近年来，湖泊水华因对水生生态系统的极端影响而受到世界各国的高度关注^[1]. 我国是湖泊大国，同样面临着湖泊水华频繁暴发的问题^[2]，虽然经过多年研究，在湖泊水华的危害、 监测与预警、 发生机制、 影响因素等方面取得了较大进展^[3,4]，但湖泊水华频繁暴发依然严重，湖泊环境治理仍面临巨大压力，所以，非常有必要继续深入研究水华生消过程的机制. 其中，水华生消过程对微生物的影响尤为值得关注，一是因为湖泊沉积物是微生物最为丰富的载体之一^[5]，微生物能通过同化作用、 异化作用改变环境条件等影响矿质元素的生物地球化学循环(如碳、 氮、 磷、 硫等)、 能量流动、 污染物形态(如重金属、 有机污染物等)^[6,7]，从而对湖泊水生生态系统稳定和恢复产生重大影响，湖泊微生物群落结构也被认为是衡量湖泊生态系统稳定性的重要指标; 二是因为目前虽然对富营养化湖泊沉积物微生物研究较多，如对不同富营养程度湖泊沉积物微生物的调查^[8]、 对同一湖泊不同富营养区域的沉积物微生物调查^[9]，但由于不同湖泊沉积物微生物或同一湖泊不同区域微生物本身可能存在较大差异，这些调查结果并不能如实反映湖泊富营养化对微生物的实际影响; 三是因为湖泊富营养化的控制和治理需要微生物的参与，只有了解了湖泊富营养化对微生物的实际影响，才能更好地调控微生物的种群结构与功能，为湖泊富营养化的生物治理和控制提供支持.

湖泊水华存在复杂的生消过程，从水华生物少量出现的水华形成前期到生物日趋丰富的水华形成期、 水华持续期、 水华消亡期，涉及到不同的物理、 化学、 生物等过程^[10]. 每个阶段又因蓝藻生物量及其生长代谢不同而对水质产生不同的影响. 虽然水华主要发生在上覆水，但其影响却波及沉积物^[11,12]. 如王钦等^[13]发现太湖梅梁湾水华发生时的沉积物Eh明显低于未暴发期，而这可能影响沉积物微生物的群落结构，因为微生物对Eh、 pH变化较为敏感. 所以，水华形成、 持续和消亡不同阶段可能对沉积物微生物有不同的影响. 然而，现有研究很少从水华生消过程角度研究沉积物微生物的变化，这不但不利于深入评价水华对湖泊水生生态系统的影响，而且也有碍于利用沉积物微生物改善湖泊环境.

巢湖是我国污染最重的三大淡水湖泊之一，近年来蓝藻暴发性繁殖引起的大面积水华每年都持续很长时间，处于过度富营养状态，虽然使用多种手段，但巢湖富营养化、 水华问题依然严重^[14]. 本研究以浅水湖泊巢湖为对象，于2012年5月水华发生前开始取沉积物和上覆水样品，历经水华形成前期、 水华形成期、 水华持续期和水华消亡期，通过PCR-DGGE方法分析不同水华期沉积物微生物的群落结构差异，判断巢湖水华生消过程对沉积物微生物群落结构的影响. 1 材料与方法 1.1 样品的采集

依据巢湖历史资料确定采样时间和地点，采样时间要覆盖水华形成前期、 形成期、 持续期和消亡期，采样地点要分布在水华区(处理)和非水华区(对照). 样品采集工作共进行了8次，时间分别为: 5月15日(水华前期)、 6月20日(水华形成期)、 7月10日、 7月20日、 8月1日、 8月22日、 9月5日(水华持续期)、 9月19日(水华消亡期). 在水华区和非水华区均设置5个采样点，但每个区域最终有3个采样点符合实验要求，即持续水华或持续非水华. 其中位点1、 2、 3为水华区域，位点4、 5、 6为非水华区域，采样点位分布见图 1.

图 1

Fig. 1

图 1 巢湖水华区和非水华区采样点示意 Fig. 1 Sampling sites in the algal bloom region and the non-algal bloom region of Chaohu Lake

利用彼得森采泥器采集表层10 cm沉积物样品，以每个样点为中心采集3个平行样，现场混为一个样品，这样每个采样点只有一个待测样品，本研究中6个采样点共6个样品，水华区和非水华区各3个. 混合样立即装入密封袋内避光储存，紧急运回实验室把样品分为2份，一份在-20℃冷冻保存，用于微生物PCR-DGGE分析，另一份冷冻干燥，用于测定沉积物的理化性质. 同时利用不锈钢采水器采集水面下0.5 m处的水样，每个点位也同样采集3个平行样，现场混匀后收集1 L作为该样点的水样，放入4℃保温箱中保存，并在48 h内测定Chl-a. 1.2 分析方法 1.2.1 叶绿素的测定

Chl-a采用丙酮24 h提取法进行测定^[15]. 1.2.2 微生物PCR-DGGE分析

采用MOBIO Power Soil DNA提取试剂盒提取沉积物样品的基因组DNA.

PCR扩增参见文献^[16]: ① 引物: 采用对大多数细菌和古生菌的16S rDNA基因V3~V5区具有特异性的引物对357F-GC(5′-GC-clamp-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和517R(5′-ATT ACCGCG GCTGCTGG-3′). GC-clamp序列为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGG-3′. ② PCR反应体系: 10×Buffer 5 μL、 200μmol ·L^-1的dNTP 4 μL、 1.5mmol ·L^-1的MgCl₂ 4 μL、 10μmol ·L^-1的正反向引物各1 μL、 模板DNA 40～50 ng、 Ex Tag(Takara，大连)1.5 U、 灭菌超纯水补齐至50 μL. ③ PCR反应条件: 94℃ 预变性 5 min; 94℃ 预变性1 min，48℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min，30 个循环; 最后72℃ 延伸10 min. PCR反应的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测.

变性梯度凝胶电泳(DGGE): 采用Bio-Rad公司Dcode^TM的基因突变检测系统对 PCR 反应产物进行分析. 使用梯度胶制备装置，制备变性剂浓度从50%~70%的聚丙烯酰胺凝胶. 将纯化后的PCR产物与缓冲液按5 ∶1混合，加入到凝胶的加样孔中，在100 V的恒定电压、 60℃ 恒温下电泳10 h. 电泳完毕后，将凝胶在EB中染色20～30 min，使用凝胶成像分析系统(Bio-Rad)对染色后的凝胶进行观察、 拍照，采用Quantity One分析软件(Bio-Rad)分析沉积物样品中电泳条带的数目和亮度来评估不同深度层湖泊沉积物样品的微生物群落的多样性和丰富度. 1.2.3 Shannon-Wiener多样性指数(H′)

各字母代表的意义同1.2.3节. D指数越大，优势菌群生物量占总生物量比重越小，反之则优势菌群生物量占总生物量比重越大. 1.2.5 相似度聚类分析

根据PCR-DGGE电泳条带对比的结果，通过戴斯系数C_s(Dice coefficient)计算出各样品相似性的数值化矩阵. 利用相似性矩阵数据，通过UPGMA(The unweighted pair group method with arithmetic averages)算法实现聚类分析，生成系统树. 1.3 统计分析

数据处理时，除图 2选取样点1和6为代表，其他参数均是分别对水华区(样点1、 2、 3)和非水华区(样点4、 5、 6)3个样品的测试值取平均值和标准偏差. 通过SPSS 13.0的Duncan分析方法进行差异显著性检验(α=0.05). 2 结果与分析 2.1 水华生消过程的判断

水华发生的最显著特征是藻类暴发性生长，本研究以反映藻类浓度的最常用指标——叶绿素a(Chl-a)含量作为判断水华形成过程的依据. Nürnberg^[17]认为水体Chl-a含量超过25 mg ·m^-3即进入轻度水华，而郑建军等^[18]认为水体Chl-a含量超过30 mg ·m^-3为轻度水华状态，本研究以30 mg ·m^-3作为评判水华是否发生的标准.

从图 2可以看出，在整个研究期，非水华区水体Chl-a含量变化不大，所有水样的Chl-a含量都低于20 mg ·m^-3，表明非水华区一直没水华发生. 而在水华区，除5月15日和9月19日外其他时段的水样Chl-a含量均显著高于30 mg ·m^-3且远高于非水华区，表明水华区有明显的、 持续性的水华现象. 水华区水体Chl-a含量随时间波动较大，可能与多次水华的生消叠加、 气候条件变化(如风力、 风向、 降雨、 人为扰动等)有关. 藻类生长周期较短，一般为1~3周左右，所以看似周期较长的水华其实是多个短期水华的生消过程叠加. 7月10日和8月1日水体Chl-a含量骤然降低，主要是因为7月10日受大风和降雨影响较大(当天风力达到了4～5级，并伴有雷阵雨)，8月1日受双台风“苏拉”和“达维”影响较大，Chl-a被稀释.

图 2

Fig. 2

不同小写字母表示水华区Chl-a浓度在P=0.05水平上差异显著， 不同大写字母表示非水华区Chl-a浓度在P=0.05水平上差异显著 图 2 巢湖水华区和非水华区水体Chl-a含量随时间的变化 Fig. 2 Changes of water Chl-a concentration over time in the algal bloom region and the non-algal bloom region of Chaohu Lake

从水华生消过程来看，水华区水体的Chl-a含量从5月15日低于30 mg ·m^-3到6月20日显著高于30 mg ·m^-3，表明5月15日前水体处于水华形成前期，5月15日~6月20日处于水华形成期，6月20日~9月5日，Chl-a含量始终处于较高水平，表明水华处于持续期，而9月5日之后水体Chl-a浓度急剧下降到30 mg ·m^-3以下，表明水华处于消亡期. 2.2 水华生消过程对沉积物微生物群落结构的影响 2.2.1 沉积物微生物PCR-DGGE谱图分析

本研究测试了所有位点样品沉积物的PCR-DGGE，水华区和非水华区的结果分别具有类似趋势，仅以位点1和位点6的结果为代表进行阐述.

图 3

Fig. 3

图 3 巢湖非水华区和水华区沉积物样品PCR-DGGE示意 Fig. 3 PCR-DGGE profiles of the sediment samples taken from the algal bloom region and the non-algal bloom region of Chaohu Lake

从图 3(a)可以看出，在整个研究期间，非水华区沉积物中大致出现了25种优势菌群，不同采样时间DGGE谱图的条带数虽有一定差异但并不大，说明沉积物中微生物群落种类和结构随时间发生了一些变化，可能主要与温度变化有关. 整体上看，样品中的条带呈现4种变化趋势: ①部分条带在整个调查过程中基本都存在，只是丰度(条带亮度)有差异，如7、 8、 16、 17、 19、 21、 22、 23、 27、 31号条带，说明这些条带代表的微生物菌群在整个调查过程中一直为优势菌群; ②部分条带随着时间增加逐渐消失，如1、 2、 3、 4、 29号条带，表明这些条带指示的微生物数量逐渐下降; ③部分条带在取样初期未出现，但在后期样品中明显出现，如5、 11、 20、 26、 28、 29、 30、 32号条带等，说明这些条带指示的微生物随着温度升高，活性增强，开始快速生长繁殖，逐渐成为优势菌群; ④还有部分条带，仅仅出现在中间的几次样品中，如12、 15、 25、 29号条带. 需要指出的是，风浪的影响导致7月10日一些条带暂时消失，如6、 18、 28、 31号条带等，可能是由于风浪扰动增加了沉积物溶解氧含量，对厌氧微生物产生了一定抑制作用，或者风浪扰动使表层沉积物进入水体，而非表层沉积物微生物种类较少; 9月5日和9月19日一些条带消失，如4、 9、 10、 12、 24、 29号等，可能与温度降低有关，一些适宜在较高温度下生长的微生物逐渐减少，不再成为优势菌群.

从图 3(b)可以看出，在整个研究期间，水华区不同时期的样品中条带数量差别较大，说明沉积物微生物群落结构变化较大，优势菌群的更替较频繁，这可能与温度、 水华不同阶段导致的环境条件变化等有关. 水华区条带数总体呈先增后减的变化趋势. 采样初期的5月15日只出现了9个条带，而到6月20日时已经增长到了20个条带，如5、 8、 9、 21、 32号等都是新增条带，说明随着温度的升高微生物活性明显增强，开始大量生长繁殖，优势菌群数逐渐增多; 7月10日条带数急剧降低，可能是由于当天风浪扰动致使沉积物溶解氧升高，导致厌氧微生物数量骤降所致，或者由于表层沉积物溶入水体，次表层沉积物微生物数量较低所致; 7月20日～8月22日是条带数最多的时间段，也是温度较高和藻类生物量较大的阶段，可能由于藻类大量生长产生的极端厌氧环境为厌氧微生物生长繁殖提供了良好的环境，同时死亡藻类的沉降也为各种微生物提供了种类繁多的有机营养物质，为多种菌群的快速生长繁殖提供了适宜的条件; 然而随着温度的降低和水华的消亡，9月5日和9月19日优势菌群数明显下降.

根据水华区和非水华区沉积物样品DGGE谱图的分析可以看出，水华区沉积物微生物群落结构变化要比非水华区大得多，非水华区有10个条带在整个调查过程中一直存在，而水华区只有1个条带(18号条带)一直存在; 非水华区最大条带数和最小条带数之间只差6个条带，水华区相差高达22个条带. 这些结果表明，水华对沉积物微生物群落结构有较大影响. 2.2.2 沉积物微生物Shannon-Wiener多样性指数分析

Shannon-Wiener多样性指数反映了基于物种数量的群落种类多样性，指数越大表明群落的复杂程度越高. Shannon-Wiener多样性指数的大小取决于条带数目、 条带信号强度以及分布均匀程度，是反映微生物菌群数及其生物量和分布均匀情况的综合指标^[19]. 从图 4可以看出，非水华区Shannon-Wiener指数随时间变化不大，说明沉积物微生物群落结构相对稳定. 非水华区微生物群落结构相对波动主要受自然条件变化的影响，如温度、 风浪、 沉积物TOC变化等，但这些变化不大，不能显著改变微生物的群落结构. 然而在水华区，除去7月10日特殊天气影响，Shannon-Wiener指数呈现先增加(7月20日前)后稳定(7月20日至8月22日)再下降的趋势(9月5日后). 在水华形成前期，水华区Shannon-Wiener指数显著低于非水华区，可能与水华区长期受水华暴发的影响，抑制了部分微生物的生长，从而导致微生物多样性下降; 7月20日后，水华的持续、 水温的升高使沉积物中更多厌氧微生物得以快速繁殖，Shannon-Wiener多样性指数升高，而非水华区只受温度变化的影响，多样性指数变化较小; 在水华消亡期(9月19日)，藻类大量死亡、 温度下降，水华区Shannon-Wiener多样性指数又低于非水华区. 同时，这也意味着，虽然水华区和非水华区在部分时段Shannon-Wiener指数相差不大，但微生物多样性构成差别却可能很大.

图 4

Fig. 4

图 4 巢湖水华区和非水华区沉积物微生物Shannon-Wiener多样性指数随时间的变化 Fig. 4 Changes of microbial Shannon-Wiener diversity index in sediment over time in the algal bloom region and the non-algal bloom region of Chaohu Lake

本研究选取的巢湖水华区连续十余年发生水华，每年蓝藻大量死亡，导致沉积物有机质含量远高于非水华区(数据未列出)，但Shannon-Wiener指数并没有显著高于非水华区，这似乎有悖于前人“ 有机质含量越高微生物群落结构多样性越高” 的结论^{[8, 19, 20]}. 这可能与水华暴发胁迫因素的长期存在有关，以前的结果多基于常规条件下有机质与微生物多样性的关系.

图 5

Fig. 5

图 5 巢湖水华区和非水华区沉积物微生物Simpson优势度指数随时间的变化 Fig. 5 Changes of microbial Simpson dominance index in sediment over time in the algal bloom region and the non-algal bloom region of Chaohu Lake

Simpson优势度指数体现了优势物种生物量占群落生物总量的比重，该指数越大表明优势菌群生物量占总生物量比重越大，反之则优势菌群生物量占总生物量比重越小. 从图 5可以看出，非水华区沉积物微生物Simpson指数随时间变化不大，处于轻微的波动，表明优势种更替不明显. 在水华区，水华形成前期Simpson指数较高，这可能是由于多年水华暴发抑制了部分微生物的生长，多样性下降，导致部分微生物成为优势种. 但随着水华的形成及暴发，Simpson指数下降至非水华区水平，表明微生物优势种种类增加，这可能因为随着温度升高，水华暴发，各种微生物活性都增强，总生物量不断增大，优势菌群数也增多，优势菌群生物量占总生物量的比重在下降，Simpson优势度指数也随之降低. 7月10日Simpson指数较高主要是因为特殊天气事件所致. 2.2.4 沉积物微生物群落相似性分析

对DGGE谱图每个样品的电泳条带进行微生物群落相似性程度聚类分析，结果见图 6. 可以看出，非水华区相似度最高的是7月20日和8月1日，为85.9%，相似度最低的是7月10日和8月1日，为32.7%. 以60%的相似度分类，所有微生物可分为3个群: 第一个群: 5月15日，第二个群: 6月20日、 7月10日和8月22日，第三个群: 7月20日、 8月1日、 9月5日和9月19日. 温度可能是导致微生物分群的主要因素，因为第一个群的微生物以5月15日样品为主，第二个群的微生物以6、 7月的样品为主，而第三个群的微生物以8、 9月样品为主，正好与温度变化相一致. 8月22日数据较异常可能与其他因素有关.

图 6

Fig. 6

图 6 巢湖非水华区和水华区沉积物微生物相似度分析 Fig. 6 Similarity analysis for sediment microbes in the algal bloom region and the non-algal bloom region of Chaohu Lake

水华区微生物群相似度最高的是7月20日和8月1日，为79.8%，相似度最低的是5月15日和7月10日，为13%. 以60%的相似度分类，所有微生物可分为4个群，第一个群: 5月15日，第二个群: 7月10日，第三个群: 6月20日、 7月20日、 8月1日和8月22日; 第四个群: 9月5日和9月19日. 温度和水华发生时期的变化是导致微生物分群的主要原因. 第一个群以5月15日样品为主，可能主要由最适生长温度为低温的微生物组成; 第二个群以7月10日样品为主，可能主要以兼氧或好氧微生物为主，沉积物受大风扰动的影响，厌氧程度下降，同时表层沉积物可能溶解进水体，取到的沉积物样品为次表层样; 第三个群以水华持续期样品为主，微生物可能多属于厌氧微生物; 第四类微生物以水华消亡期样品为主. 3 结论

(1)从5月中旬开始，水华区藻类开始快速生长，Chl-a浓度增加，6月20日左右水华形成，持续至9月5日后开始消亡，Chl-a浓度出现较大波动，但都高于30 mg ·m^-3; 而相同时期非水华区藻类浓度始终低于20 mg ·m^-3.

(2)PCR-DGGE分析显示，非水华区微生物群落结构相对稳定，有10个条带在整个调查过程中一直存在，样品间条带数最大相差6个; 水华区沉积物微生物群落结构随水华生消过程变化明显，只有1个条带(18号条带)在所有样品中一直存在，样品间条带最大相差22个，5月和9月的微生物多样性远低于6～8月，可能与水华暴发和环境温度变化有关.

(3)水华区Shannon-Wiener指数在水华形成和持续初期(7月20日前)低于非水华区，在水华持续后期则高于非水华区，而在水华消亡期则呈低于非水华区的趋势; Simpson指数随水华生消过程呈现出与Shannon-Wiener指数相反的变化趋势. 此外，水华区的微生物相似性程度明显低于非水华区，表明水华生消过程显著影响微生物的种群结构和多样性.