环境科学  2014, Vol. 35 Issue (12): 4589-4595   PDF    
引用本文
李侃竹, 吴立乐, 黄圣琳, 何势, 刘振鸿, 薛罡, 高品. 污水处理厂中红霉素抗药性基因的污染特征及选择性因子[J]. 环境科学, 2014, 35(12): 4589-4595.
LI Kan-zhu, WU Li-le, HUANG Sheng-lin, HE Shi, LIU Zhen-hong, XUE Gang, GAO Pin. Investigation of Pollution Characteristics of Erythromycin Resistance Genes in a Sewage Treatment Plant and the Relevant Selective Factors[J]. Environmental Science, 2014, 35(12): 4589-4595.
污水处理厂中红霉素抗药性基因的污染特征及选择性因子
李侃竹 , 吴立乐, 黄圣琳, 何势, 刘振鸿, 薛罡, 高品     
东华大学环境科学与工程学院, 上海 201620
收稿日期: 2014-05-11; 修订日期: 2014-06-11.
基金项目： 国家自然科学基金项目（51208086，51178093）；上海市浦江人才计划项目（13PJ1400100）；中央高校基本科研业务费专项（14D111312）；东华大学"励志计划"项目（14D211301）
作者简介：李侃竹（1990~），女，硕士研究生，主要研究方向为水污染控制及水质安全，E-mail：1010207544@qq.com
通讯联系人,李侃竹,E-mail: 1010207544@qq.com;高品,pingao@dhu.edu.cn
摘要：采用固相萃取-高效液相色谱串联质谱（SPE-HPLC-MS/MS）检测分析了上海某污水处理厂中12种不同药品和个人护理品（pharmaceutical and personal care products，PPCPs）的含量水平和分布特征，采用实时荧光定量PCR方法定量检测分析了7种红霉素抗药性基因（ERY-ARGs）在污水处理厂中的分布和丰度变化. 结果表明，在污水处理厂中共检出5种PPCPs（包括磺胺甲 唑、红霉素、四环素、卡马西平和三氯生），浓度范围分别为24.5~38.7、47.5~49.2、43.1~85.4、2.5~3.9和423.2~8973.3ng·L-1. 两段A/O生物处理工艺对三氯生具有较好的去除效果，但对其余4种PPCPs的去除效果较差. 与此同时，目标ERY-ARGs在污水处理厂中均被检出，在原水中的丰度达9.28×103（ermA）~1.83×108（ereA） copies·L-1，虽然两段A/O工艺能够显著降低污水中的ERY-ARGs（1.19 log~3.97 log），但其在最终处理出水中的浓度仍然较高. 通过相关性分析可知，ERY-ARGs与红霉素和三氯生之间均具有显著相关性（P<0.05），表明污水处理厂中红霉素对ERY-ARGs的产生和传播具有重要影响，而三氯生对ERY-ARGs可能存在交叉选择性作用.
关键词： 污水处理厂     抗药性基因     PPCPs     红霉素     三氯生    
Investigation of Pollution Characteristics of Erythromycin Resistance Genes in a Sewage Treatment Plant and the Relevant Selective Factors
LI Kan-zhu , WU Li-le, HUANG Sheng-lin, HE Shi, LIU Zhen-hong, XUE Gang, GAO Pin     
College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China
Abstract: Occurrence and distribution of twelve pharmaceutical and personal care products (PPCPs) were investigated in a sewage treatment plant in Shanghai using solid-phase extraction combined with high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS/MS). Quantitative PCR (qPCR) was used to determine the distribution and removal of seven erythromycin resistance genes (ERY-ARGs). The results showed that five PPCPs including sulfamethoxazole, erythromycin, tetracycline, carbamazepine and triclosan were detected in the collected wastewater samples with concentrations in the ranges of 24.5-38.7, 47.5-49.2, 43.1-85.4, 2.5-3.9 and 423.2-8973.3 ng·L-1, respectively. During the wastewater treatment process, a significant reduction of triclosan was observed, but the removal efficiencies for the other detected PPCPs were relatively low. Additionally, all target ERY-ARGs were detected in the wastewater samples ranging from 9.28×103 (ermA) to 1.83×108(ereA) copies·L-1 in raw influent. Though significant reductions (1.19 log-3.97 log) of ERY-ARGs were obtained, their concentrations found in the final effluent were still high. Moreover, the concentration of ERY-ARGs exhibited significant positive correlation with the concentration of erythromycin and triclosan (P<0.05), respectively, elucidating that erythromycin played an important role in the occurrence and spread of ERY-ARGs, while triclosan may confer cross-selection for ERY-ARGs.
Key words: sewage treatment plant     antibiotic resistance genes     PPCPs     erythromycin     triclosan    

抗生素是一类被广泛用于治疗和预防人体和动物细菌感染的药物. 然而，越来越多的研究表明，抗生素的过量使用和误用是导致环境中抗药性基因产生、 演变和散播最为重要的原因之一[1].

红霉素(erythromycin，ERY)是一种大环内酯类抗生素，主要被用于治疗耐青霉素金黄葡萄球菌及其它敏感菌导致的感染. ERY被人体或动物体摄入后，大部分以母体结构形式排出体外，这部分未被吸收代谢的ERY最终都会进入污水而被排入城市污水处理厂进行处理. 但是，有研究报道[2,3]，传统的活性污泥法污水处理工艺对ERY去除效果较差，从而造成仍有一定数量的ERY进入地表水体，对生态环境和人体健康产生潜在的危害影响. 美国环境保护署(USEPA)也于2009年首次将ERY列为饮用水标准需要优先检测和控制的候选污染物之一[4].

污水处理厂是环境中抗生素药物的重要污染源，也被认为是抗药性基因的重要储存库，但同时也为污水处理系统对其进行集中去除提供了机会[5,6,7,8]. 目前，关于污水处理系统中抗生素药物对其抗药性细菌的选择性机制还尚不清楚[9]. 与此同时，污水本身成分复杂，一些组分如重金属和杀菌剂等对抗药性细菌还可能会产生共选择效应和交叉抗性[10,11]. 因此，深入研究抗生素及其抗药性基因在污水处理过程中的去除变化，以及相互之间的相关关系，对控制这些微污染物在环境中的迁移和散播具有重要意义.

本研究选取了12种不同药品和个人护理品(pharmaceutical and personal care products，PPCPs)作为研究对象(其中包括8种抗生素药物)，考察其在上海某污水处理厂中的去除变化和浓度分布，同时采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析手段，检测分析红霉素抗药性基因(ERY-ARGs)，包括ereA、 ereB、 mefA/mefE、 ermA、 ermB、 ermC和msrA/msrB，以及16S rRNA基因在污水处理工艺中的分布和去除情况，分析探讨了检出PPCPs与ERY-ARGs之间的相关关系，以期为揭示污水处理系统中ARGs的演变和散播过程机制提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 实验药品

本研究所选用的目标PPCPs包括：磺胺甲 唑(SMX，纯度为99%)、 环丙沙星(CIP，纯度为98%)、 四环素(TC，纯度为99%)、 土霉素(OTC，纯度为99%)、 金霉素(CTC，纯度为99%)、 强力霉素(DOC，纯度为99%)、 红霉素(ERY，纯度为99.8%)、 苯扎贝特(BZF，纯度为98%)、 卡马西平(CBZ，纯度为99%)、 布洛芬(IBF，纯度为99%)、 双氯芬酸(DIF，纯度为98%)和三氯生(TCS，纯度为99.5%)，均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司. 甲醇和乙腈为色谱纯，购自美国Honeywell Burdick & Jackson公司. 甲酸、 乙酸铵和乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司. 1.2 样品采集和预处理

污水取自上海某污水处理厂，采样时间为2013年12月~2014年3月，污水处理工艺流程及各采样点位置见图 1所示，按照污水处理流程共采集了进水(W1)、 曝气沉砂池出水(W2)、 一级A/O出水(W3)、 中间沉淀池出水(W4)、 二级A/O出水(W5)和最终二沉池出水(W6)，共采样3次，每次取两个平行样，每个样品采集量为1 L，装入聚丙烯采集瓶中迅速运回实验室进行预处理.

图 1 污水处理工艺流程示意以及取样位置 Fig. 1 Flow chart of wastewater treatment process and the sampling locations

固相萃取前，污水样先经0.45 μm再生纤维素滤膜过滤，加入500mg ·L-1 Na2EDTA以消除水中金属离子的干扰. 固相萃取小柱采用HLB小柱(500 mg/6 mL，Waters)，先使用甲醇和超纯水进行预活化，再将污水样以5 mL ·min-1的流速经过固相萃取小柱进行富集，富集完成后，加入10 mL超纯水淋洗HLB小柱，以洗脱去除一些残留的无机离子，然后真空干燥，干燥完成后采用6 mL甲醇洗脱目标PPCPs，洗脱液使用氮气吹干，最后使用甲醇定容至1 mL，装入琥珀色进样小瓶待测. 1.3 检测分析方法 1.3.1 目标PPCPs检测方法的建立

目标PPCPs采用HPLC-MS/MS(VARIAN 310)进行检测，其中OTC、 TC、 CTC、 DOC、 CIP、 ERY、 SMX和CBZ质谱检测选择电喷雾离子源正离子模式，BZF、 IBF、 DIF和TCS选择电喷雾离子源负离子模式. 目标PPCPs浓度采用外标法进行定量分析. 色谱条件如下：Welch Ultimate XB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)； 正离子模式条件下流动相A为含0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%乙腈； 负离子模式条件下流动相A为含5 mmol乙酸铵水溶液，流动相B为100%乙腈. 采用梯度洗脱模式，每个梯度完成后平衡时间为5 min，流速0.2 mL ·min-1，进样量20 μL，柱温30℃.

质谱条件如下：雾化气和锥孔气为高纯氮气，碰撞气为氩气； 喷雾针电压：5000 V(正离子模式)，4500 V(负离子模式)； 雾化气压力：55 psi； 干燥气温度：300℃(正离子模式),325℃(负离子模式)； 干燥气压力：22 psi； 毛细管电压：45 V(正离子模式),35 V(负离子模式)； 检测模式除TCS为全扫描模式外，其余化合物为多离子反应检测(MRM)扫描模式. 1.3.2 ERY-ARGs检测定量方法的建立

收集污水样过滤后的滤膜，使用TIANamp Soil DNA Kit(TIANGEN)进行DNA提取，操作步骤均参照试剂盒操作说明书，所提取的DNA完整性、 纯度和浓度分别使用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000C(Thermal Scientific)进行测定.

目标抗药性基因使用Bio-rad T100型普通PCR和Rotor-Gene 3000型qPCR(Corbett)进行定性和定量检测分析，所使用的扩增引物序列信息详见表 1. qPCR反应体系如下：10 μL SuperReal Premix Plus(2×)(TIANGEN)，上下游引物(10μmol ·L-1)各1 μL，DNA模板1 μL,7 μL ddH2O，体系总体积20 μL. qPCR反应程序如下：95℃预变性15 min,95℃变性10 s,58℃退火30 s,72℃延伸32 s，共40个循环. 每组样品3个平行样，同时使用无菌水作为阴性对照. 利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线检测PCR扩增产物的大小和特异性.

表 1 qPCR反应所使用的基因引物信息 Table 1 Sequences of primers for qPCR reactions

符合要求的扩增产物连接PSG-TS载体(BBI)，然后采用感受态细胞E.coli DH5a(BBI)进行转化. 感受态细胞进行培养后使用质粒抽提试剂盒(TIANGEN)提取出质粒作为标准品. 提取得到的质粒标准品使用NanoDrop 2000C检测浓度和纯度. 标准品梯度稀释后进行PCR反应可得标准曲线. qPCR标准曲线的扩增效率在84%~102%之间，相关系数R2均大于0.99. 1.4 数据处理

数据分析采用SPSS 19.0统计分析软件，采用线性回归进行相关性分析，计算因变量和自变量之间的皮尔逊相关系数(r)和P值，设置规定的统计检验显著性水平P=0.05，若P≤0.05，则认为具有显著相关性，反之则认为相关性不显著.

2 结果与讨论 2.1 目标PPCPs在污水处理过程中的含量水平和分布特征

图 2列出了目标PPCPs在污水处理过程中的浓度分布情况. 从中数据可以看出，在污水中共检测出5种不同的PPCPs，分别为SMX、 ERY、 TC、 CBZ和TCS，其中TCS浓度最高，达423.2~8973.3 ng ·L-1，而CBZ浓度最低，为2.5~3.9ng ·L-1，SMX、 ERY和TC浓度水平在24.5~85.4ng ·L-1之间.

图 2 目标PPCPs在污水处理过程中的浓度水平 (n=6) Fig. 2 Concentrations of target PPCPs during the wastewater treatment process(n=6)

TCS是一种广谱杀菌剂，大多数日用品如肥皂、 牙膏、 洗手液、 化妆品等中均含有不同浓度的TCS，由于其应用广泛，使用量大，从而导致大量的TCS残留进入生活污水中，这也是造成城市污水中TCS检出浓度较高的原因之一. 本研究检测发现，两段A/O生物处理工艺对污水中TCS的去除率可达95.3%，较多的研究报道活性污泥处理工艺可以通过微生物降解和污泥吸附等联合作用实现对TCS的高效去除[16,17,18].

CBZ是污水处理厂中检出频率较高的PPCPs之一，本研究检测发现CBZ在原水和最终出水中的浓度分别为2.5ng ·L-1和2.7ng ·L-1，从图 2中数据分析可知，CBZ在污水处理各工艺段出水中的浓度均要高于其在原水中的浓度，分析原因可能是在处理过程中CBZ的共轭代谢物发生聚合，也可能是污泥中的CBZ释放到水体中. 结果表明两段A/O工艺对CBZ几乎没有去除效果，这与笔者前期的检测结果相一致[19].

除此之外，两段A/O工艺对其余3种被检出的PPCPs去除率较低，去除率变化范围为3.5%~36.5%，分析原因可能是因为SMX、 ERY和TC本身在原水中浓度就较低(34.2~83.6 ng ·L-1). Li等[20]在北京某废水处理回用厂检测发现，A2/O活性污泥处理工艺对ERY的去除率约为19.5%. Xu等[21]在北京某污水处理厂检测同样发现，A2/O活性污泥处理工艺联合O3-BAF深度处理工艺对SMX的去除率也仅为26.9%. 2.2 污水处理过程中ERY-ARGs的浓度水平和分布特征

目前在不同菌属中检测发现的ERY-ARGs至少有17种[22]，但最为常见的主要有ermA、 ermB和ermC，在94%~98%的红霉素抗药性葡糖球菌中均发现含有这些基因[23]. 除此之外，ereA、 ereB、 mefA/mefE和msrA/msrB也是被检出频率较高的ERY-ARGs.

图 3为ERY-ARGs和16S rRNA基因在污水处理过程中的浓度分布情况. 从数据分析可知，所有目标ERY-ARGs均被检出，其中ereA在原水中浓度最高，达1.83×108 copies ·L-1，其次为ermB、 mefA/mefE和ereB，分别达9.02×107、 8.82×107和3.41×107 copies ·L-1，而ermA浓度最低，浓度为9.28×103 copies ·L-1.

图 3 目标ERY-ARGs在污水处理过程中的浓度水平 (n=9) Fig. 3 Concentrations of ERY-ARGs during the wastewater treatment process (n=9)

从ERY-ARGs和16S rRNA在整个污水处理工艺流程中的浓度水平变化可以看出，所有的检测基因浓度基本呈现出逐步降低的趋势，在最终处理出水中除ermA未检出外，其余ERY-ARGs的浓度水平在2.5×102(ermC)~3.5×105(ereA) copies ·L-1之间，这与Guo等[24]的研究结果类似. 其中，污水初级处理工艺(格栅+曝气沉砂池)对目标ERY-ARGs均具有一定去除作用，降低幅度为0.07(msrA/msrB)~1.02(ereB)个对数浓度； 一级A/O生物处理段能够显著地降低污水中的目标ERY-ARGs(P<0.05)，降低幅度可达0.88(ermB)~3.12(ermA)个对数浓度. 此外，从检测数据分析可知，二级A/O生物处理段对ermA去除效果显著，在处理出水中未检出，而对其它目标ERY-ARGs的去除影响要远低于一级A/O生物处理段(ermB除外)，去除变化幅度为0.08(msrA/msrB)~0.57(mefA/mefE)个对数浓度.

由上可知，虽然两段A/O污水生物处理工艺能够显著降低污水中的目标ERY-ARGs(1.19~3.97 log)，但ERY-ARGs总量在最终处理出水中的浓度仍然较高，对受纳地表水体会造成潜在的污染影响，可能会引起天然水体中ERY-ARGs背景浓度的增高. 2.3 检出PPCPs与ERY-ARGs之间相关性分析

很多研究报道，细菌抗药性的出现时由于抗生素药物对其产生的选择性压力引起的，然而在笔者的前期研究过程中发现，在活性污泥系统处理过程中，污水中四环素抗药性基因(tetO+tetW)与四环素抗生素浓度之间的相关性并不显著，而磺胺类抗药性基因sulI与磺胺类抗生素浓度之间呈现出较好的线性相关性[25]. 因此，目前关于污水处理过程中抗生素药物对其抗药性基因演变产生的选择性机制还尚不清楚[26].

表 2中分析数据显示，SMX作为一种磺胺类抗生素药物，与ERY-ARGs之间无显著相关性，而CBZ本身不属于抗生素药物范畴，与ERY-ARGs之间也无明显相关性. TC属于四环素类抗生素药物，结果显示其与msrA/msrB基因浓度之间呈现出显著相关性，而与其它ERY-ARGs浓度之间相关性不显著. 尽管如此，本研究发现所有ERY-ARGs(除ermA)与ERY之间均呈现出显著的正相关性(0.859<r<0.963，P<0.05)，并且ERY-ARGs总和也与ERY之间具有非常高的显著相关性(r=0.967，P<0.01)，这在一定程度上表明污水中ERY对ERY-ARGs的诱导产生和散播具有一定的促进作用. Wu等[27]对中国某养猪场附近土壤中四环素及其抗药性基因检测分析研究同样发现，tet基因(tetM、 tetQ、 tetO、 tetW总和)绝对拷贝数与四环素残留浓度之间具有显著相关性(r2=0.45，P<0.05).

表 2 检出PPCPs与ERY-ARGs之间相关性分析 Table 2 Correlation analysis of detected PPCPs and ERY-ARGs concentration

值得特别注意的，表 2中分析数据显示，ERY-ARGs(除ereA和ermA之外)及其基因总和与TCS之间也呈现出显著相关性(0.819<r<0.941，P<0.05). 有研究发现，TCS在具有某些非特异性杀菌机制的同时，也可以针对特定的细菌靶位抑制细菌脂肪酸的生物合成，这种与抗生素药物相似的抑菌机制使得TCS存在与抗生素之间产生交叉抗性的可能性[28]. TCS还可作为大肠杆菌(E. coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)体内多种药物外排泵的底物[29]. 外排泵的过度表达会导致对多种抗生素药物，以及一些染料、 洗涤剂和消毒剂的抵抗性，若暴露在属于这种外排泵底物的环境条件下，将有助于外排泵的过度表达和随之发生的对这种外排泵其它底物的交叉抗性[30]. 早在2001年，Chuanchuen等[31]实验发现Pseudomonas aeruginosa经TCS暴露后可对多种药物产生交叉抗性. 3 结论

(1)在上海某污水处理厂中共检出SMX、 ERY、 TC、 CBZ和TCS共5种不同的PPCPs. 结果表明，两段A/O污水处理工艺对TCS去除率可达95.3%，但对其它4种PPCPs去除效果较差.

(2)目标ERY-ARGs在污水处理厂中均被检出，尽管两段A/O污水处理工艺能够显著降低污水中ERY-ARGs含量(1.19 log~3.97 log)，但在最终处理出水中的浓度仍然较高.

(3)ERY与ERY-ARGs之间具有显著相关性，表明ERY对ERY-ARGs的产生和散播具有重要影响. 杀菌剂TCS与ERY-ARGs之间同样具有显著相关性，表明TCS对ERY-ARGs可能具有交叉选择性作用.

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