硫化物是表示水体质量的重要参数之一，其存在能够消耗水体中的氧气，导致水生生物的死亡^[1,2]. 在有机物丰富、 pH值较低的水域，硫化物极易生成具有恶臭气味的有毒气体H₂S. 一方面，H₂S是生成具有强腐蚀性物质硫酸的前驱体，对环境有很大的危害; 而且还是一种强烈的神经毒素，人体吸入不同浓度的H₂S会产生头痛、 头晕、 呕吐、 顷刻死亡等症状，严重威胁着人类的生存与发展^{[3, 4, 5]}. 但是另一方面，有研究表明，H₂S是除了一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之外的第3种气体信号分子，具有调剂免疫系统和器官功能、 保护神经细胞和维持机体氧化还原平衡等重要作用，与许多生理病理学过程密切相关^{[6, 7, 8]}. 因此，对H₂S进行快速、 灵敏、 准确的检测十分重要.

常规的检测H₂S的方法主要有电化学法^[9]、 比色法^[10]、 分光光度法^[11,12]、 色谱法^[13,14]等. 这些方法常常要对样品进行复杂的预处理和昂贵的仪器，步骤繁琐，耗时长. 而荧光分析法具有灵敏度高、 选择性好、 检测限低、 操作简单和可原位实时检测等优点，近年来在环境领域中的应用越来越得到科研工作者的关注^{[15, 16, 17, 18]}. 利用荧光探针检测各种环境污染物如Cu²⁺、 Hg²⁺、 CN^-、 F^-、 I^-等^[19,20]的研究都已多次被报道. 本研究利用H₂S具有较强的亲核性，可促使含有吸电子基团的醚键断裂的特性，设计合成了一种新型的可视化H₂S荧光探针1(图 1). 探针1可通过2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑(HBI)与4-氯-7-硝基苯并呋喃(NBD-Cl)反应所得. HBI及其衍生物可以发生激发态分子内质子转移(ESIPT)过程而形成互变异构体，从而产生发射波长长、 stokes 位移大、 荧光量子产率高的特征荧光. 此类化合物已被广泛地应用于荧光探针的设计. 但是有关H₂S荧光探针的报道还较少^{[21, 22, 23]}.

图 1

Fig. 1

图 1 探针1与H2S反应机制 Fig. 1 Detection mechanism of probe 1 for H2S

化合物的¹H NMR和¹³ C NMR谱图从Bruker 400 MHz 核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)得到; 分子的质谱从Brooker maXis 4G质谱仪得到; 使用日本Hitachi F-7000荧光分光光度计测试荧光发射光谱(狭缝宽度为2.5 cm); 用Mettler toledo pH计测试pH值.

邻苯二胺、 水杨醛、 亚硫酸氢钠、 4-氯-7-硝基-苯并呋喃、 碳酸钾，以上试剂均为分析纯，使用之前未经预处理纯化. 实验用水为MilliQ系统制备的超纯水. 1.2 实验过程

目标化合物1的合成路线见图 2.

图 2

Fig. 2

图 2 探针1的合成 Fig. 2 Synthesis of probe 1

将水杨醛(0.61 g,5 mmol)和亚硫酸氢钠(0.52 g,5 mmol)置于100 mL三口烧瓶中，加入20 mL无水乙醇溶解，室温下搅拌4 h. 然后将邻苯二胺(0.54 g,5 mmol)溶解在20 mL DMF中，滴加到上述溶液，加热回流并用TLC监测. 反应完成后,将反应物倒入冰水中，析出沉淀，抽滤，干燥，无水乙醇重结晶得到白色中间体HBI 0.788 g，产率75%. ¹H NMR(DMSO,400 MHz),δ: 13.20(s,1H),13.16(s,1H),8.06(d,J=6.8 Hz,1H),7.72(d,J=6.4 Hz,1H),7.61(d,J=6.4 Hz,1H),7.73~7.29(m,3H),7.05~7.00(m,2H); ¹³ C NMR(DMSO,100 MHz),δ: 158.0,151.7,140.8,133.1,131.7,126.2,123.3,122.4,119.1,117.9,117.2,112.6,111.5; ESI-HRMS(C₁₃H₁₀N₂ O计算值),m/z: 211.0876(211.0866) [M+H]⁺. 1.2.2 目标化化合物1的合成

将上述得到的中间体HBI 0.21 g(1 mmol)、 NBD-Cl 0.22 mg(1.1 mmol)和碳酸钾0.28 g(2 mmol)置于50 mL单口烧瓶中，加入DMF(5 mL),室温下搅拌2.5 h. 反应完毕后水洗、 干燥、 浓缩，经硅胶柱层析提纯(乙酸乙酯/石油醚=4/1)，得到黄色固体0.26 g，产率71%. ¹H NMR(DMSO-d6,400 MHz),δ: 9.91(s,1 H),8.74(d,J=8.0 Hz,1H),7.85(d,J=8.0 Hz,1H),7.64(dd,J₁=1.2 Hz,J₂=7.6 Hz,1H),7.61(d,J=7.6 Hz,1H),7.43~7.37(m,2H),7.34~7.27(m,2H),6.95(t,J=7.6 Hz,1H),6.68(d,J=8.0 Hz,1H); ¹³ C NMR(DMSO-d6,100 MHz),δ: 155.0,151.4,147.8,144.0,142.4,135.5,135.2,132.7,132.2,131.9,131.6,127.1,123.8,123.4,119.6,119.3,116.1,115.7,111.5; ESI-HRMS(C₁₉H₁₁N₅O₄计算值),m/z: 372.0698(372.0727) [M-H]^-. 1.3 实验方法 1.3.1 标准液的配制

用去离子水新鲜配制 1.0 mmol ·L^-1的硫化钠(Na₂S)标准溶液(实验中常用的H₂S供体); 用DMSO配备1.0 mmol ·L^-1的探针储备液; 干扰离子检测液(0.1 mol ·L^-1)采用该阴离子的钠盐或钾盐溶于去离子水得到; 配制磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)/DMSO(体积比1 ∶1)的测试溶液. 1.3.2 光谱测试

用移液枪准确移取适量体积Na₂S标准溶液于比色管中，用PBS/DMSO测试溶液调节体积到3.96 mL. 将0.04 mL探针储备液加入检测体系中，使探针的浓度为10 μmol ·L^-1，充分混匀，室温下放置5 min. 移取3 mL加入1 cm石英比色皿测其光谱数据. 2 结果与讨论

化合物1本身在检测体系中荧光很弱，加入Na₂S后，荧光信号大幅度增加，溶液颜色也瞬间由淡黄色变成了肉眼可见的紫色，通过肉眼即可判断溶液中是否存在H₂S. 通过三维激发-荧光发射光谱矩阵(3D-EEM)，确定探针的最佳激发/发射波长为320/460 nm. 从图 3中可以看出，在10 μmol ·L^-1的探针溶液中加入20 μmol ·L^-1Na₂S后，在360 nm和460 nm处分别出现了新的荧光发射峰. 360 nm、 460 nm是HBI的荧光发射峰. 由于HBI是一类具有激发态质子转移效应的化合物，存在烯醇式和酮式两种构型. 360 nm处是烯醇式构型分子的发射峰，460 nm是酮式构型的发射峰^[24,25]. 因为检测体系(DMSO/PBS=1/1)具有极性，HBI大部分以酮式构型存在，烯醇式构型很少，因此360 nm处的荧光发射峰很弱.

图 3

Fig. 3

图 3 室温下加入Na2S前后探针1荧光强度与颜色的变化 Fig. 3 Fluorescence and colour changes of probe 1 before and after adding Na2S at room temperature

室温下，取80 μL的Na₂S标准溶液加入比色管中，用DMSO/PBS测试溶液调节体积到3.96 mL，加入40 μL探针标准液，得到探针浓度为10 μmol ·L^-1和Na₂S浓度为20 μmol ·L^-1的溶液，测定体系荧光强度变化和时间的关系曲线. 由图 4可以看出，探针1在460 nm处的荧光强度在加入Na₂S 后增加很快，5 min之后变化很小，几乎形成了一个平台，表明反应基本完成. 探针1本身在测试的20 min之内没有明显的变化. 因此，本研究选择探针1与H₂S反应5 min之后进行测试. 与文献报道的大部分H₂S荧光探针(响应时间一般为20 min~2 h)相比，探针1能够更快速地检测H₂S. 鉴于H₂S不稳定和在生物体系中代谢迅速的特点，探针1在实时检测上具有较大的优势^[26,27].

图 4

Fig. 4

图 4 室温下加入Na2S后探针1在460 nm处荧光强度随时间的变化 Fig. 4 Time-dependent fluorescence spectra of probe 1 on reaction with Na2S at room temperature

实验中用盐酸和氢氧化钾调节溶液的pH,待pH稳定后,向该溶液中加入Na₂S，充分混匀放置5 min 后进行荧光测试. 同时以探针1的空白溶液作为对照. 图 5为加入Na₂S之前和加入Na₂S之后探针1在其最大发射波长460 nm处的荧光强度与pH在3~11之间的关系曲线. 从中可以看出，在6~9之间，探针1的荧光强度比较稳定. 加入Na₂S后，荧光强度的增加远远大于探针所引起的荧光的变化. 因此可将pH 6~9作为探针的可靠检测范围. 在此范围内，探针自身带来的荧光变化可不予考虑.

图 5

Fig. 5

图 5 探针1+Na2S/探针1在不同pH值条件下在460 nm处的荧光强度 Fig. 5 Fluorescence intensity of probe 1+Na2S/probe 1 at 460 nm under different pH

图 6为测试体系中，探针1对不同浓度Na₂S响应的荧光发射光谱. 从中可以看出，当Na₂S的浓度从0增加到50 μmol ·L^-1，探针1在460 nm处的荧光强度逐渐增强，增强倍数大于100倍. 在0~10 μmol ·L^-1浓度范围内，Na₂S浓度和荧光强度呈现良好的相关性，相关系数R2=0.99. 探针1对H₂S的检测限为6 μmol ·L^-1(S/N=3).

图 6

Fig. 6

从下到上，Na2S 的浓度分别为0、 2、 4、 6、 8、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50 μmol ·L-1 图 6 探针1与Na2S的荧光滴定曲线 Fig. 6 Fluorescence titration curves of probe 1 with Na2S

为了测试探针对H₂S的选择性，笔者考察了一些常见的阴离子 F^-、 Cl^-、 Br^-、 I^-、 CO^2-₃、 HCO^-₃、 HPO^2-₄、 NO^-₂、 NO^-₃、 SO^2-₄、 CH₃COO^-、 SO^2-₃、 S₂O^2-₃、 CN^-、 citrate和N^-₃对荧光强度的影 响(图 7)，探针浓度为10 μmol ·L^-1，各阴离子浓度均为1mmol ·L^-1. 加入上述离子后，体系在460 nm处的荧光强度没有明显的变化. 而加入20 μmol ·L^-1的Na₂S后，荧光强度迅速增加. 同时，即使存在高浓度的其他阴离子，探针对Na₂S的荧光响应也不受明显的影响. 这些结果表明，探针1能够很好地区分H₂S和其他阴离子，对H₂S的检测具有很高的选择性.

图 7

Fig. 7

从1~16离子分别是: F-、 Cl-、 Br-、 I-、 CO2-3、 HCO-3、 HPO2-4、 NO-2、 NO-3、 SO2-4、 CH3COO-、 SO2-3、 S2O2-3、 CN-、 citrate和N-3; 白色柱: 探针1+阴离子，黑色柱: 探针1+阴离子+Na2S 图 7 探针1的离子选择性研究 Fig. 7 Study on ion selectivity of probe 1

在探针浓度一定时，体系的颜色和Na₂S的浓度有关. 由图 8可以看出，随着Na₂S浓度的增加，体系颜色逐渐加深，当Na₂S的浓度增加到3 μmol ·L^-1时，体系的颜色变化是肉眼可见的，说明探针1可以作为一个可视化荧光探针用于检测H₂S. 基于探针颜色的变化与Na₂S浓度之间的相关性，可以制作一张比色图表(图 9)，通过肉眼对比检测体系和比色表的颜色，可以简便、 快速地实现H₂S的半定量检测.

图 8

Fig. 8

从左到右Na2S浓度为0、 2、 3、 5、 10、 30、 50 μmol ·L-1 图 8 随Na2S浓度的增加探针1颜色的变化 Fig. 8 “Naked-eye” color changes of probe 1 upon addition of different concentrations of Na2S

图 9

Fig. 9

从左到右Na2S浓度为0、 3、 10、 30、 50 μmol ·L-1 图 9 根据不同浓度Na2S溶液的颜色制备的比色图表 Fig. 9 Prepared color chart according to the solution color with different concentrations of Na2S

以2-(2′-羟基苯基)苯并咪唑为荧光团，基于H₂S较强的亲核性，可使NBD醚键发生断裂的特性，设计并合成了一种新型的可视化检测H₂S的荧光探针. 该探针的可视化检测限为3 μmol ·L^-1，荧光检测限为6 μmol ·L^-1. 由于HBI是激发态分子内质子转移化合物，因此探针具有较大的Stokes位移(约100 nm)，有利于降低检测中激发的干扰. 该探针对H₂S的选择性好，不易受其他阴离子的干扰; 响应时间短，5 min可完成检测; 在pH 6~9范围内，探针仍然表现出较好的荧光响应. 该探针为H₂S的检测提供了一种新的有效方法.