环境科学  2015, Vol. 36 Issue (1): 244-251   PDF    
引用本文
陈晨, 柏耀辉, 梁金松, 袁林江. FISH-NanoSIMS技术在环境微生物生态学上的应用研究[J]. 环境科学, 2015, 36(1): 244-251.
CHEN Chen, BAI Yao-hui, LIANG Jin-song, YUAN Lin-jiang. Application of FISH-NanoSIMS Technique in Environmental Microbial Ecology Study[J]. Environmental Science, 2015, 36(1): 244-251.
FISH-NanoSIMS技术在环境微生物生态学上的应用研究
陈晨1,2, 柏耀辉2 , 梁金松2, 袁林江1    
1. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 西安 710055;
2. 中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室, 北京 100085
收稿日期: 2014-06-10; 修订日期: 2014-07-10.
基金项目： 环境保护公益性行业科研专项(201409029); 环境水质学国家重点实验室基金项目(13Z03ESPCR)
作者简介：陈晨(1991~),女,硕士研究生,主要研究方向为生物滤池中生物锰氧化物的生成及应用,E-mail:stzxchen@126.com
通讯联系人,柏耀辉,E-mail:yhbai@rcees.ac.cn
摘要：微生物分子生态学技术的不断发展,使得同时分析复杂生态系统中微生物的分布和功能特征成为可能. 为了研究荧光原位杂交-纳米二次离子质谱技术(fluorescence in situ hybridization-Nano secondary ion mass spectroscopy,FISH-NanoSIMS)在环境微生物生态学上的应用,本研究采用稳定同位素标记的化合物13C-C6H12O6、15N-NH4Cl作为C源和N源,分别对纯培养锰氧化细菌假单胞菌Pseudomonas sp. QJX-1(培养基加锰及不加锰两种条件下),以及浅层土壤及厌氧污泥两种环境样品进行培养. 利用FISH-NanoSIMS技术检测培养后样品中微生物体内12 C-、13C-、12 C14 N-、12 C15N-的分布特征及其丰度值,进而探讨纯菌及环境样品中微生物利用同位素碳氮源的情况. 结果显示 所有样品细菌分布区域对应的同位素碳氮(13C、15N) 的含量均显著大于其自然丰度值,这表明Pseudomonas sp. QJX-1及环境样品中的微生物均能代谢13C-C6H12O6和15N-NH4Cl. 研究进一步发现,Pseudomonas sp. QJX-1在碳氮源消耗至较低浓度时才进行锰氧化; 浅层土壤和厌氧污泥中可能都存在同步硝化反硝化细菌群落. FISH和NanoSIMS技术联用能同时分析环境样品中特定微生物的分布特征及代谢功能,进而能更好地掌握环境样品中微生物群落的生理生态学特征.
关键词： FISH-NanoSIMS     微生物生态学     同位素标记     碳氮源     锰氧化    
Application of FISH-NanoSIMS Technique in Environmental Microbial Ecology Study
CHEN Chen1,2, BAI Yao-hui2 , LIANG Jin-song2, YUAN Lin-jiang1    
1. School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China;
2. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Science, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
Abstract: With the development of microbial ecology techniques, it is possible to analyze the distribution and function of microorganisms simultaneously in complex ecosystems. To explore the application of FISH-NanoSIMS in environmental microbial ecology study, our study used the stable isotope labeled compounds 13C-C6H12O6 and 15N-NH4Cl as C and N sources for cultivating the pure culture(manganese oxidizing bacteria, Pseudomonas sp. QJX-1) and environmental samples(the shallow soil and anaerobic sludge). FISH-NanoSIMS was used to detect the distribution of microorganisms and relatively quantify secondary ions(12-, 13C-, 12C14N-, 12 C15N-) in cultivated samples, in order to explore the utilization of C and N isotopes sources by the pure culture and microorganisms in environment samples. The results showed that the contents of 13C and 15N in the area of bacteria were significantly greater than the natural abundance in all samples. It indicated that Pseudomonas sp. QJX-1 and some specific bacteria in environmental samples could metabolize 13C-C6H12O6 and 15N-NH4Cl. Furthermore, this study revealed that for Pseudomonas sp. QJX-1, the manganese oxidation only occurred when the carbon and nitrogen were consumed to a low level. For environmental samples, the bacterial nitrification and denitrification were both observed in the shallow soil and anaerobic sludge. In a word, our study demonstrated that the combination of FISH and NanoSIMS could simultaneously examine microbial distribution and microbial metabolic activity in environmental samples, which will help us to obtain the eco-physiology information of microbial community.
Key words: FISH-NanoSIMS     microbial ecology     isotope labeling     carbon and nitrogen sources     manganese oxidation    

目前，环境微生物生态学的主要研究目标是建立复杂环境中微生物多样性和微生物生理生化特征之间的联系[1]，而传统的实验室富集分离纯培养方法无法使人们全面了解自然环境中微生物的多样性[2]. 通过免培养的分子生态学技术，如聚合酶链式反应(PCR)及克隆测序等，直接提取环境微生物样品的DNA，进行PCR扩增后构建克隆文库并测序，并与已知序列进行对比，可得到微生物的多样性和系统发育信息[3]. 但该方法需要将细胞破碎并从中提取核酸作为模板，很难将PCR的结果与微生物的形态结构联系起来，因而无法在原位上观察微生物的形态结构和代谢功能[4].

FISH-SIMS,即把荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)与二次离子质谱技术(secondary ion mass spectrometry,SIMS)相结合. FISH技术将荧光染料标记的寡核苷酸探针与微生物样品进行杂交，并用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察定位样品中的微生物; 再利用SIMS技术检测上述已定位微生物体内的元素分布与丰度，两者的联用能够实现在原位上同时观察自然环境样品中微生物的形态结构、 种类分布及功能代谢信息[5]. 2001年，Orphan首次将FISH与SIMS技术结合用于监测自然环境中微生物的代谢信息，但SIMS技术的分辨率较低，不能有效地识别微生物[2]. 纳米二次离子质谱技术(nano secondary ion mass spectroscopy，NanoSIMS)的出现，弥补了SIMS的不足. 新型NanoSIMS 50L具有高空间分辨率、 高传输效率及极高的灵敏度[6]，广泛应用于材料、 生物医学、 地质学等领域的研究[7, 8, 9]. 实际应用中NanoSIMS技术常结合稳定同位素技术，与扫描/透射电镜(SEM/TEM)、 荧光原位杂交(FISH)等[10, 11, 12]技术联用，在微生物生态学研究中突显出巨大的潜力[13, 14, 15].

本研究分别以纯菌培养体系及复杂环境体系为例，探讨了如何利用FISH-NanoSIMS技术实现在原位同时观察微生物的种群空间分布并获取特定功能代谢信息，以期为该技术在环境微生物生态学上的应用提供方法学支持.

1 材料与方法 1.1 样品培养 1.1.1 纯菌培养体系

菌株: 试验采用假单胞菌QJX-1(Pseudomonas sp. QJX-1)，该菌株由湖南湘潭堆放锰矿的土壤分离纯化得到，能将二价锰离子氧化生成锰氧化物(以四价为主). 培养基: 菌株培养采用PYG[16]培养基(peptone-yeast extract-glucose)，具体成分为蛋白胨、 葡萄糖、 酵母膏各0.25 g ·L-1，60 mg ·L-1的CaCl2 ·2H2O，0.5 g ·L-1的MgSO4 ·7H2O; 试验所用缓冲液采用终浓度为10mmol ·L-1的HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，过滤灭菌(0.22 μm滤膜)后加至高压灭菌后的培养基，pH值为7.0~7.5.

菌株活化: 取3 mL保存于-80℃冰箱的菌液，加至装有27 mL新鲜PYG培养基的100 mL锥形瓶中，置于恒温摇床(30℃，170 r ·min-1) 振荡培养24 h，取3 mL培养后的菌液，重复上述操作两次，完成菌株活化.

菌株培养: 取10 mL活化后的菌液，加至装有90 mL新鲜PYG培养基的250 mL锥形瓶中，加入Mn2+(终浓度为5 mg ·L-1)，并加入13 C-C6H12O6、 15 N-NH4Cl，使其C、 N质量比为100 ∶5，置于恒温摇床(30℃，170 r ·min-1) 中分别振荡培养2 d、 10 d、 20 d. 同时设置3个不加Mn2+的处理作为对照.

1.1.2 复杂环境样品体系

选取土壤及活性污泥作为典型研究对象. 土壤采自花园植物根部浅层土壤，活性污泥取自清河污水处理厂二沉池回流污泥. 分别称取4 g土壤(湿重)和4 g活性(湿重)污泥至两个细口瓶中，加灭菌去离子水至100 mL混匀，并加入13 C-C6H12O6、 15 N-NH4Cl，使其C、 N质量比为200 ∶5，充入氮气，使其处于厌氧状态，密封，分别置于30℃恒温培养箱中静置培养10 d.

1.2 样品的处理

取2.0 mL上述培养后的样品于离心管中，8 000 r ·min-1离心2 min，将沉淀用1 mL 50 mmol ·L-1的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)清洗3次，8 000 r ·min-1离心 2 min; 将沉淀悬于0.2 mL的 PBS中，加入0. 6 mL 4%的多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)溶液，在4℃下放置3 h后取出，8 000 g离心2 min; 将沉淀重悬于PBS中，轻微振荡3次，快速离心去上清后将沉淀完全悬于200 μL PBS中，并加入200 μL无水乙醇，-20℃保存备用.

1.3 荧光原位杂交

将直径为10 mm的圆形载玻片放入无水乙醇中浸泡，酒精灯灼烧后浸入含有10%十二水硫酸铬钾的明胶溶液中，静置2 h后取出，在室温条件(18~25℃)下放置12 h; 取2 μL上述处理后的样品，均匀涂于载玻片中央，自然风干后依次用50%、 80%、 100%的乙醇/PBS各脱水3 min，自然风干后进行杂交试验.

试验中所用寡核苷酸探针及其对应的染料见表 1，按照杂交缓冲液中甲酰胺(FA%)浓度由低到高的顺序进行杂交，即依次杂交TBD1419、 EUB338. 为避免荧光淬灭，以下操作均在暗室中进行. 将滤纸折叠成圆筒状，紧贴管壁放入杂交管中，加入2 mL杂交缓冲液，使滤纸全部润湿. 将涂有样品的载玻片置于杂交管中，同时取9 μL杂交缓冲液和1 μL(50 ng ·μL-1)的探针混合后用锡箔纸包裹避光，放入46℃杂交炉中预热30 min; 然后取9 μL预热后的探针混合液均匀涂在样品上，移回杂交管中后置于杂交炉(46℃，12 r ·min-1)内杂交3.5 h. 同时将淋洗缓冲液和剩余的杂交缓冲液放入杂交炉中预热3.5 h. 杂交完成后，取出载玻片，倾斜45°置于培养皿中，依次用预热后杂交缓冲液、 淋洗缓冲液和4℃超纯水从玻片顶部冲洗，用滤纸吸干水分后室温放置12 h; 再将其置于冰上，用DAPI (10mg ·L-1,Sigma)试剂染色10 min后用超纯水洗去多余的DAPI染料，迅速用滤纸吸干水分水，静置12 h后均匀涂上防荧光淬灭剂，封片观察.

表 1 试验中所用探针及染料Table 1 Probes and dyes used in the experiment
1.4 FISH的观察与数据分析

用激光共聚焦荧光显微镜(CLSM，德国，LSM780)观察杂交完的载玻片，先用低倍镜(10×)扫描拼成7×7的全图，找出特定细胞所在区域并定位，然后用高倍镜(20×)对定位区域扫描成像.

1.5 NanoSIMS的观察与数据分析

利用中国科学院地质与地球物理研究所的NanoSIMS 50L型纳米离子探针质谱仪(法国，Cameca)进行元素分析. 样品中N-以CN-离子团形式检测，设置电子倍增探测器收集二次离子12 C-、 13 C-、 12 C14N-、 12 C15 N-. 将上述定位后的载玻片进行喷金处理，置于样品腔内. 先用约1 nA 的高速电子流预溅射样品至100 nm的深度，再用1.0 pA一次离子源 Cs+源轰击样品，样品表面溅射出的二次离子束，通过脉冲计数收集检测后呈现出定量二次离子图像. 轰击面积大小约为150 nm，扫描像素为256×256，停留时间为每像素20 ms,图像尺寸在10 μm×10 μm~25 μm×25 μm之间，扫描层数由样品特性决定，确保不同扫描尺寸下得到的结果保持相同. 本试验实际扫描两层，最终图像为两层叠加修正而成.

依据样品在CLSM上的成像(蓝色代表细胞，红色代表细菌，绿色代表反硝化细菌)，选取其在NanoSIMS上的观察区域. 对于纯培养样品，当蓝色和红色同时存在时，选择该区域为观察区域; 对于复杂环境样品，当13 C-或(12 C15 N-)出现富集现象且蓝色和红色(或绿色)同时存在时，则选择该区域作为观察区域. 扫描分析完成后，导出图像，用软件Image J修正处理，并得出不同元素比值图. 区域内元素(二次离子)分布及丰度大小由图像观察得出，样品中同位素碳氮(13 C、 15 N) 的含量分别以二次离子13 C-与12 C-及12 C15 N-与12 C14N-之间的比值表示，即以13 C/12 C、 12 C15 N/12 C14N 比值图表示，对每个样品的3个平行样进行统计，并与其自然丰度值[19](13 C/12 C=0.011 0，15 N/14N=0.003 70)进行对比，分析微生物对同位素碳氮的代谢情况.

2 结果与讨论 2.1 纯菌培养体系 2.1.1 NanoSIMS应用分析

为探讨FISH-NanoSIMS技术在纯菌培养体系上的应用，按照1.5节中所示方法，找出观察区域(见图 1中A、 B)并在NanoSIMS 50L上观察，结果见图 1中A1~A4、 B1~B4. 观察发现FISH图中细菌分布区域(红色)内同位素碳氮(13 C、 15 N) 的丰度值显著大于其自然丰度值，说明该锰氧化菌能够代谢同位素化合物13 C-C6H12O6和15 N-NH4Cl. Amann等[20]曾应用该技术研究纯培养体系中氨氧化古菌对碳源的利用情况，研究表明氨氧化古菌能够代谢13 C-丙酮酸.

A、 B分别为培养10 d的Pseudomonas sp. QJX-1(A: 培养基加Mn2+,B: 不加Mn2+)，a、 b为对应FISH图，蓝色为背景DAPI染料; 红色为EUB338，定位细菌. A1~A4、 B1~B4为A、 B对应NanoSIMS图，图中右侧彩色条带代表对应元素丰度值图 1 Pseudomonas sp. QJX-1的FISH-NanoSIMS分析Fig. 1 FISH-NanoSIMS analysis of Pseudomonas sp. QJX-1

为了探讨FISH-NanoSIMS技术对纯菌培养体系中同位素碳氮含量的测定误差，以培养10 d后的锰氧化菌(培养基加Mn2+及不加Mn2+)为对象，分别对其3个平行区域中13 C/12 C、 12 C15 N/12 C14N值进行统计分析，结果见表 2. 4组数据中，相对误差均小于10%. 说明FISH-NanoSIMS在测量纯菌培养样品碳氮含量时误差较小，表明该技术对纯菌培养体系的测定具有较好的平行性.

表 2 Pseudomonas sp. QJX-1的NanoSIMS分析误差Table 2 NanoSIMS statistics analysis for Pseudomonas sp. QJX-1
2.1.2 Pseudomonas sp. QJX-1锰氧化过程及其对同位素碳氮源的代谢

研究探讨了Pseudomonas sp. QJX-1在不同时间的锰氧化现象，以及其体内同位素碳氮含量随时间的变化趋势. 对每个样品的3个平行区域的平均值进行分析，见图 2. 结果发现: 随着培养时间增加，锰氧化菌体内同位素碳氮含量先增加后减少，培养20 d后，同位素碳氮总量明显减少; 另外对试验现象进行观察，发现菌体在培养20 d后，菌液中开始生成红褐色颗粒状锰氧化物，即出现锰氧化现象. 由此得出，在Mn2+存在条件下，当碳氮消耗至浓度较低时，Pseudomonas sp. QJX-1才会进行锰氧化. 这进一步证实了笔者以前的研究结果，锰氧化细菌Pseudomonas sp. QJX-1属贫营养微生物，这种微生物比表面积很大、 比增长速率很小、 内源呼吸速率常数(b) 较低、 饱和常数(KS) 较小，其在寡营养中生长良好[21].

彩色条带代表对应元素含量大小，误差线代表 3个平行样品的标准偏差图 2 Pseudomonas sp. QJX-1培养过程中体内同位素碳氮含量变化Fig. 2 Contents of carbon and nitrogen isotopes during cultivation of Pseudomonas sp. QJX-1
2.2 复杂环境体系 2.2.1 NanoSIMS应用分析

为了探讨FISH-NanoSIMS 技术在复杂环境体系中的应用，按照1.5节中所述方法，找出观察区域(见图 3中C、 D)，并在NanoSIMS 50L上观察，结果见图 3中C1~C4、 D1~D4. 观察发现C、 D中出现反硝化细菌(绿色)，表明浅层土壤和厌氧污泥中均存在反硝化细菌; 另外还发现FISH图中细菌分布区域(红色)内同位素碳氮(13 C、 15 N) 的丰度值显著大于其自然丰度值，表明浅层土壤和厌氧污泥均能够代谢13 C-C6H12O6、 15 N-NH4Cl. 该技术在研究复杂环境体系中微生物对同位素碳源的代谢中已有应用，如Li等[22]利用该技术证明反应器复杂微生物群落中的古菌能够代谢13 C-CH2OH.

C、 D分别为培养10 d的浅层土壤、 厌氧污泥，c、 d为对应FISH图，蓝色为背景DAPI染料; 红色为EUB338，定位细菌; 绿色为TBD1419，定位反硝化细菌; C1~C4、 D1~D4为C、 D对应NanoSIMS图，图中右侧彩色条带代表对应元素丰度值图 3 环境复杂样品的FISH-NanoSIMS分析Fig. 3 FISH-NanoSIMS analysis of complex environmental samples

为了探讨FISH-NanoSIMS技术对复杂环境体系中同位素碳氮含量的测定误差，以培养10 d后的浅层土壤和厌氧污泥为对象，分别对其3个平行区域中13 C/12 C、 12 C15 N/12 C14N值进行统计分析，结果见表 3. 4组数据中，相对误差均在10%~20%之间，说明FISH-NanoSIMS在测量复杂环境样品时的误差较纯菌培养样品大，表明该技术对纯菌培养样品中同位素碳氮含量的测定比复杂环境样品中更为准确.

表 3 环境样品的NanoSIMS分析误差Table 3 NanoSIMS statistics analysis for environmental samples
2.2.2 反硝化细菌对同位素碳氮源的代谢

为探讨复杂环境体系中反硝化细菌对同位素碳氮的代谢情况，运用Image J 软件画出反硝化菌轮廓，分析反硝化细菌体内碳氮的含量，每个样品选择3个平行区域，进行统计分析，结果见图 4. 对比发现土壤和污泥中反硝化细菌体内同位素氮的含量远远大于其在自然条件中的含量，说明该样品中的反硝化细菌能够利用15 N-NH4Cl，分析由于复杂环境体系中微环境的改变，使得浅层土壤和厌氧污泥中可能存在同步硝化反硝化过程[23].

误差线代表 3个平行样品的标准偏差图 4 培养10 d后反硝化细菌体内的同位素碳氮含量Fig. 4 Contents of carbon and nitrogen isotopes inside denitrifying bacteria after 10 d cultivation
2.3 FISH-NanoSIMS技术应用总结

FISH-NanoSIMS技术的关键在于定位[24]，试验过程中共尝试了以下3种定位方法: ①特殊形状定位. 根据样品的特殊形状，识别出观察区域. 但并非所有样品都有特殊形状，因此该方法具有很大的局限性. ②坐标转换定位. 在样品上标记参考点，利用CLSM读出参考点以及观察区域坐标，导出观察区域相对于参考点的相对坐标，在实际NanoSIMS检测下找到参考点，输入相对坐标，便找到对应的观察区域. 而由于显微镜下参考点的选取有差异，故该方法容易出现误差. ③位置定位. 在圆形玻片上刻上10 μm×10 μm的方格，运用CLSM拼出样品全图，找出观察区域所在格子的位置，在NanoSIMS上直接找出观察区域. 该方法准确可靠，故本试验最终采用该方法定位.

试验对FISH-NanoSIMS技术的检测误差进行分析，发现该技术对纯菌培养体系和复杂环境体系中的元素分析均存在一定的误差，这种误差可归因于样品自身基质[24]以及仪器本身[25]的差异. 因此制定统一规范来校正分析过程中样品基质及仪器质谱结构对试验结果所造成的误差显得尤为重要[26].

FISH和NanoSIMS技术的联合使用，能够在原位上观察到微生物种群以及单细胞的位置分布，结合稳定同位素标记技术同时得到其功能代谢信息，为研究环境中同时监测多细胞以及单细胞表面形态、 功能代谢、 定量描述细胞行为变化打下了坚实的基础，使得环境微生物生态学研究取得了重大突破. 未来研究将着重于制定NanoSIMS试验规范校正分析误差，以及多种多样的胞外标记技术的开发.

3 结论

(1)将FISH-NanoSIMS技术用于检测微生物纯菌培养体系及复杂环境体系下特定微生物的分布特征及其体内元素的种类和分布，结果发现锰氧化菌Pseudomonassp. QJX-1、 浅层土壤及厌氧污泥中的微生物均能够利用稳定同位素标记的化合物13 C-C6H12O6和15 N-NH4Cl.

(2)通过FISH-NanoSIMS技术监测锰氧化菌培养过程中体内同位素碳氮含量变化，观察分析结果表明在Mn2+存在条件下，当培养基中碳氮源被该菌消耗至较低浓度时才出现锰氧化现象.

(3)对FISH-NanoSIMS测定的3个平行样品中同位素碳氮含量进行误差分析，结果表明，该技术的测定误差在可接受范围内(相对误差<20%)，且对纯菌培养体系中同位素碳氮含量的分析误差小于复杂环境体系. 因此该技术用于纯菌培养体系及复杂环境体系中元素的测定时，数据稳定可信，是一种能够广泛用于微生物分子生态学研究中的技术.

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