2014, Vol. 35
2. 中国气象科学研究院, 北京 100081
2. Chinese Academy of Meteorological Sciences, Beijing 100081, China
大量的流行病学和毒理学研究表明，大气颗粒物(particulate matter,PM)可危害人群健康，大气颗粒物污染已经成为影响人类健康的主要环境因素之一[1, 2, 3]. PM 是十分复杂的混合物，包括元素碳、 金属、 无机盐、 有机物、 生物源性成分等[4]. 颗粒物不同的化学组分可导致不同的健康效应机制，决定了其对机体健康危害的差异. 有机物是大气颗粒的重要化学组分，约占其干重的10%~70%. 其中，在健康影响中最为关注的是多环芳烃(PAHs)及其衍生物，如硝基多环芳烃和醌类有机物质等. 研究发现硝基多环芳烃和醌等衍生物的毒性效应甚至强于其母体PAHs[5, 6, 7].
大气中的硝基多环芳烃可直接来源于化石燃料的燃烧，也可源于大气光化学反应的二次转化. 研究报道1-硝基芘(1-NP)是柴油车尾气中检测到的浓度最高的硝基多环芳烃[8]，对柴油车尾气颗粒的致突变性有重要贡献[9]. 研究发现硝基多环芳烃致突变和致癌潜力可达其母体PAHs的10~100 000倍[10]，因此其引起的健康风险一直受到广泛关注[11]. 最近的一些研究发现1-NP可以引起肝脏细胞发生凋亡[12]； 促进人肺上皮细胞产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，并诱导细胞因子分泌[13]； 造成人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)DNA损伤及凋亡[14]. 李淑贤等[11]用人外周血淋巴细胞探讨1-NP对DNA的损伤，结果发现1-NP对外周血淋巴细胞的DNA损伤表现出明显的剂量-效应关系，能显著引起人外周血淋巴细胞DNA损伤，具有遗传毒性； Andersson等[14]以DNA损伤、 ROS为指标研究了1-NP对HUVECs的细胞毒性和遗传毒性，结果显示，低剂量的1-NP(<10 μmol ·L-1)能引起DNA损伤，并导致细胞内的ROS水平显著上升.
醌类有机物是PM中另一类重要的PAHs衍生物，因具有氧化还原活性，可通过氧化还原循环产生ROS，而受到关注. PM 中检出的醌类大部分为多环芳醌，如蒽醌、 萘醌、 菲醌等，主要来源于机动车尾气排放和多环芳烃(PAHs)的光化学氧化[15,16]. 最近的一些研究发现萘醌和蒽醌可以通过氧化还原循环产生ROS，进而诱导人肺上皮细胞释放炎症因子，最终造成细胞死亡[17, 18, 19].
硝基多环芳烃和醌等PAHs衍生物，在大气中具有相似的来源，现实环境中往往同时存在，但目前国内外关于多种有机物的联合毒性的研究还比较少. 本文以1-NP为主体，人肺上皮细胞(A549)作为研究对象，探讨1-NP和1,2-NQ的联合细胞毒性和对DNA的损伤. 利用MTT的方法测定A549的细胞增殖能力； 通过测定细胞培养液中LDH的漏出率，评价细胞膜损伤程度； 利用单细胞凝胶电泳(彗星实验，Comet Assay)的方法测定DNA损伤； 并使用荧光探针的方法测定细胞内产生的ROS，以期为深入认识1-NP的遗传毒性、 了解1-NP和1,2-NQ的联合毒性和对人体健康的影响提供基础数据.
1 材料与方法 1.1 材料和试剂胎牛血清(PAA laboratories GmbH公司，奥地利)，HAMS/F-12培养基(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Life Science公司，美国)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物技术有限公司)，琼脂糖、 1-硝基芘(1-nitropyrene,1-NP,>99%)和1,2-萘醌(1,2-naphthoquinone,1,2-NQ,>95%)(Sigma-Aldrich公司，美国)，96孔、 24孔及6孔培养板、 35 mm培养皿以及75 cm2培养瓶(Corning公司，美国)，其它试剂(分析纯)均购自上海国药集团化学试剂公司.
仪器: CO2恒温细胞培养箱(LINGDE公司，德国)，iMark-680型酶联免疫检测仪(BIO-RAD公司，美国)，正置荧光显微镜(BX51型，Olympus公司，日本).
1.2 细胞培养和染毒人肺上皮细胞A549购自上海市中国科学院细胞库，细胞使用HAMS/F-12培养基，在5% CO2、 37℃恒温恒湿条件下培养. 当细胞生长2 d~3 d，单层细胞达到80%以上时，按1 ∶3的比例传代培养.
染毒: 取对数生长期的细胞，每孔3×103接种于96孔培养板供MTT实验使用； 每孔1×104个细胞接种于24孔培养板供LDH实验使用； 每孔5×104个细胞接种于6孔培养板或35 mm培养皿中供彗星实验、 ROS测定使用. 接种后于5% CO2、 37℃恒温恒湿条件下培养，令其贴壁生长. 细胞贴壁后，弃培养基，使用D-hanks清洗两次，进行染毒. 1-NP单独染毒: 使用不同浓度1-NP(1、 2、 3、 4 μmol ·L-1)染毒24 h或48 h. 1-NP和1-NQ的联合染毒: 使用1,2-NQ (5 μmol ·L-1)预染毒24 h后，弃上清液，使用D-hanks清洗两次，再使用不同浓度1-NP继续染毒24 h. 1-NP和1,2-NQ使用二甲基亚砜(DMSO)配置成100 mmol ·L-1的储备液，每次染毒时重新稀释至所需浓度. 染毒时使用含2%胎牛血清的培养液稀释至需要的浓度，保持DMSO的浓度为0.1%.
1.3 MTT实验用含2%胎牛血清的培养液稀释1-NP至终浓度为1、 2、 3、 4 μmol ·L-1，按照每孔100 μL对细胞染毒，另设溶剂对照组(DMSO，0.1%)和空白对照组(HAMS/F-12培养基，不含细胞)，每组设6个平行孔. 染毒24 h后，每孔加入5 mg ·mL-1 MTT试剂10 μL，混匀后，继续培养4 h； 弃去培养液，加入DMSO溶液100 μL，振荡10 min； 用酶联免疫检测仪测定光密度(D)，波长490 nm，记录数据. 细胞存活率计算如下:
细胞染毒方法同上. 染毒结束后，将细胞培养液移至EP管中，1 200 r ·min-1，离心3 min； 取培养液上清，按照LDH测定试剂盒说明书加入试剂； 将上一步所得溶液加入96孔平底培养板中(每孔加200 μL)，用酶联免疫检测仪测定光密度(D)，波长440 nm，记录数据.
1.5 彗星实验彗星实验，又称单细胞凝胶电泳分析(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一种快速检测单细胞DNA损伤的技术. 其原理为: 如果细胞内DNA未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象. 若细胞DNA受损，在电泳时DNA断链或碎片将向阳极迁移，形成拖尾. 细胞核DNA损伤愈重，产生的断链或碱易变性片段就愈多，其断链或短片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强. 因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度. 本研究采用Tice等[20]提出的彗星方法，具体步骤参考文献[18, 21]. 使用分析软件CASP进行彗星数据分析，记录尾长(Tail length)，头部(Head)和尾部(Tail)DNA的荧光强度，本研究使用尾部DNA含量(尾部DNA荧光强度/(尾部DNA+头部DNA荧光强度)×100%，即Tail DNA%)作为衡量DNA拖尾的定量指标[21]. 每个样本分析不少于80个细胞，取其中位值，再取3~4个平行样的平均值.
1.6 ROS测定本研究中选用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)，作为荧光探针，检测细胞内生成ROS. 其原理是: DCFH-DA本身没有荧光，可自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透细胞膜，从而被装载到细胞内. 细胞内的活性氧ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF. 因此，通过DCF的荧光强度可指示细胞内活性氧的水平. 具体步骤如下： ①加探针: 染毒结束后，弃去培养液，用D-Hanks清洗2次，加入用无血清的培养液稀释的DCFH-DA(终浓度10 μmol ·L-1)，于37℃、 5% CO2培养箱中孵育30 min； ②弃上清液，用D-Hanks清洗3次，再加入D-Hanks缓冲液； ③使用荧光显微镜观察，并拍照. 每个平行样选取5~10张照片，使用Image-pro plus 6.0分析荧光强度，取其平均值. 以上步骤都需要避光操作. 本实验中检测的ROS水平用光密度值来表示，将所得结果与对照组做归一化处理.
1.7 数据处理数据的处理及计算由Microsoft Office Excel 2007进行，数据以平均值±标准差(X±SD)表示，各指标组间差异采用t检验法进行统计.
2 结果与分析 2.1 细胞存活率1-NP和1,2-NQ的化学结构式，见图 1.
 | 图 1 1-NP和1,2-NQ的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of 1-NP and 1,2-NQ |
图 2显示经1-NP处理24 h或48 h后，A549的细胞存活率. 1-NP染毒24 h和48 h，A549的细胞存活率均有不同程度的下降，呈现显著的剂量-效应关系(P＜0.01). 利用Excel 2007软件计算，24 h和48 h的半致死浓度(LC50)分别为5.2 μmol ·L-1和2.8 μmol ·L-1. 随着染毒时间的增加，LC50值下降，说明1-NP的毒性随着染毒时间的增加而增强. 如果用5 μmol ·L-1的1,2-NQ预先染毒24 h，再用1-NP染毒24 h，细胞存活率亦呈现剂量-效应的下降，但与1-NP单独染毒24 h，并无显著差异(数据略).
 | 图 2 1-NP对A549细胞存活率的影响 Fig. 2 Cell viability of A549 after treated with 1-NP for 24 h and 48 h |
图 3表示经1-NP处理24 h或48 h后，A549细胞培养液中LDH的浓度水平. 1-NP染毒24 h和48 h，LDH的浓度略有升高，但与溶剂对照相比都没有显著性差异(P>0.05). 24 h处理组和48 h处理组之间也无显著性差异. 如果用5 μmol ·L-1的1,2-NQ预先染毒24 h，再用1-NP染毒24 h，LDH漏出浓度也没有显著的升高，与1-NP单独染毒无显著性差别(数据略).
 | 图 3 1-NP对A549细胞LDH水平的影响 Fig. 3 LDH release of A549 cells after treated with 1-NP for 24 h and 48 h |
选择染毒剂量为1、2、3、4和5 μmol ·L-1，设溶剂对照组(DMSO，0.1%)，另设100 μmol ·L-1的tBHP(染毒1 h)作为阳性对照组. 彗星实验中DNA拖尾现象如图 4所示. 对照组细胞头部DNA致密，边缘光滑，没有明显的损伤； 而1-NP染毒组和阳性对照组一样，头部DNA集中，亮度较强，尾部由DNA片段组成，拖尾明显，成扫帚状，并且1-NP的剂量越高，拖尾现象越明显. 这说明1-NP能引起A549细胞DNA的损伤.
由图 5可见，1-NP单独染毒，可对A549造成 DNA的损伤，随着染毒剂量的增大，尾部DNA含量(Tail DNA%)不断上升，呈显著的剂量-效应关系(P＜0.01). 对照组的Tail DNA%约为3.4%，当1-NP达到2 μmol ·L-1浓度后，出现显著性升高(P＜0.05)，在最大剂量5 μmol ·L-1时，增至45.3%(P＜0.01).
如果用1,2-NQ(5 μmol ·L-1)预先对A549细胞染毒24 h，继续使用1-NP染毒24 h，与溶剂对照组相比，仍能观察到显著的DNA损伤，结果如图 5所示. 但使用1,2-NQ预染毒，不同程度地降低了1-NP导致的DNA损伤，表现为Tail DNA%的下降，在最高浓度4 μmol ·L-1和5 μmol ·L-1处，呈现出显著性差异. 与1,2-NQ联合染毒，1-NP在5 μmol ·L-1的DNA拖尾量为24.5%，较1-NP单独染毒下降了约50%.
 | 图 4 彗星实验照片 Fig. 4 Pictures from Comet assay |
 | 图 5 1-NP单独以及1-NP和1,2-NQ联合染毒对A549 DNA的影响 Fig. 5 DNA damage in A549 cells induced by 1-NP alone and 1-NP combined with 1,2-NQ |
 | 图 6 1-NP单独以及1-NP和1,2-NQ联合染毒对A549 细胞内ROS水平的影响 Fig. 6 ROS level in A549 cells induced by 1-NP and 1,2-NQ combined with 1-NP |
图 6显示1-NP对A549细胞内ROS水平的影响，以及1-NP和1,2-NQ对A549细胞内ROS生成的联合作用. 从中可见，1-NP单独染毒，A549细胞内ROS水平随1-NP浓度的增大而不断升高，在3 μmol ·L-1浓度后，出现显著性升高； 在最高剂量5 μmol ·L-1，ROS约升高2.4倍.
1,2-NQ预染毒24 h，某种程度上抑制了1-NP染毒后细胞内ROS的生成，在最高浓度4 μmol ·L-1和5 μmol ·L-1处，呈现出显著性下降.
3 讨论MTT方法是评价外源性物质总体毒性的常用方法[22]. 实验结果表明，经1-NP染毒24 h和48 h后，A549的细胞增殖被显著抑制，呈现剂量-效应、 时间-效应关系； 经1,2-NQ(5 μmol ·L-1)预处理后的A549细胞，1-NP对A549的增殖抑制作用并没有显著性的变化. LDH为乳酸脱氢酶，普遍存在于细胞质中，当细胞膜受损或是通透性增加时可漏出至细胞外，因此细胞培养液中LDH活性的高低可反映细胞膜的受损程度[22]. 1-NP单独作用，或与1,2-NQ联合作用后，细胞培养上清液中的LDH活性与溶剂对照组相比并均没有显著性差异. 1-NP和1,2-NQ联合染毒上清液中的LDH活性要略低于1-NP单独作用的LDH活性，但两组之间没有显著性的差异. 以上结果表明，在该实验的研究浓度、 时间下，细胞膜的受损程度并不显著.
Asare等[23]研究了1-NP对Hepa1c1c7细胞的毒性作用，研究结果表明，1-NP(10 μmol ·L-1)在24 h内能引起细胞形态的显著变化. 染毒6 h后，细胞质粒开始液泡化，诱导细胞的MARKs家族的蛋白表达升高，引起的细胞凋亡是细胞死亡的主要途径. Landvik等[24]研究发现1-NP和柴油车尾气的有机提取物可以诱发Hepa1c1c7细胞凋亡，并诱导cyp1a1的表达.
本研究中采用的彗星实验具有快速、 简便、 应用范围广和灵敏度高等优点，是检测细胞遗传毒性的常用方法. 在本研究使用的是强碱性电泳液(pH>13)，通过尾部DNA的含量定量表征单个细胞DNA损伤的程度，是单链断裂、 双链断裂和碱性不稳定位点的综合损伤结果. 该研究的结果显示，1-NP可对A549细胞造成显著的DNA损伤，随着染毒浓度的升高，DNA损伤程度显著增加，并呈现剂量-效应关系(P＜0.01)； 经1,2-NQ预处理24 h能降低1-NP对A549细胞的DNA损伤，具有统计学意义(P＜0.05).
“氧化应激”指机体的促氧化与抗氧化之间的不平衡状态: 以促氧化效应为主、 抗氧化剂被消耗，中间会产生大量的ROS，通常会导致生物大分子，如DNA的损伤. ROS主要包括超氧阴离子(O2 ·-)、 过氧化氢(H2O2)和羟自由基( ·OH). 为了验证1-NP的细胞毒性和遗传毒性是否由细胞的氧化损伤引起的，利用荧光探针法检测1-NP是否会引起A549细胞内ROS的产生，实验结果显示，ROS的水平随着1-NP浓度的增加而增加，呈现显著的剂量-效应关系； 1,2-NQ与1-NP联合作用组，ROS水平低于1-NP单独作用组，但是仍显著高于对照组. 由此推断，1-NP可能通过诱导细胞产生大量的ROS，造成机体的氧化损伤，如DNA链断裂等，最终可诱发A549细胞死亡. 使用1,2-NQ预染毒A549，降低了1-NP产生的ROS，从而降低了DNA损伤. 对于1-NP是否可以引起A549细胞凋亡或其它死亡途径，还有待进一步研究.
一些报道表明1-NP可以通过产生ROS进而造成DNA损伤，与该研究结果一致. Andersson等[14]的研究发现较低剂量的1-NP(≤10 μmol ·L-1)可以导致人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)DNA损伤，并显著增强细胞内ROS的生成. Kim等[25]发现1-NP可以通过诱导A549细胞内ROS产生，最终导致细胞内8-羟基鸟苷(8-OHdG，DNA氧化损伤的标记物)浓度的升高. Su等[12]研究了1-NP对HepG2细胞的毒性作用，结果表明1-NP被AKRs酶代谢活化后与DNA 形成加合产物，导致DNA损伤； 同时诱导激活p53途径，导致细胞凋亡. Park等[13]研究发现1-NP能诱导BEAS-2B细胞产生ROS，降低GSH活性，诱导促炎症因子(IL-6,IL-8，TNF-α)的高表达，抑制细胞活性.
Shang等[26]的研究结果表明，利用1,2-NQ(5 μmol ·L-1)染毒24 h，A549细胞的增殖率不受影响，但会导致A549细胞内ROS水平和Ca2+浓度升高. Cheng等[27]的研究结果表明，1,2-NQ(10 μmol ·L-1)染毒后可以诱导胞内ROS产生及使胞内的过氧化氢酶的升高； 同时导致细胞内的血红素加氧酶-1(HO-1)表达上升，HO系统是炎症发生过程中，细胞内重要的保护通路之一. Sumi等[28]将LPS诱导的RAW264.7细胞用1,2-NQ染毒，发现1,2-NQ能抑制核转录因子NF-κB的DNA结合活性. Endo等[29]发现在牛主动脉内皮细胞(BAECs)内，1,2-NQ能与转录因子cAMP反应元件结合蛋白CREB共价结合，抑制CREB的DNA结合活性，从而下调Bcl-2基因表达.
在该研究中使用1,2-NQ预染毒A549，降低了1-NP产生的ROS，从而降低了DNA损伤. 可以理解为1,2-NQ预染毒A549，诱导胞内的抗氧化物酶如超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶(CAT)等酶活化，使细胞的抗氧化能力增强，对细胞形成保护作用，降低了1-NP产生的ROS，从而降低了DNA损伤. 或是1,2-NQ预染毒A549，大量的1,2-NQ占据有限的结合位点，从而降低了1-NP的结合效率，1,2-NQ(5 μmol ·L-1)的实验浓度几乎无细胞毒性，因此，当1,2-NQ预染毒A549时，联合毒性低于1-NP单独作用细胞时的毒性. 污染物联合毒性效应机制复杂，不同的污染物化学性质及参与生物化学反应的过程不同，其详细机制有待于进一步深入研究.
目前，对1-硝基芘遗传毒性机制的研究主要集中在细胞对1-NP的代谢途径所引起的细胞毒性. 竺乃恺等[30]研究了1-硝基芘和其他(硝基-)多环芳烃对Ames实验的6种菌株的单一和联合致突变性，结果从一个侧面说明了共存的PAHs或NO2-PAHs并不是通过改变1-NP的代谢途径或代谢酶活性来影响其致突变性，可能是存在其他的某种原因.
大气颗粒物可引发机体发生氧化应激、 诱导ROS生成已经在实验室和人体实验中得到了很好的证实[31]. 近年来不少研究者相继用氧化应激理论来探讨颗粒物的致病作用，检测颗粒物介导产生的ROS，并通过体内体外实验发现ROS生成在颗粒物致病过程中发挥着重要作用[32]. 1-NP是大气颗粒物重要的有机组分之一，本研究的结果提示，1-NP可通过诱导ROS生成，在大气颗粒物的致病过程中起重要作用. 随着经济和工业的迅速发展，化石燃料的消耗增长，硝基多环芳烃的排放会不断增加. 有调研资料表明，一些城市地区，大气中多环芳烃和氮氧化物处于较高水平，这也将导致大气光化学作用产生的硝基多环芳烃相应增加[33]. 尽管目前尚未见到环境中1-NP对人类癌症影响的报道，也未见到1-NP对哺乳动物及其后代研究的报道，但众多的相关研究表明，1-NP能显著地引起细胞的遗传毒性，因此，要更加关注环境硝基多环芳烃的环境浓度水平与其相应的健康影响.
4 结论(1)1-NP(染毒剂量1、2、3、4 μmol ·L-1)可显著抑制A549细胞增殖，24 h和48 h的LC50分别为5.2 μmol ·L-1和2.8 μmol ·L-1； 但1-NP对A549细胞LDH的漏出率并没有显著影响.
(2)1-NP(染毒剂量1、2、3、4和5 μmol ·L-1)可造成A549细胞DNA损伤，呈现剂量-效应关系； 并能显著增强细胞内ROS的生成.
(3)使用1,2-NQ(5 μmol ·L-1)预染毒24 h，再使用1-NP染毒24 h，可显著降低1-NP诱导的A549细胞内ROS生成量，从而降低DNA损伤.
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