2. 广东省微生物研究所, 省部共建华南应用微生物国家重点实验室, 广东省菌种保藏与应用重点实验室, 广州 510070
2. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China
自ANAMMOX被发现以来[1],各国研究者对其进行了多方面的深入研究,目前取得了一系列的成果. 研究表明厌氧氨氧化菌具有生长缓慢[2]、 对环境要求苛刻[3]、 需要严格厌氧[4]等特性. 厌氧氨氧化菌能否富集、 厌氧氨氧化污泥的驯化和厌氧氨氧化反应能否快速启动并高效平稳运行,与所采用的反应器类型和工艺操作方式直接相关[5],因此选择的反应器非常重要. 国内外学者采用了多种反应器进行厌氧氨氧化研究,主要有序批式反应器(SBR)[6]、 升流式厌氧污泥床反应器(UASB)[7]、 推流式反应器[8]、 厌氧序批式反应器(ASBR)[9]、 气提式反应器[10]、 (EGSB)[11]、 固定床反应器(FBR)[12]等,均实现了厌氧氨氧化,但厌氧折流板反应器(ABR)应用厌氧氨氧化甚少报道[13].
尽管厌氧氨氧化为新型的脱氮新技术,具有良好的应用前景,但是以往主要对高氨氮、 低碳氮比模拟无机废水的理论进行研究,导致应用范围窄. 厌氧氨氧化工艺的应用早期多集中在高浓度氨氮废水的处理上,主要包括消化污泥上清液[14]、 焦化废水[15]、 猪场废水[16]和垃圾渗滤液[17],对低浓度氨氮废水的处理和碳氮比较高的废水处理报道不多. 近年来,随着厌氧氨氧化研究的深入,厌氧氨氧化工艺逐渐应用于鱼肉罐头加工废水[18]、 制药废水[19]、 石化废水[20]、 光电工业废水[21]、 温室甲鱼养殖废水[22]、 低浓度生活污水[7]等多种废水的处理,取得了较满意的效果. 但到目前为止,尚未有厌氧氨氧化工艺应用于制革废水的报道.
以往的研究发现,影响厌氧氨氧化的因素主要包括溶解氧[2]、 pH值[2,23]、 温度[24]、 有机物浓度[25,26]、 高浓度氨和亚硝酸盐[27]、 有毒有害物质[28]等. 但如何优化值得深入研究.
本研究利用新型高效厌氧反应器ABR进行厌氧氨氧化研究,首次应用于制革废水处理中,以期为ABR厌氧氨氧化反应器处理制革废水工艺提供技术参考. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验装置
本试验采用ABR小试装置. ABR反应器中每个隔室长100 mm,宽150 mm,高300 mm,有效容积3.6 L. 根据需要使用4~6个隔室,本试验中使用了4个隔室(见图 1). 避光并在室温(25~30℃)的条件下驯化和运行.
![]() | 图 1 ABR厌氧氨氧化试验工艺流程示意 Fig. 1 Schematic of ANAMMOX ABR reactor |
厌氧氨氧化接种污泥由取自处理高浓度氨氮污水的厌氧污泥与河涌底泥混合而成,污泥床约占反应器容积的60%. 1.1.3 试验用水
(1)模拟废水
反应器污泥厌氧氨氧化在驯化阶段和启动期间试验用水为人工配制的模拟废水,模拟废水成分参考文献[29],其组成(mg ·L-1)为:NaHCO31 250,MgSO4 ·7H2O 300,CaCl2 ·2H2O 180,KH2PO4 27. 微量元素溶液Ⅰ1 mL ·L-1,微量元素溶液Ⅱ1 mL ·L-1,NH4+-N和NO2--N分别以NH4Cl 和NaNO2 提供,按需配置. 其中微量元素溶液Ⅰ(mg ·L-1)的组成为:EDTA 5000,FeSO4 ·7H2O 5000; 微量元素溶液Ⅱ(mg ·L-1)的组成为:ZnSO4 ·7H2O 430,CoCl2 ·6H2O 240,MnCl2 ·4H2O 990,CuSO4 ·5H2O 250,NiCl2 ·6H2O 190,H3BO 314.
(2)制革废水水质
厌氧氨氧化启动后,采用制革废水进行试验. 2种废水用于本试验:取自经物理化学方法处理的制革厂废水和经小试生化处理装置(依次为UASB脱硫、 小试ABR脱色降解和微曝气)处理的制革厂废水,水质情况如表 1所示.
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表 1 制革废水水质 Table 1 Quality of tannery wastewater |
pH采用3210手提式pH测定仪(德国WTW公司)测定,NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法,NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法,COD采用重铬酸钾法[30]. 1.2.2 反应器污泥的驯化和厌氧氨氧化的启动
反应器污泥驯化阶段采用逐步提高负荷的运行方法进行:固定适宜的进水基质浓度,采用缩短水力停留时间 (HRT) 的方式提高反应器氮容积负荷. 每次缩短HRT,监测NH4+-N、NO2--N浓度以及pH值,根据NH4+-N、NO2--N浓度的去除率、pH值的变化、污泥情况等指标来决定下一个运行时间. 1.2.3 制革废水对厌氧氨氧化ABR反应器的冲击影响试验
取经小试UASB脱硫、 小试ABR脱色降解、 微曝气后的制革厂废水出水混合人工配制的模拟废水配成进水和制革厂废水(未经生化处理,按比例加入NaNO2),采用逐渐增加制革废水含量(提高废水浓度)的方式来驯化和试验制革废水对厌氧氨氧化ABR反应器的冲击影响. 1.2.4 ABR污泥的厌氧氨氧化活性恢复
用模拟配水按1.2.2节的方法对ABR的厌氧氨氧化功能进行活性恢复. 活性恢复后采用人工配制的模拟配水与经亚硝化过程处理后的制革废水混合水作为厌氧氨氧化ABR的进水,采取固定水力停留时间,逐步提高负荷的方法进行重新驯化. 1.2.5 厌氧氨氧化ABR处理制革废水效果的影响因素研究
考察不同水力停留时间、 基质浓度对厌氧氨氧化ABR处理效果的影响. 1.2.6 污泥样品扫描电镜观察
制样步骤:3%戊二醛固定,经30%、 50%、 70%、 90%、 100%乙醇逐级脱水后,乙酸异戊酯置换2次,临界点干燥,贴台,喷金.
电镜观察和拍照:采用日立S-3000N扫描电镜观察样品并拍照. 1.2.7 荧光原位杂交分析
采用Amx820探针(AAAACCCCTCTACTTAG TGCCC)进行FISH 试验[31]. 样品固定和杂交按参考文献[32]进行. 用Leica DM RA2荧光显微镜进行原始荧光图像的采集,Leica CW4000 FISH软件进行荧光图像的合成后,使用Leica QS00IW 图像分析系统进行分析. 通过其荧光杂交面积与通用荧光探针杂交面积的比较,计算目标微生物的相对丰度.
2 结果与分析 2.1 反应器污泥的驯化和厌氧氨氧化的启动
为富集厌氧氨氧化细菌,首先采用模拟废水对反应器污泥进行驯化. 反应器污泥的驯化和厌氧氨氧化的启动初期,反应器运行的HRT为48 h,进水NH4+-N浓度约为20 mg ·L-1,平均容积负荷为0.010 kg ·(m3 ·d)-1. 该阶段反应器NH4+-N去除率甚低,NO2--N的去除率约为50%; 系统运行不太稳定,发生跑泥现象,出水混浊. 经过30 d的运行,反应器NH4+-N去除率逐渐提高,出现厌氧氨氧化活性并逐步提高,污泥流失现象减少至消失. 随着驯化进程的延续,反应器NH4+-N和NO2--N的去除率稳步上升. 将NH4+-N和NO2--N容积负荷分别提高到0.040 kg ·(m3 ·d)-1和0.037 g ·(m3 ·d)-1 时,从图 2可以看出,NH4+-N去除率为54.7%~83.6%,平均为70.1%,NO2--N去除率为83.2%~99.2%,平均为90.1%,NH4+-N与NO2--N的去除量之比为1 ∶1.15. 该阶段出水清澈. 从反应器内取出污泥进行观察,发现具有明显特征的颗粒污泥,污泥颜色也从黑色转变为棕红色或红色,这与文献[8,29,33]观察到的厌氧氨氧化污泥颜色相似. 同时出水pH值高于进水(见图 3). 综合该阶段的ABR反应器的处理效果、 NH4+-N与NO2--N的去除量之比、 厌氧氨氧化污泥颜色特征和进出水pH值,表明厌氧氨氧化ABR已启动.
![]() | 图 2 厌氧氨氧化启动过程中NH4+-N和NO2--N去除效果曲线 Fig. 2 Performance of ABR in ammonia nitrogen and nitrite nitrogen removal during the start-up process |
![]() | 图 3 厌氧氨氧化启动过程中ABR反应器进出水pH值的情况 Fig. 3 The pH of influent and effluent in ANAMMOX ABR during the start-up process |
模拟废水厌氧氨氧化ABR启动成功后,采用逐步提高废水的浓度的方法对经过脱硫、 脱色段和微曝气生化处理过的制革废水进行驯化和处理. 厌氧氨氧化ABR反应器处理低浓度的制革废水时,废水中的COD和NH4+-N的去除率维持较高的水平. 随着废水浓度的提高,反应器对COD和NH4+-N的处理效果逐渐下降,到第7 d时, 当采用100%的制革废水(未经脱硫、 脱色段生化处理过的制革废水)为进水时,其出水变得混浊,反应器失去厌氧氨氧化作用. 尽管如此,在提高废水的浓度的过程中,反应器对NO2--N的去除率维持在80%以上的较高水平(图 4).
![]() | 图 4 制革废水对厌氧氨氧化ABR反应器冲击影响试验 Fig. 4 Performance of ANAMMOX ABR under impact of an increased concentration of tannery wastewater |
输入不含有机物的模拟废水,对厌氧氨氧化ABR进行活性恢复,经过20 d的持续运行,ABR的厌氧氨氧化活性恢复正常,NH4+-N和NO2--N的去除率均达到90%以上. 该过程呈现出与厌氧氨氧化驯化时类似的规律,但厌氧氨氧化活性恢复所需时间大大缩短(见图 5).
![]() | 图 5 去除NH4+-N和NO2--N的ABR厌氧氨氧化活性恢复过程 Fig. 5 Recovery process of ANAMMOX ABR for ammonia nitrogen and nitrite nitrogen removal and nitrogen removal |
根据上述的试验结果,采用人工配制的模拟废水与经亚硝化过程处理后的制革废水混合水作为厌氧氨氧化ABR的进水,采取固定水力停留时间,逐步提高负荷的方法重新进行驯化. 经过14 d的驯化,成功启动实际制革废水厌氧氨氧化的脱氮处理. 从图 6可以看出,厌氧氨氧化ABR的处理效果稳定,NH4+-N的去除率达到74.4%~93.1%.
![]() | 图 6 以制革废水驯化反应器污泥的过程中NH4+-N的去除效果 Fig. 6 Ammonia nitrogen removal performance of ANAMMOX ABR during the domestication process of tannery wastewater |
从厌氧氨氧化ABR实际应用于制革废水处理出发,本试验的目的是使启动的厌氧氨氧化ABR稳定和有效地运行. 其中HRT和基质浓度是影响厌氧氨氧化的重要因素,考察不同水力停留时间、 基质浓度对厌氧氨氧化ABR处理效果的影响,以确定合适的HRT和基质浓度.
采用在保持NH4+-N和NO2--N浓度不变的情况下,逐步缩短HRT、 提高水力负荷的方法,研究NH4+-N去除情况,结果如图 7(a)所示. 由图 7(a)可以看出,HRT由24 h缩短为12 h时,NH4+-N的去 除率达80%以上; HRT缩短至6 h时,NH4+-N的去 除率显著下降为50%,故合适的HRT为12 h.
![]() | 图 7 HRT和 NH4+-N浓度对ABR厌氧氨氧化的影响 Fig. 7 Effect of HRT and ammonia concentration on the performance of ANAMMOX ABR |
采用固定HRT,保持反应器的容积负荷,提高NH4+-N浓度的条件下 研究其对反应器的处理效果,结果见图 7(b). 在HRT为12 h的条件下,当进水NH4+-N为40 mg ·L-1时,NH4+-N去除率为85.5%,当进水NH4+-N提高到80 mg ·L-1时,NH4+-N去除率下降到76.8%,仍然处于较好的状态. 2.2.4 厌氧氨氧化ABR处理制革废水效果
根据2.2.3节的结果优化了试验条件,应用厌氧氨氧化ABR处理制革废水,结果表明:厌氧氨氧化ABR进水NH4+-N为25.0~76.2mg ·L-1,NH4+-N容积负荷为0.05~0.15 kg ·(m3 ·d)-1 时,出水NH4+-N为0.20~7.12 mg ·L-1,去除率达90.8%~99.6% [见图 8(a)]. 在去除NH4+-N的同时,COD去除效果也同样稳定. 当进水COD为131~237 mg ·L-1时,出水COD为35.1~69.2 mg ·L-1,去除率达66.9%~74.7% [见图 8(b)].
![]() | 图 8 ABR厌氧氨氧化反应器对NH4+-N和COD的处理效果 Fig. 8 Ammonium nitrogen and COD removal performance of the ANAMMOX ABR |
从处理制革废水效果稳定期(第66 d)的反应器中取出污泥,发现出现大量外表呈棕红色或棕黄色至红色、 颗粒粒径以2~3 mm为主的颗粒污泥(见图 9). 从图 9可以看见,第1隔室、 第2隔室的颗粒污泥呈棕红色或棕黄色,而第3隔室、 第4隔室的颗粒污泥明显比第1、 第2隔室的颜色要深,呈棕红色或棕黄色,部分颗粒污泥呈红色. 各隔室的颗粒污泥其粒径大小没有明显的区别.
![]() | 图 9 厌氧氨氧化颗粒污泥的实物 Fig. 9 Photos of the granular sludges |
为了解颗粒污泥中厌氧氨氧化微生物的形态特征,采用电镜扫描观察厌氧氨氧化颗粒污泥. 从图 10可以看出,培养出的厌氧氨氧化颗粒污泥中以丝状菌和球状菌为主,也存在部分杆状菌. 其中球状菌菌体呈不规则椭球形,簇生,其大小<1 μm,并且出现颗粒化. 这些都与典型的厌氧氨氧化菌形态相似. 有些菌体表面覆盖着黏性物质,推测是厌氧氨氧化细菌在代谢过程中分泌的胞外多聚物. 此外可观察到颗粒污泥表面有大量菌丝存在.
![]() | 图 10 厌氧氨氧化颗粒污泥的电镜照片 Fig. 10 SEM micrographs of cultivated granular sludge |
在采用电镜扫描观察厌氧氨氧化颗粒污泥的同时,对厌氧氨氧化污泥样进行荧光原位杂交分析,结果见图 11,厌氧氨氧化的效率逐渐提高,厌氧氨氧化菌的丰度在此过程中出现不同程度的增加,探针Amx820检测到4个隔室的厌氧氨氧化菌丰度分别为9%、 8%、 12%和30%,其中第1隔室、 第2隔室厌氧氨氧化菌有所增加,第3隔室、 特别是第4隔室厌氧氨氧化菌的数量明显增多,所占比例增大. 这一分布规律与颗粒污泥的颜色、 电镜观察和分析的结果一致.
![]() | 图 11 FISH检测驯化污泥中厌氧氨氧化菌丰度变化 Fig. 11 SEMAbundance variation of ANAMMOX bacteria in sludge detected by FISH |
反应器污泥厌氧氨氧化启动的初期,反应器出水NH4+-N浓度高于进水NH4+-N浓度; NO2--N的去除率约为50%. 这与唐崇俭等[34]和Chamchoi等[35]研究启动厌氧氨氧化反应时,在驯化初期发现出水NH4+-N浓度高于进水的情况一致.
随着驯化时间的推进,厌氧氨氧化得以启动. 具体表现为NH4+-N去除率逐步提高,驯化后期反应中NH4+-N与NO2--N的消耗量比值约为1 ∶1.15,接近Strous等[2]和van de Graaf 等[29]得出NH4+-N与NO2--N去除量的理论比值(1 ∶1.32) 的水平,也与相关报道[36]相似. 另外,反应器的出水pH大于进水pH,通过pH的变化可推断反应器进行ANAMMOX反应[8,37,38]; 此外,接种污泥由黑色转为棕红色或深红的颗粒污泥,这些特征可认为已成功启动厌氧氨氧化反应[38] . 3.2 厌氧氨氧化ABR处理制革废水的研究
根据ABR厌氧氨氧化反应器处理制革废水的试验结果,有机物 (COD)的高低对厌氧氨氧化反应存在影响. 一方面反应器中的NO3--N可以被异养菌还原为NO2--N,从而为厌氧氨氧化菌所利用,增强反应器的处理效果. 但由于制革废水中含有大量有机物,COD浓度较高. 有机物的加入,有利于异养菌大量生长,异养菌可以和厌氧氨氧化菌竞争NO2--N作为电子受体,从而限制厌氧氨氧化反应[39]. 在本试验中当COD高于500 mg ·L-1时,厌氧氨氧化反应明显受到抑制,而当COD高于1000 mg ·L-1时,厌氧氨氧化反应完全受到抑制. NH4+-N的厌氧氨氧化率不断降低,而NO2--N的还原率上升或处于平稳状态(达80%),NH4+-N与NO2--N的消耗量之比远小于理论值1 ∶1.32. 因此,进水COD增大到一定程度使反应器内的主导反应类型由厌氧氨氧化向反硝化转变,这与Du等[6]和Chamchoi等[40]的结果类似. 但在去除高浓度有机物(表现为高浓度COD)后,ABR中的污泥厌氧氨氧化活性迅速恢复,一方面是ABR中的颗粒污泥有一定的有机物冲击负荷,另一方面ANAMMOX菌仅受到抑制而并未真正死亡,因此,这种抑制是可逆的,只要条件合适,ANAMMOX菌即可快速恢复厌氧氨氧化功能,这与文献[6,41,42]的研究结果类似.
通过优化条件,厌氧氨氧化ABR处理制革废水取得良好的效果. 由于实际废水的缘故,水质的波动大,但厌氧氨氧化ABR处理效果稳定,在去除NH4+-N的同时也有效去除废水中的COD. 厌氧氨氧化ABR成功应用于实际废水处理,可为制革废水和其他废水的处理提供技术参考. 3.3 污泥特征和微生物分析
与模拟废水驯化的颗粒污泥相比,制革废水处理反应器的颗粒污泥颜色没有以模拟废水驯化的颗粒污泥的颜色鲜红,但更为密实. 这与制革废水的水质相关,与Park等[43]的研究结果相类似.
扫描电镜图片显示颗粒污泥以丝状菌和球状菌为主,也存在部分杆状菌,这种情况与其他研究者对厌氧氨氧化细菌的描述一致[19,44]. 菌体表面覆盖着黏性物质,推测是厌氧氨氧化细菌在代谢过程中分泌的胞外多聚物. 国内外研究者也观察到同样的现象[19,30,35]. 胞外多聚物对厌氧氨氧化细菌形成颗粒污泥起稳定的作用[45].
ABR形成整体上为推流式(PF),局部区域为完全混合式(CSTR)的多个反应器串联的工艺. 一方面颗粒污泥的形成为厌氧氨氧化细菌的增殖提供了良好的环境,使得厌氧氨氧化细菌成为形成优势,从而使污泥转为棕红色或棕黄色直至红色. 另一方面,由于ABR的推流式工艺,不同的隔室其厌氧程度不同,ABR中前段的隔室由于进水带来的氧气造成厌氧程度较低,后段的隔室因为前段的隔室中的兼性微生物已将带进的少量氧气消耗掉,还原电位变得更低,比前段的隔室更有利于厌氧氨氧化细菌的生长,导致后段隔室的厌氧氨氧化菌的数量更多. 本试验中从颗粒污泥外观观察、 电镜扫描和FISH的结果均证实了这一现象. 4 结论
(1)采用ABR以模拟废水成功启动厌氧氨氧化反应并在反应器中形成棕红色和红色颗粒污泥,将NH4+-N和NO2--N容积负荷分别提高到140 g ·(m3 ·d)-1和130 g ·(m3 ·d)-1 时,NH4+-N去除率为54.7%~83.6%,平均为70.1%; NO2--N去除率为83.2%~99.2%,平均为90.1%. 因此 ABR可作为实现厌氧氨氧化的良好反应器.
(2)厌氧氨氧化ABR反应器可有效处理制革废水,当进水NH4+-N为25.0~76.2mg ·L-1、 NH4+-N容积负荷为0.05~0.15 kg ·(m3 ·d)-1时,出水NH4+-N为0.20~7.12 mg ·L-1,去除率达90.8%~99.6%; 在去除NH4+-N的过程中,厌氧氨氧化ABR同时也有效去除废水中的COD. 当进水COD为131~237 mg ·L-1时,出水COD为35.1~69.2 mg ·L-1,去除率达66.9%~74.7%.
(3)利用常规的水质分析方法结合分子生物学FISH方法以及电镜扫描的方法研究了反应器中污泥的厌氧氨氧化运行过程及其厌氧氨氧化菌的分布状况. 经过启动和运行,污泥中厌氧氨氧化菌所占比率大为提高,ABR反应器4个隔室的污泥中厌氧氨氧化菌所占比率分别为9%、 8%、 12%和30%,并呈现出前段隔室少、 后段隔室多的分布规律. 常规方法结合现代分子生物学新技术可为厌氧氨氧化反应器的启动和运行提供指导.
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