 不同预处理方法处理后的TVFA浓度和氢气含量 Fig. 4 Concentration of TVFA and content of hydrogen after various pretreatments

过量的碱预处理不但会增加预处理成本，而且也会引入较高的盐度，已有文献表明，盐度会对发酵微生物产生重要的影响^[18,19]. 因此，本研究对热碱处理的浓度进行了优化. 由图 5可知累积产氢量与底物的热碱处理直接相关. 随着碱浓度的增加，累积产氢量呈现先增加后降低的趋势. 在未添加NaOH 处理时，巨藻产氢量相当低. 然而，添加NaOH 引起处理后的巨藻产氢量及氢气含量显著提高. 当NaOH浓度为4g ·L^-1时巨藻的单位VS累积产氢量达到最大值为16.67 mL ·g^-1，与未添加NaOH处理的相比提高了108%. 此后，随着 NaOH 浓度的进一步增加，累积产氢量又逐渐下降. 同时，当NaOH浓度为4g ·L^-1时，巨藻的氢气含量达到最大，为13.94%(图 6). 据报道，发酵液中高浓度的Na离子可能引起菌体裂解^[20]. 因此推测累积产氢量的下降可能是由于发酵系统中Na离子浓度过高引起的. 同时从表 1中也可以看出，溶液中SCOD随着碱浓度的增加呈现先增加后降低的趋势，这可能是因为巨藻中含有大量的海藻酸，海藻酸主要由β-D-甘露糖醛酸(M单元)与a-L-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接并由不同比例的GM、 MM和GG片段组成的共聚物，其中存在大量的醚键，而碱对破坏醚键有很好的效果^[15]，所以随着碱浓度的增加，海藻酸会不断地分解为糖醛酸，导致SCOD值的升高. Kim等^[21]和Penaud等^[22]也发现了类似的现象. 而随着溶液中碱浓度的进一步提高，当pH值大于11时，巨藻中的海藻酸钠往往会产生不溶于水的凝胶^[15]，从而又造成溶液中SCOD值的降低. 当碱处理浓度为4g ·L^-1时，溶液中SCOD及VS溶解率均达到最大值，分别为14.32g ·L^-1和37.67%. 因此4g ·L^-1的NaOH是巨藻产氢预处理的最佳碱浓度.

图 5

Fig. 5

图 5 不同浓度NaOH预处理后的TVFA产率和累积产氢量 Fig. 5 Yield of TVFA and hydrogen with various NaOH dosages

图 6

Fig. 6

图 6 不同浓度NaOH预处理后的TVFA浓度和氢气含量 Fig. 6 Concentration of TVFA and content of hydrogen with various NaOH dosages

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度NaOH预处理后的厌氧发酵VS溶解率及SCOD Table 1 SCOD and VS dissolution rates of anaerobic fermentation after pretreated with various NaOH dosages 不同的碱浓度/g ·L-1 SCOD/g ·L-1 VS溶解率/% 0 5.54±0.05 29.55±0.23 2 8.82±0.07 34.12±0.05 4 14.32±0.10 37.67±0.12 8 12.59±0.13 35.75±0.13 16 7.61±0.13 30.95±0.09

表 1 不同浓度NaOH预处理后的厌氧发酵VS溶解率及SCOD Table 1 SCOD and VS dissolution rates of anaerobic fermentation after pretreated with various NaOH dosages

不同浓度NaOH处理条件下的TVFA的变化情况如图 5、 6所示，可见，不同浓度的NaOH处理也显著影响了TVFA的产生，随着NaOH浓度的增加，TVFA产率表现为先升高后降低的趋势. 当NaOH的浓度为4g ·L^-1时，巨藻单位VS的TVFA产率最高，为0.11 g ·g^-1，其TVFA浓度也达到最大值，为2.18g ·L^-1，与未处理相比提高了122%. 据报道，海带用0.50mol ·L^-1 NaOH预处理后，TVFA浓度提高了56%^[23]. 2.2 ISR对巨藻产氢产酸的影响

ISR会直接影响产氢系统中的菌群结构、 生物活性以及菌群代谢特征，而这些因素互相作用共同决定了发酵菌群的产氢能力. 已有研究表明，在适宜的范围内，混合细菌发酵产氢的能力随着ISR的降低而增加，但是，过低的ISR不利于混合细菌发酵产氢^{[20, 24, 25]}. 本实验研究结果发现，在0.15~1的ISR范围内，随着ISR的增加，累积产氢量呈现先升高后降低的趋势，当ISR为0.3时，单位VS的累积产氢量达到最大值为30.93mL ·g^-1(图 7)，氢气含量为32.37%(表 2). 此时VS溶解率也达到最大值51.21%(表 2). 发酵结束后的TVFA组成分析如图 8所示，ISR显著影响了中间代谢产物的分布，发酵液中的中间代谢产物主要由乙酸和丁酸组成，并且随着ISR的下降，TVFA的产率也呈现先升高后降低的趋势(图 7)，但是反应体系中的TVFA浓度逐渐升高(图 8). 因此，推测可能是由于发酵液中ISR过低，导致TVFA 或者醇类浓度增加，从而抑制了氢气的生产^[25,26]. 然而，随着ISR的降低，发酵体系中乙酸浓度明显增加而丁酸浓度变化不大，说明不同代谢途径的功能菌群可能对高浓度的盐溶液耐受能力不同，从而导致不同的ISR下，优势菌群的差异，进而形成了代谢产物的变化. 万伟等^[27]的研究中也发现了类似的现象. ISR对发酵结束时pH值的影响如表 2所示，结果表明，由于发酵产酸作用，反应结束时的pH值都比初始pH值要低，而且随着ISR的降低，发酵结束时的pH值有下降的趋势. 出现这种情况的可能原因是，当ISR为1~0.15时，液相末端产物中有机酸总浓度随着ISR的降低而增加. Wang等^[28]的研究表明，过低的pH值不利于产氢细菌发酵产氢. 所以，本研究中，当ISR过低时，产生的有机酸使得发酵体系的pH值下降，从而不利于产氢细菌发酵底物产氢，导致过低的产氢量. 由图 7可知ISR在0.3~0.75时，TVFA转化率变化不大，说明底物浓度在此范围内对产酸菌的影响不大. 然而，ISR在0.3~0.5的范围内虽然TVFA产率略微上升3%，但是累积产氢量却显著地下降了40.50%，因此，巨藻发酵产氢的最佳ISR应选择为0.3.

表 2(Table 2)

表 2 不同ISR下的厌氧发酵VS溶解率、 最终pH值和氢气含量 Table 2 VS dissolution rate,final pH value and hydrogen content of anaerobic fermentation at different inoculum-substrate ratio ISR VS溶解率/% 最终pH值 氢气含量/% 0.15 40.81±0.18 5.01±0.13 39.21±3.12 0.2 48.53±0.08 5.22±0.03 38.18±1.30 0.3 51.21±0.36 5.39±0.01 32.37±0.37 0.5 46.44±0.21 5.53±0.02 17.98±0.67 0.75 43.55±0.15 5.59±0.04 15.10±0.91 1.0 37.67±0.12 5.71±0.11 13.94±0.11

表 2 不同ISR下的厌氧发酵VS溶解率、 最终pH值和氢气含量 Table 2 VS dissolution rate,final pH value and hydrogen content of anaerobic fermentation at different inoculum-substrate ratio

图 7

Fig. 7

图 7 不同ISR下的TVFA产率和累积产氢量 Fig. 7 Yield of TVFA and hydrogen at different inoculum-substrate ratio

图 8

Fig. 8

图 8 不同ISR下TVFA组分及乙醇的变化 Fig. 8 Variation of TVFA composition and ethanol concentration at various inoculum-substrate ratio

在厌氧发酵体系中，pH值的变化不仅直接影响参与新陈代谢过程的酶活性，而且能够改变反应器中优势种群的地位和数量，从而使产氢反应器中的发酵类型发生改变^[29]. 然而由于发酵基质的复杂性及产氢菌群的多样性，不同反应体系的最适pH值范围并不一致. 例如，Cai等^[30]在不添加任何接种物的情况下，发现碱处理后污泥的产氢最佳初始pH值为11; Liu等^[31]利用热处理后的接种物(富含Clostridium pasteurianum)发酵淀粉，认为产氢最佳初始pH 值在 7~8之间. 而本研究发现，巨藻在初始pH值4~6之间时，累积产氢量逐渐增加，并且在初始pH值为6时达到最大，单位VS产量为36.21mL ·g^-1，之后随着初始pH值的增加则进一步下降(图 9).

图 9

Fig. 9

图 9 不同初始pH下的TVFA产率及累积产氢量 Fig. 9 Yield of TVFA and hydrogen at various initial pH values

同时在初始pH值为6时巨藻的氢气含量和溶解率均达到最大，分别为40.22%和54.67%(表 3). 据报道，Liu等^[2]发现海带在初始pH值为6时，发酵产氢启动较快，并且氢气产量最大. 而当初始pH值低于5时，系统只产生了少量的氢气. 另外，在初始pH值为4，氢气产量最低(单位VS产量为12.53mL ·g^-1)，VS溶解率最低(35.35%)，产氢延迟时间最长(36 h). 可能是由于当初始 pH值偏离最适pH值时，引起产氢细菌不能更好地适应外界环境，菌体生长受到影响，从而导致氢气浓度下降^[32]. 该结果与刘瑞光等^[33]的研究结果类似. 同时，从表 3中可以看出，发酵结束时巨藻的最终pH值也受到初始pH值的影响. 对应不同初始pH值的最终pH值在4.72~5.53之间，并且随着初始pH值的增加而增加. 其他研究人员也观察到了类似的现象^[3,31].

表 3(Table 3)

表 3 不同初始pH值下的厌氧发酵VS溶解率、 最终pH值和氢气含量 Table 3 VS dissolution rate,final pH value and hydrogen content of anaerobic fermentation at various initial pH values 不同的初始pH VS溶解率/% 最终pH值 氢气含量/% 4 35.35±0.35 4.72±0.1 17.22±0.68 5 37.98±0.29 5.24±0.03 18.76±3.53 6 54.67±0.14 5.32±0.06 40.22±3.66 7 52.03±0.12 5.41±0.04 32.93±0.67 8 49.89±0.05 5.53±0.01 29.55±2.11

表 3 不同初始pH值下的厌氧发酵VS溶解率、 最终pH值和氢气含量 Table 3 VS dissolution rate,final pH value and hydrogen content of anaerobic fermentation at various initial pH values

研究结果还表明，不同初始 pH值对产酸过程的影响也非常显著. 在初始pH值4时，巨藻的降解程度有限，VS溶解率在 35.53% 左右(表 3)，所以氢气与 TVFA产率均很低(图 9). 随着初始 pH值从 4增加到 7，TVFA 浓度逐渐增加，然后随着初始 pH值进一步增加到 8，TVFA浓度下降，乙酸和丁酸是最主要的中间代谢产物(图 10)，其中，在初始 pH值为 4~5时，丁酸浓度明显地高于乙酸，氢气含量比较低，而在初始 pH值为 6~8时，乙酸浓度明显地高于丁酸，氢气含量也有明显的升高. 这可能是由于当 pH值为 4~5时，产丁酸菌比产乙酸菌耐受力强，发酵体系以丁酸型发酵为主，此时1 mol的C₆H₁₂O₆产生 2 mol的氢气，同时，当 pH值为 4~5时，可能不利于水解产酸菌群的繁殖，从而导致了巨藻生物质的降解率非常低(表 3)，所以氢气含量明显偏低. 而当 pH值为 6~8时，产乙酸菌比产丁酸菌耐受力强，发酵体系以乙酸型发酵为主，此时1 mol的C₆H₁₂O₆产生 4 mol的氢气，所以当 pH值为 6~8时，氢气含量明显地高于在 pH值为 4~5的环境中. 另外，在初始 pH值 6~7时，乙酸的产量逐渐增加，但是氢气的产量并没有增加，这个结果表明同型乙酸菌可能与产氢菌共同存在于巨藻的发酵过程中，有文献报道，乙酸可通过同型乙酸菌利用 CO₂和 H₂生成，而且同型乙酸菌生长的最适 pH值在中性 pH值范围内^[34]. 同样，TVFA的产率在初始 pH值 4~8时，也呈现先增加后降低的趋势，在初始 pH值 7时达到最大值. 但是，在初始 pH值 6~7范围内 TVFA产率略微上升 2%，而氢气产量下降 11%，因此，巨藻发酵联产氢气与 VFA的最佳初始 pH值应选择为6.

图 10

Fig. 10

图 10 不同初始pH下VFA的成分变化 Fig. 10 Variation of VFA composition at various initial pH values

巨藻中虽然不含有木质素，但是含有许多复杂的结构多糖，例如褐藻酸，其往往形成复杂的空间结构，导致厌氧微生物难以有效降解利用^[12]. 近期有研究表明，在用一种褐藻酸降解菌Vibrio harveyi进行好氧预处理后，海带VFA浓度提高了87.90%^[12]，说明褐藻酸的降解确实是厌氧发酵过程中的限速步骤. 本文采用热NaOH的化学预处理方法，尽管处理后SCOD大大提高，并且发酵结束后VS溶解率也达到了54.67%，但是发现溶液中仅有2.20g ·L^-1SCOD转化为VFA，仍有大量的SCOD(8.54g ·L^-1)未转化为H₂与VFA，而热处理及空白对照组发酵后溶液中未转化为H₂与VFA的SCOD分别为3.13g ·L^-1和3.51g ·L^-1，转化为VFA的SCOD分别为1.78g ·L^-1和1.28g ·L^-1. 此外，为了排除体系中氢气对发酵产生的反馈抑制，笔者在每次排水测气后将体系抽空重新曝气，发现得到的结果与上述非曝气实验基本相同，说明本研究中SCOD转化效率低的主要原因并非氢气的反馈抑制. 有报道表明，酸碱处理尽管可以增加底物SCOD的浓度，但是引入的大量离子可能会对发酵微生物的代谢产生不利影响^[20]，所以，推测本研究中的预处理引入的Na离子与Cl离子可能是影响SCOD转化效率一个重要原因，因此，选取合适的生物预处理方法或许可以进一步提高巨藻氢气与VFA的联产效率，相关研究正在进行中.

3 结论

(1)综上结果发现，通过合适的热NaOH预处理，巨藻可以通过厌氧发酵联产氢气与VFA. 用4g ·L^-1的NaOH处理巨藻时，产氢及产酸量均达到最大，单位VS产量分别为16.67 mL ·g^-1和0.11 g ·g^-1，VS溶解率达到37.67%.

(2)通过ISR对巨藻发酵产氢产酸的实验，可知在热NaOH处理浓度为4g ·L^-1的条件下，当ISR为0.3时，累积产氢量达到最大，单位VS产量为30.93 mL ·g^-1，此时VS溶解率为51.21%，TVFA浓度为8.67 g ·L^-1.

(3)最后，通过初始pH值对巨藻发酵产氢产酸的实验，可知在热NaOH处理浓度为4g ·L^-1、 ISR为0.3的条件下，当初始pH值为6时，得到最大的累积产氢量，单位VS产量为36.21 mL ·g^-1，比未处理巨藻提高了77.82%，氢气含量达到40.22%. 同时，在最佳的优化条件下，VS溶解率达到54.67%，TVFA的浓度达到了9.54g ·L^-1.

致谢： 感谢中国水产科学研究院黄海水产研究所叶乃好研究员提供的巨藻样品.