传统的脱氮工艺首先在有氧条件下把NH⁺₄氧化为NO^-₂然后进一步氧化为NO^-₃，在无氧条件下反硝化为N₂，该工艺需要消耗大量的氧气同时需要添加有机碳源. 半短程亚硝化-厌氧氨氧化联合脱氮工艺是20世纪90年代发展起来的一种新型高效脱氮工艺^[1,2]，与传统脱氮工艺相比，脱氮工艺反应途径较短. 在硝化阶段通过控制溶解氧浓度，NH⁺₄只有一部分被氧化为NO^-₂，厌氧阶段厌氧氨氧化菌以NH⁺₄为电子供体，以NO^-₂为电子受体，将NH⁺₄和NO^-₂转变成N₂^[3]，该工艺减少了供氧量，不需要碱度和有机碳源的投加，节约了能源和运行成本. 因其大大节约了能源越来越受到国内外的重视. 通常情况下厌氧氨氧化脱氮温度在30℃左右，但我国大部分地区温度常年低于30℃，为使厌氧脱氮顺利进行，在脱氮过程中需要加热升高温度. 为了节省能源，研究常、 低温条件下厌氧氨氧化菌的脱氮性能变得尤为重要^[4]. 近来温度小于25℃条件下厌氧氨氧化菌脱氮性能已开始被人研究，但研究主要集中在高氨氮废水处理及菌群变化情况^[5,6]，对在低温条件下低氨氮城市污水处理过程中厌氧氨氧化菌群性能鲜有报道^[7]，但研究厌氧氨氧化低温处理城市污水更具有实际意义^[8,9].

本文以厌氧氨氧化反应器处理城市污水的颗粒污泥为研究对象，在30℃高效脱氮的基础上，逐渐降低反应器的运行温度至20℃，考察降温过程中微生物菌群结构的变化. 有研究指出厌氧氨氧化菌生长非常缓慢^[10,11]，其最大增长速率为0.003 ·h^-1(倍增时间为11 d). 当NO^-₂浓度超过100 mg ·L^-1，厌氧氨氧化菌完全受到抑制; 但是加入微量的厌氧氨氧化菌代谢中间产物，其活性又可完全恢复，如1.4 mg ·L^-1的联氨. 另有研究报道厌氧氨氧化细菌对NO^-₂的适应质量浓度可达710 mg ·L^-1，可能是由于反应器中富集了高浓度的厌氧氨氧化菌. 本研究采用PLFA方法对反应器的微生物群落结构整体情况进行定量分析，检测不同温度和氨氮浓度下，微生物群落量的变化; 同时运用定量PCR方法对厌氧氨氧化菌在不同温度下进行定量分析，采用PCR-DGGE方法，对ANAMMOX工艺的活性污泥系统中的细菌的多样性进行分析,以期为ANAMMOX反应系统在常温下处理城市污水提供理论依据.

本试验以上向流污泥床反应器(UASB)作为厌氧氨氧化反应器，反应装置为有机玻璃材质，如图 1所示，反应器高170 cm，内直径8 cm，有效容积约8 L. 反应器外裹水浴套桶，亦为有机玻璃材质，反应器外壁包裹黑色橡胶保温材料. 水浴套桶内以气循环带动水循环，保证水浴均匀，通过温控仪和水浴套，将反应器温度控制在所需温度范围. 本试验采用具有厌氧氨氧化活性的絮体污泥作为接种污泥，通过逐渐提高进水流量，从而提高上升流速来培养颗粒污泥. 试验进水采用半亚硝化短程反应器的出水作为原水. 试验定期取水样，经过0.22 μm滤膜过滤后进行水质指标的测定，分析测定方法参考文献^[12].

图 1

Fig. 1

图 1 ANAMMOX工艺流程和反应器Fig. 1 Schematic diagram of the ANAMMOX process and reactor

为了研究颗粒污泥的形态与表面特征，利用扫描电镜(SEM，HITACHI S-4300，Japan)对颗粒污泥表面进行了考察，颗粒污泥的前处理参照文献^[13]的方法.

磷脂是大部分微生物细胞膜的重要组成部分，在通常情况下其含量相对稳定，不同的微生物类群含有不同种类和数量的PLFAs，一些特性PLFAs存在于某类微生物的细胞膜中，PLFAs可作为微生物量和群落结构变化地生物标记. 分析方法参照文献^[5]的方法.

试验采用SYBR Green染料法，对出水中的厌氧氨氧化菌16S rRNA 基因分别进行了定量分析. 标准曲线质粒采用Candidatus Kuenenia的16S rRNA基因序列. 引物 Pla46/Amx820用作定量ANAMMOX 16S rRNA 基因^{[14, 15]}. 将质粒溶液稀释成不同浓度梯度作为模板，25 μL反应体系中含正向引物和反向引物各0.5 μL(10 μmol ·L^-1)，2 μL待测样品和质粒标准品DNA，9 μL 2.5×Master Mix(SYBR Green，TIANGENN)，每个样品做3个平行试验，结果取平均值. 仪器为Mx3000P荧光定量PCR仪(Genetimes公司). 以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的C_t值为纵坐标，绘制标准曲线. 对系统中的厌氧氨氧化菌进行定量，根据样品的C_t值，即可在标准曲线中定出样品的拷贝数.

浮霉菌属利用常规16S rRNA基因常规引物很难获得目标片段. 巢式PCR用于扩增较难直接获取的目标片段，试验采用浮霉菌特有引物Pla46、 Amx820第一轮扩增，第二轮用F338/R518扩增，对大多数细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对: F338GC/R518^[16]PCR反应条件: 为减少PCR过程中的非特异性扩增，PCR扩增程序选用Touchdown方法，预变性条件为94℃ 4 min，前20 个循环为 94℃，1 min，65～55℃，45 s和72℃，45 s(每个循环降0.5℃)，后10个循环为 94℃，1 min，55℃，50 s和72℃,45 s，最后在72℃下延伸10 min^[17]. PCR反应的产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测. 采用 Bio-Rad公司的基因突变检测系统(Dcode^TM Universal Mutation Detection System)对PCR产物电泳进行DNA分离. 制备含有变性剂(尿素和甲酰胺)的8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂的浓度为40%和60%，先在2 mL 0%变性胶中加入9 μL TEMED和29 μL 10%的APS缓慢注入固定好的两块玻璃板中间，封住底部，封口胶凝固后，用注射器吸取20 mL 40%和60%两种浓度的变性胶，再分别加入25 μL TEMED和100 μL 10%APS，固定在灌胶设备上，缓慢转动灌胶轮将两种浓度的胶体以不同速度注入玻璃板中间，制成40%~60%变性梯度的胶，在室温下凝胶4 h以上，待胶完全凝固后拔下梳子. 配制1×TAE缓冲液倒入电泳槽，把胶放入电泳液，开始加热使电泳液温度预热至60℃，在每个加样孔中加入PCR产物45 μL，先在20 V电压下电泳20 min，待电泳液温度升至60℃，将电压调到60 V，在60℃电泳16 h. 电泳完毕后，将凝胶在EB中染色15 min，然后放入纯水中，脱色15 min. 将脱色后的凝胶置于Quaintity One凝胶成像系统下分析并拍照，得到DGGE图谱，结果分析采用Quaintity One软件. 巢式PCR专有引物为引物 Pla46/Amx820.

培养成功的厌氧氨氧化颗粒污泥从外观上看呈红色^[18,19]，由于厌氧氨氧化菌内羟氨氧化还原酶和联氨氧化酶含有血红素C. 此外丝状菌的存在可能是形成颗粒污泥的有利因素之一，研究发现丝状菌对大多数惰性载体材料有很强的吸附作用^[20,21]. 当厌氧氨氧化反应器内上升流速逐渐增加时，水流扰动增强，接种的絮体污泥中的丝状菌会被吸附到污泥中的惰性颗粒上，同时此过程也会将厌氧氨氧化菌微小聚集体嵌入其中，逐渐形成沉降速度较大的颗粒污泥，优质的颗粒污泥是出水水质的重要保证.

由表 1看出，出水NO^-₃-N浓度明显较高，可能由于厌氧氨氧化反应器进水中COD浓度较低，且大多数为难降解有机物，厌氧反硝化作用很难发生，且在进水过程中有少量氧气被带入，所以NO^-₃-N有所升高且难以去除. 为了进一步保证城市污水自养脱氮系统整体出水水质，满足国家或地方对出水TN的要求，可以将ANAMMOX反应器出水部分回流至系统A/O反应器的缺氧段，利用活性污泥法出水中剩余的碳进行反硝化，去除水中的硝酸盐氮.

表 1(Table 1)

表 1 进出水水质指标 Table 1 Quality indices of the influent and effluent 温度/℃ 进水/mg ·L-1 出水/mg ·L-1 流量/L ·d-1 HRT1)/h COD/mg ·L-1 NH+4-N NO-2-N NO-3-N NH+4-N NO-2-N NO-3-N 30 16.6 20 12.6 1.9 1.5 16.9 775.0 0.14 26.5 25 19.2 22.8 13.2 8.5 4.7 20.1 1253 0.17 24.2 20 18.5 22.6 16.2 6.1 5.3 22.2 929 0.25 27.5 1) HRT为水力停留时间

表 1 进出水水质指标 Table 1 Quality indices of the influent and effluent

由图 2可以看出在0~90 d当温度30℃时，逐渐降低HRT时间，从开始1.26 h逐渐降低，到第60 d时HRT为0.35 h，从第60 d开始HRT由0.35 h降低为0.14 h，由于HRT降低，可能造成部分微生物不适应新的环境，在该工况下微生物的量有所降低，然后在该工况下运行到第90 d，微生物的量逐渐增加，到第90 d时，微生物的量达到最大值. 当HRT降低时微生物的量有所降低，然后回升，第90 d时达到最高. 当随后随着温度降低到25℃时，可以看出，微生物的量开始降低，氨氮去除率下降明显，主要是因为温度降低使得反应器容积氮去除速率下降，微生物活性减弱，有些微生物甚至死亡，而进水氮负荷却未下降相应的量，从而造成氨氮去除率下降，微生物总量下降. 但当第120 d时微生物的量又开始逐渐增加，到135 d时微生物的量超过了温度30℃时第90 d微生物的量. 在第150 d，当温度降低到20℃时，微生物的量明显减少，但在第165 d时微生物的量快速反弹，甚至超过温度30℃时微生物的量，证明在反应器运行过程中，污泥被逐渐驯化，耐冲击负荷能力加强.

图 2

Fig. 2

图 2 不同温度下城市污水处理ANAMMOX反应器中微生物总量的变化 Fig. 2 Variation of of total microbial biomass in the municipal sewage ANAMMOX reactor at different temperatures

反应器的脱氮率除了与厌氧氨氧化菌的活性有关，还与其数量有关，因此在低温条件下通过提高厌氧氨氧化菌的生物量可以获得较高的反应器脱氮效率. 所以厌氧氨氧化菌的有效停留就尤其重要，因为只有使新增殖的厌氧氨氧化菌有效停留在反应器内，才能把反应器内的厌氧氨氧化菌的生物量保持在较高的水平. 本研究中采用了活性炭为载体形成颗粒污泥，把颗粒污泥作为厌氧氨氧化菌的聚集体，原则上可以实现菌的有效富集.

定量PCR结果显示(图 3)，在温度由30℃降为20℃的过程中厌氧氨氧化菌的量不但没有降低，反而稍有所升高，20℃运行结束时污泥混合液中含有厌氧氨氧化菌拷贝数由30℃条件下的1.19×10⁸ copies ·mL^{- 1}增至1.86×10⁸ copies ·mL^-1. 可以明显看出降温过程中，厌氧氨氧化菌得到了进一步富集.

图 3

Fig. 3

图 3 厌氧氨氧化菌的16S rRNA基因在废水中的变化 Fig. 3 Variation of log number of ANAMMOX bacteria 16S rRNA gene in wastewater

采用浮霉菌特有引物Pla46、 Amx820第一轮扩增，第二轮用F338/R518扩增. 通过DGGE分析低氨氮 ANAMMOX 中厌氧氨氧化菌群的变化如图 4，1~12分别代表样品0~165 d，其中1~7表示温度在30℃样品，8~10表示温度在25℃样品，11~12表示温度在20℃样品. 在DGGE胶中相同的微生物用相同的数字标注，选取较亮的片段切胶进行分析. 从DGGE图谱可以看出在不同的样品中菌群的结构有着明显的变化. 在低氨氮城市污水中有10个不同的条带.

图 4

Fig. 4

图 4 厌氧氨氧化反应器中厌氧氨氧化菌16S rRNA 基因 V3 区的PCR-DGGE图谱 Fig. 4 Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of the V3 region of 16S rRNA gene of ANAMMOX bacteria in ANAMMOX reactor

测序序列经过和库中的已知序列比对得到9个OTUs，其中P5和P6属于同一个OTU.

在图 4中P7和P10在所有样品中都出现，P6在8号以后的样品中消失，表明该种菌属的细菌在温度降低过程中逐渐被淘汰，但大部分条带在经过富集驯化过程中逐渐出现，如P1、 P2、 P3、 P4、 P5、 P8、 P9，但随着温度的降低，一些非优势菌群逐渐显示，如P4、 P5、 P8. 但有些菌群出现之后成为优势菌群，而且含量非常丰富如P9、 P3，但P9含量更多，P3含量稍微少些. 由图 4也可以看出随着温度的降低，厌氧氨氧化菌的量逐渐增加，而且种类也在增加，表明在温度20℃时，水力负荷减小，更有利于厌氧氨氧化菌的增长. 而且由图 5可以看出，P1、 P6、 P10、 P4与已知厌氧氨氧化菌种的Candidatus Kuenenia sp. 相似，而P2、 P3、 P7、 P8、 P9与Candidatus Brocadia sp. 最为接近. 因此与30℃条件下培养的颗粒污泥中的厌氧氨氧化菌菌群相比，20℃条件下运行结束时颗粒污泥中的菌群结构发生了很大变化，即 Candidatus Brocadia sp. 的量得到了相对增加，而 Candidatus Kuenenia sp. 的量相对减少.

图 5

Fig. 5

图 5 低氨氮ANAMMOX工艺中浮霉菌的系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of planctomycete bacteria in ANAMMOX reactor

反应器容积氮的去除速率不但与厌氧氨氧化菌的数量有关，而且与厌氧氨氧化菌的活性也有关^[22]. 因此在低温条件下厌氧氨氧化菌的生物量增加可以获得较高的反应器脱氮效率，但厌氧氨氧化菌的有效持留也同样重要. 只有将新增殖的厌氧氨氧化菌有效持留在反应器内才能使反应器内的厌氧氨氧化生物量保持在较高的水平. 在25℃时出水NH⁺₄-N浓度逐渐升高，由3.38 mg ·L^-1变为8.30 mg ·L^-1，由去除率可以看出，本试验阶段厌氧氨氧化脱氮效率出现降低，氨氮去除率下降明显，主要是因为温度降低使得反应器容积氮去除速率下降，进水氮负荷却未下降相应的量，从而造成氨氮去除率下降. 本阶段厌氧氨氧化反应器对亚硝酸态氮的去除率也出现了下降，但与氨氮去除率下降幅度相比，亚硝酸态氮下降幅度较低. 出水NO^-₂-N浓度由平均2.94 mg ·L^-1变为4.54 mg ·L^-1.

当温度继续降低到20℃，为了保证出水水质，在厌氧氨氧化反应器脱氮性能下降时，就降低进水流量来降低进水氮负荷，HRT逐渐增加. 在本阶段前期，出水NH⁺₄-N浓度较高，随着运行时间的增加，出水NH⁺₄-N浓度逐渐降低. 这是为了降低出水NH⁺₄-N浓度而逐渐降低了进水流量，增加了HRT，即在反应器脱氮能力不变的情况下，降低进水氮的负荷，以提高出水水质. 因为反应器厌氧氨氧化菌的数量与该菌有效停留时间密切相关，由于HRT增加使新增殖的厌氧氨氧化菌有效持留在反应器内，使反应器内的厌氧氨氧化生物量增加.

由DGGE试验结果显示，当温度30℃时，厌氧氨氧化颗粒污泥中的厌氧氨氧化菌主要为Candidatus Kuenenia sp.,当温度降低到20℃时，厌氧氨氧化菌主要为Candidatus Brocadia sp.. 文献^{[23, 24]}研究也发现在厌氧氨氧化工程中运行一段时间后，污泥中的优势厌氧氨氧化菌由接种污泥中的 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 转变为 Candidatus Brocadia anammoxidans，分析原因可能是: Candidatus Brocadia anammoxidans对亚硝态氮的半饱和系数比较高，但是Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的半饱和常数比较低，因此在低亚硝态氮浓度时更有利于 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的增长^{[25, 26]}. 而本试验也符合这些结论. 本试验中温度由30℃降至20℃后，可能由于在低温下发生了水解发酵作用产生了挥发性脂肪酸，而这些脂肪酸有利于Candidatus Brocadia sp. 生长，这或许是本试验中厌氧氨氧化菌由Candidatus Kuenenia sp. 向Candidatus Brocadia sp. 转变的一个原因.

(1)低氨氮ANAMMOX反应器处理城市污水，运行温度由30℃降至20℃过程中，反应器内微生物的量有所增加，同时厌氧氨氧化菌的数量也有所升高，20℃运行结束时污泥混合液中含有厌氧氨氧化菌拷贝数由30℃条件下的1.19×10⁸ copies ·mL^-1增至1.86×10⁸ copies ·mL^-1.

(2)温度从30℃降低到20℃过程中颗粒污泥中厌氧氨氧化菌的菌群发生了明显的变化，由Candidatus Kuenenia sp. 单一菌群变为Candidatus Kuenenia sp. 和Candidatus Brocadia sp. 的混合菌群. 同时与30℃条件下相比，20℃条件下运行结束时颗粒污泥中的Candidatus Brocadia sp. 的量得到了相对增加，而 Candidatus Kuenenia sp. 的量相对减少.