双酚A(BPA)，学名为2,2-二(4-羟基苯基)丙烷，化学式为C₁₅H₁₆O₂，是环境雌激素的一种^[1,2]. 有研究表明，双酚A能够模拟内源激素、 雌激素和雄激素对机体产生影响，即使很低的剂量也会扰乱人体代谢过程，影响中枢神经系统和生殖系统，甚至可能诱发癌变^[3,4]. 双酚A的用途广泛，不但用于生产化工产品如阻燃剂、 涂料、 抗氧化剂等，更令人担忧的是，双酚A广泛用于环氧树脂和聚碳酸酯塑料的生产，进而用于食品包装(如罐头食品、 水瓶等)，并可通过食品及饮料容器浸入食品而被人体摄取^{[5, 6, 7, 8, 9]}. 有研究报道，从事环境相关职业者以及普通人群体内均可检测到双酚A的存在，其含量在 ng ·L^-1的数量级，这无法通过传统检测方法得到有效检测^[9,10]. 此外，BPA可以通过溶出、 排放、 迁移等因素进入水体环境，其特点是含量低(多为痕量级)、 范围广. 因此，对环境中双酚A的检测需要一种高灵敏度、 高准确度的检测方法.

传统的检测双酚A的方法主要是气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，这些检测手段虽然灵敏度、 精确度较高，但昂贵的分析成本、 复杂费时的样品前处理过程等，都限制了该方法的推广应用^{[11, 12, 13, 14, 15]}. 酶联免疫分析法(ELISA)检测水样中BPA也在国内外文献报道使用过^{[16, 17, 18]}，该方法具有灵敏度较高、 能实现梯度分析等优点，成为目前应用最广、 发展最快的酶免疫学技术方法. 但该方法操作过程需要手工顺序加入试剂，测定结果受人为操作、 洗板过程、 温度、 时间等因素干扰较大. 本文基于平面波导型全内反射荧光免疫生物传感器，建立了一种BPA快速高灵敏检测方法，重点研究免疫检测过程中基质的干扰及消除策略，并考察其对实际样品中BPA的检测回收率. 该仪器将免疫分析技术、 荧光定量分析技术、 传感技术三者结合为一体，具有简化样品前处理过程、 缩短检测时间、 减少检测费用等优点，同时能实现自动化分析，避免了人为操作的误差，特别适合环境中痕量有机污染物(如BPA)的快速检测. 1 传感器系统的结构和理论基础 1.1 传感器系统硬件结构

本传感器的硬件结构主要包括3部分: 光学元件、 流动进样系统、 控制及信号处理系统(图 1)，详见文献^{[19, 20]}，这里将不再赘述.

图 1

Fig. 1

图 1 平面波导型荧光免疫传感器的硬件结构示意 Fig. 1 Schematic of planar waveguide fluorescent biosensor

1.2.1 倏逝波原理 倏逝波是在全反射条件下产生的，由两介质界面向光疏介质方向延伸的一层极薄的电磁场(约几百纳米)，其振幅随离开界面距离呈指数衰减^[21].

对本传感器来说，入射光在芯片内部发生全反射，并在芯片与水溶液两介质间产生倏逝波. 由于芯片修饰为薄膜修饰，膜层厚度为纳米级(具体方法见文献^[22])，处于倏逝波透射深度范围内，因此，倏逝波能激发固定于芯片表面的荧光染料产生荧光. 1.2.2 间接竞争免疫检测模式

本传感器系统基于间接竞争免疫检测模式，将抗体作为检测试剂并进行荧光标记. 首先将小分子抗原固定于芯片表面，再将过量抗体与样品溶液混合预反应一段时间，之后混合液经流动进样系统输入反应池与固定抗原反应. 此时，大量游离抗体能与芯片上抗原特异性结合，固定在芯片表面. 通过测定固定于芯片表面标记抗体产生的荧光量，经计算可实现待测样品的定量检测. 1.2.3 数据分析方法

对间接竞争免疫检测模式来说，在半对数坐标系中标准曲线呈反S型，笔者用4个参数的Logistic模型进行模拟，其公式为:

平面波导型荧光免疫传感器; 精密天平(Mettler Toredo); 氮气吹干机(BF2000，八方世纪); 超声波清洗仪(Branson200，旭阳公司); 移液枪(Gilson).

所用试剂均为分析纯，主要有牛血清白蛋白(BSA)、 双功能试剂(GMBS)、 双酚A、 腐殖酸均购自Sigma公司; 其他试剂未经特别注明均由北京化学药剂提供. 双酚A抗体(BPA-MAb,4D11)由本课题组制备，其荧光标记过程参考文献^[23]. PBS缓冲溶液、 0.5%的SDS(pH=1.9)由本实验室配制. 2.2 BPA免疫反应过程和条件

基于间接竞争免疫检测模式，试验以10倍浓度梯度稀释BPA抗原溶液(稀释后浓度从0.001~1000 μg ·L^-1)，之后将各浓度抗原与0.05 μg ·mL^-1 BPA抗体混合预反应3 min，预反应结束后混合液经流动进样系统输入反应池，进样时间为300 s. 通过做3次平行试验，将结果平均后经Logistic模型模拟得到标准曲线. 为了使标准曲线能够普遍适用于整个试验过程，对试验数据进行归一化处理. 该测试条件下系统每次检测时间不超过20 min. 2.3 基质干扰及消除策略

由于免疫分析过程不需要对样品进行预处理，但实际水样复杂的物理化学性质均会对检测造成影响(基质效应)^[24,25].为此，考察了实际水样BPA检测过程中可能受到的基质干扰因素:离子强度、pH、腐殖酸浓度、 硬度(Ca²⁺、Mg²⁺浓度)，对检测结果的影响.

试验分别用3种不同浓度的PBS缓冲溶液、 7种不同pH值的10 mmol ·L^-1 PBS、 30 mg ·L^-1的腐殖酸溶液、 清华大学地下水(硬度为310 mg ·L^-1)，配置不同浓度BPA抗原溶液做出标准曲线并进行数据分析. 通过综合考虑检出限、 线性范围、 IC₅₀值评价各因素的影响程度.

为了消除基质硬度干扰，在抗体溶液中加入0.5%的螯合剂EDTA后，用同样方法做出标准曲线并进行对比研究. 2.4 实际水样检测

试验对4种实际水样进行了加标回收试验. 4种实际水样分别为: 塑料瓶装饮用水、 直饮水、 地表水(清华大学荷塘水)、 地下水，其中对地表水进行了简单的滤膜过滤(0.22 μm)以去除较大颗粒物. 试验分别测定4种实际水样原水中抗原浓度(x₁)，以及添加了BPA标准溶液后的水样浓度(x₂)，加标最终浓度(X)为1 μg ·L^-1和2 μg ·L^-1，则回收率计算方法为:

回收率(%)=[(x₂-x₁)/X]×100%

每个样品平行测定3次，分别计算回收率和相对标准偏差. 3 结果与分析 3.1 标准曲线

图 2为传感器系统对7种不同浓度BPA抗原响应信号动态及标准曲线. 标准曲线经Logistic曲线模拟，拟合度R2>0.99. 经计算，检出限(LOD)为0.04 μg ·L^-1，线性区间为0.16~22.40 μg ·L^-1，半抑制浓度(IC₅₀)为(1.67±0.47)μg ·L^-1.

图 2

Fig. 2

图 2 信号动态及BPA检测标准曲线 Fig. 2 Dynamic response signals and typical calibration curve for BPA

不同基质干扰下标准曲线的数据分析如表 1.

表 1(Table 1)

表 1 不同基质干扰下数据分析结果 /μg ·L-1 Table 1 Detection performances under different matrix interferences/μg ·L-1 项目 指标 检测限 半抑制浓度 线性区间 纯水 0.04±0.0001 1.03 0.12~14.07 离子强度 10mmol ·L-1 PBS 0.04±0.007 1.67 0.16~22.40 20mmol ·L-1 PBS 0.05±0.09 3.78 0.25~80.24 50mmol ·L-1 PBS 0.13±0.03 6.73 0.57~82.05 pH=3 0.13±0.004 10.55 0.65~154.57 pH=5 0.12±0.003 3.71 0.50~527.29 pH=6 0.09±0.01 6.83 0.44~88.53 pH值 pH=7 0.04±0.007 1.67 0.16~22.40 pH=8 0.09±0.09 8.39 0.46~106.10 pH=9 0.50±0.07 19.16 1.90~170.76 pH=11 0.52±0.18 12.60 1.74~142.27 腐殖酸 30mg ·L-1 0.07±0.09 5.38 0.37~109.96 硬度 310mg ·L-1 0.32±0.06 23.32 1.59~342.87

表 1 不同基质干扰下数据分析结果 /μg ·L-1 Table 1 Detection performances under different matrix interferences/μg ·L-1

10 mmol ·L^-1 PBS干扰下标准曲线的检出限、 半抑制浓度和线性区间范围与纯水相比均相差不大，但当缓冲液浓度大于10 mmol ·L^-1时，检出限和半抑制浓度逐渐增加，表明离子强度对传感器系统检测有一定影响.

随着溶液由酸性和碱性逐渐向中性改变，检出限逐渐降低，并在pH=7时检出限和半抑制浓度达到最低，此时系统灵敏度最高. 说明pH对系统测试产生较大影响，当实际水样pH过高或过低时，应对其进行调整.

在30 mg ·L^-1腐殖酸干扰下，检出限和半抑制浓度与纯水相比变化不大，该浓度的腐殖酸对系统检测双酚A影响可以忽略.

在硬度干扰试验中，如表所示，检出限和半抑制浓度均显著升高，表明硬度对系统检测能够产生较大干扰，在实际水样检测时需要对其进行屏蔽.

为了消除硬度的影响，试验加入0.5%的螯合剂EDTA到清华大学地下水(经测定水体硬度为310 mg ·L^-1)中，并配制不同浓度抗原溶液做出标准曲线如图 3所示.

图 3

Fig. 3

图 3 基质效应屏蔽效果 Fig. 3 Effects of EDTA on the detection performance

计算表明，加入0.5% EDTA后用地下水配制的标准曲线检出限和半抑制浓度分别为(0.06±0.04)μg ·L^-1和4.63 μg ·L^-1，与未采取屏蔽措施相比显著降低，说明该屏蔽策略能够有效控制水样中硬度干扰. 3.3 实际水样分析 在最优检测条件下，用10 mmol ·L^-1的PBS稀释抗体，同时加入0.5%的EDTA到实际样品中以屏蔽基质硬度干扰，对4种实际水样进行加标回收试验结果如表 2. 分析表明，加标回收率在88%~111%，变异系数小于15%，精密度良好. 该方法可成功运用于实际水样中BPA的检测.

表 2(Table 2)

表 2 4种实际水样加标测定结果 (n=3，置信度95%) Table 2 Spiked measurement results of four kinds of real water samples(n=3,confidence level of 95%) 样品名称 样品检出值/μg ·L-1 加标量/μg ·L-1 加标测量值/μg ·L-1 回收率/% 瓶装水 0.37±0.01 1 1.41±0.04 104 2 2.35±0.06 99 直饮水 0.03±0.002 1 1.05±0.02 102 2 2.25±0.10 111 地表水 0.04±0.01 1 0.93±0.09 88 2 2.05±0.10 100 地下水 0.08±0.004 1 1.07±0.10 99 2 2.09±0.14 100

表 2 4种实际水样加标测定结果 (n=3，置信度95%) Table 2 Spiked measurement results of four kinds of real water samples(n=3,confidence level of 95%)

在最优检测条件下，系统检测水样中BPA的检出限为0.04 μg ·L^-1，线性区间为0.16~22.40μg ·L^-1，与双酚A的酶联免疫分析方法获得的数据相比，检出限低一个数量级^{[26, 27, 28]}(文献报道为0.10μg ·L^-1). 加入0.5% 的EDTA到样品溶液后测得4种实际水样加标回收率为88%~111%，变异系数小于15%. 4 结论

本研究使用一种基于免疫分析原理的平面波导型荧光免疫传感器检测水样中双酚A，该系统具有良好的稳定性和准确性，能够实现实际水样中BPA的灵敏、 快速、 便捷的检测.