2014, Vol. 35
2. 内蒙古科技大学生物工程与技术研究所, 包头 014010;
3. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
4. 长治学院生物科学与技术系, 长治 046011
, JIAO Hai-hua4, BAI Zhi-hui3, QI Hong-yan3
, MA An-zhou3, ZHUANG Guo-qiang3, ZHANG Hong-xun1
2. Institute of Bioengineering & Technology, Inner Mongolia University of Science & Technology, Baotou 014010, China;
3. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
4. Department of Biological Sciences and Technology, Changzhi University, Changzhi 046011, China
目前，全球转基因作物商业化种植呈持续增加态势，其种植面积也从1996年的170万hm2增加到2013年的1.75亿hm2[1]. 与此同时，关于转基因作物的风险评价也备受人们关注.
植物的根际是一个特殊的土壤生态系统，它是植物-土壤-微生物三者相互作用的主要发生场所，因此对根际的研究有着非常特殊的意义. 特别是植物的根系可以向根际分泌大量的有机物和无机物[2]，从而为根际微生物的生长提供了必备的碳源和能源； 而且植物的种类和生长发育时期的不同以及根系分泌物的种类和数量的不同都影响着根际微生物种群的结构及数量[2, 3, 4]. 而转基因植物由于外源基因表达的缘故，必将影响植物体内生理生化和代谢的改变[5]，从而可能导致其分泌物的改变. 因此，转基因植物对根际微生物的影响也成为转基因植物环境安全评价的热点.
Bt蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)体内产生的伴孢晶体蛋白，它对鳞翅目(Lepidotera)、 鞘翅目(Coleoptera) 、 双翅目(Diptera)和同翅目(Homoptera)的害虫都有较好的杀虫活性[6, 7]. Bt蛋白由Cry基因编码，且大多数Bt菌株中的Cry基因都位于质粒上[8]，其中Cry1Ac毒素对鳞翅目昆虫有着特异的活性. 而目前关于转Bt作物对根际微生物多样性的影响又多集中于对细菌多样性的研究[9, 10, 11]. 已有研究结果表明,转基因棉对棉田土壤细菌数量和群落结构没有显著影响，有些则认为转基因棉的种植有利于促进根际细菌生长繁殖，而且它会导致细菌群落结构的改变和多样性的下降，但是生育期是影响细菌群落结构改变的主要诱因[12, 13, 14]. 而真菌也是植物根际的一类重要菌群，它有着重要的生态功能，基于此，本研究利用PCR-DGGE和Q-PCR技术分析转Bt棉花对其根际真菌的影响，以期为转Bt棉花根际微生物的生态安全评价提供一定的理论依据.
1 材料与方法 1.1 棉花种植和根际土壤样品的获得选取转Bt棉花SGK321和其亲本对照SHIYUAN321以及转Bt棉花XP188和其亲本对照JM20作为实验材料. 整个实验在北京林业大学花房的玻璃温室中进行. 实验采用盆栽的方法进行. 花盆直径为23 cm、 深度16 cm，所选取的土壤为蛭石和草炭土基质以及部分农田土混合物，为了保证土壤条件的一致，装盆前特经人工充分混匀. 每个棉花样品种植35盆. 2011年5月6号开始播种，整个实验过程中，每盆棉花的肥水条件一致. 分别于苗期(06-06)、 蕾期(07-06)、 花铃期(08-06)和吐絮期(09-06)进行取样，取样时采取抖落法取样. 将长势一致的不同植株连根拔起，然后将其根部土样抖到灭菌的自封袋里，置于冰盒中带回实验室，土壤混匀后保存备用.
1.2 根际土壤DNA的提取和真菌18S rRNA PCR扩增利用Fast DNA提取试剂盒(Q-Biogene,Morgan Irvine,USA)提取根际微生物总DNA的提取，方法详见说明. 并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取效果.
以根际总DNA作为PCR模板，利用通用引物NS1(5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)和GCFung(5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC GTT G-3′)对该区进行特异扩增，扩增产物片段长约350 bp. 此外，引物 Fung 5′ 端由40个碱基组成的GC夹能使扩增片段在聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳上很好地分离[15]. 用50 μL的PCR反应体系进行扩增. 其反应体系组成如下: 模板20 ng、 各引物浓度为20 pmol、 dNTPs浓度为200 μmol、 10×PCR buffer (含MgCl2) 5 μL、 5U的DNA聚合酶，最后用适量的双蒸水补足50 μL. PCR反应条件参照May等的方法[15]，并略做改动. 具体程序为: 94℃下预变性5 min，94℃ 30 s 50℃ 30 s和72℃ 50 s 40个循环，最后在72℃下延伸8 min，于4℃下保温. PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测.
1.3 18S rDNA DGGE图谱分析采用Bio-Rad公司Dcode的基因突变检测系统对PCR反应产物进行电泳分离. 制备含有变性剂(尿素和去离子甲酰胺的混合物)的8%(质量分数)的聚丙烯酰胺凝胶，其中变性剂的含量为20%~40%[100%变性剂浓度为7 mol ·L-1的尿素和40%(体积分数)的去离子甲酰胺]，在每个加样孔中加入40 μL PCR产物浓缩样. 50 V，60℃电泳16 h. 电泳结束后，凝胶用EB染色20 min，然后于1×TAE中脱色10 min. 脱色完的凝胶置于Alpha Imager EC凝胶成像分析系统下拍照，得到DGGE图谱.
将DGGE电泳图谱中比较特异的条带切胶回收，先用 70% 酒精清洗两遍，然后用无菌水清洗2遍后，加入一定量的无菌水，4℃过夜，使DNA从胶上充分溶解出，用不带GC发卡的引物NS1和Fung对目的片段扩增. 用PCR产物回收试剂盒(OMEGA)回收扩增的PCR产物. 通过T-载体连接将其转入大肠杆菌DH5α细胞(具体步骤参照说明书)，最后通过蓝白斑筛选阳性克隆. 具体方法是将培养过夜后的平板置于4℃显色2 h，使蓝色充分显现. 选择平板上生长的白色菌落，挑取至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜. 用T-载体通用引物T7(5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GA-3′)和SP6(5′-CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3′)通过菌落PCR扩增验证插入片段的大小，筛选阳性克隆. 最后将筛选到的阳性克隆接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200~250r ·min-1振荡培养过夜后送公司测序.
1.4 DGGE图谱的统计学分析和系统发育分析根据DGGE图谱中条带的有无或条带的浓度，应用Quantity one软件对DGGE图谱进行数字化，根据Luo等[16]的方法计算丰富度指数(S)、 香农-威纳指数(H)和均匀度(EH)这3种微生物群落的多样性指数.
将所得序列输入NCBI网站，用Blast程序与GenBank中已有的序列进行比对，下载同源性最高的序列和同源性较高的已知种的序列作为参考. 采用软件ClustalX1.81及Mega3以N-J法进行系统发育分析(采样量1 000次)，构建系统发育树[17].
1.5 实时定量PCR本研究参照Fierer等方法[18]，利用Real-time PCR技术对样品中的真菌生物量进行定量测定. 所选用的引物为ITS1f(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和5.8s(5′-CGC TGC GTT CTT CAT CG-3′)，整个反应在PCR八连管(Axygen，USA)中进行. 采用25 μL PCR反应体系，具体组成包括1×SYBR Master Mix (Fermentas，USA)，0.3 μmol ·L-1引物，2 μL DNA提取物，ddH2O定容至25μL. PCR扩增程序为: 95℃预变性10 min，在95℃变性30 min，60℃退火30 s，72℃延伸30s，循环40次. 荧光数据采集在引物延伸反应过程中完成. 整个反应过程在实时荧光定量PCR Mx-3005P(Stratagene，USA)中进行. 并利用仪器自带软件Mx Pro QPCR软件(version 3.0，184 Stratagene，USA)进行后续的数据分析. 所有样品重复3次，标准曲线为2个重复. 利用已知拷贝数的质粒来制备标准曲线，其具体步骤如下.
①以样品DNA为模板，利用ITS1f和5.8 s进行PCR扩增，最后将纯化后的PCR产物转入DH5α细胞，经37℃摇瓶过夜培养.
②利用OMEGA公司的E.Z.N.A. TM Plasmid Mini Kit Ⅱ (BioDve-tech，Beijing，China)质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作步骤参照说明书进行.
③利用NanoDropND-1000(USA)测定质粒浓度.
④根据Stubner[19]的方法计算质粒的拷贝数.
⑤以10倍梯度稀释(一般8个梯度)后质粒DNA作为标准样品，然后让其和待测样品一起扩增，得出标准曲线.
⑥根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数.
2 结果与分析 2.1 转基因棉花根际真菌多样性的DGGE图谱分析由图 1可以看出，转Bt基因棉与对照棉根际真菌优势条带组成在不同的取样时期极为相似，三者间差异条带多为不清晰的条带. 在苗期，P6和Y6以及J6根际真菌组成较为相似，但是彼此也存在一定差异. 条带E23仅存在于P6，而在Y6和 J6中缺失； 条带E4仅存在于J6，而在Y6和P6中缺失； 条带E12仅存在于Y6，而在P6和 J6中缺失[图 1 (a)]； 同样，条带R20和R22仅存在于G6，而在Y6和 J6中缺失； 条带R7仅存在于J6，而在Y6和 G6中缺失[图 1 (b)]. 在蕾期，条带E5仅存在于P7，而在Y7和 J7中缺失； 条带E3仅存在于Y7，而在P7和 J7中缺失[图 1 (a)]； 条带R7仅存在于G7和Y7中，而在J7中缺失； 条带R6仅存在于J7和Y7中，而在G7中缺失； 条带R4和R5仅存在于G7中，而在J7和Y7中缺失[图 1 (b)]. 在花铃期，条带E3、 E5和E15仅存在于J8，而在Y8和P8中缺失； 条带E12在Y8和P8中存在，在J8中消失； 条带E17仅存在于Y8，而在J8和P8中缺失[图 1 (a)]； 同样，条带R22在Y8中存在，而在G8和J8 中缺失； 条带R3 在G8 和J8中存在，而在Y8中消失； R15在Y8中存在，而在G8和J8中缺失[图 1 (b)]. 在吐絮期，条带E9和E20在P9中存在，而在Y9和J9中缺失； 条带E21在Y9中存在，而在G9和J9 中缺失； 条带E17在J9中存在，而在G9和Y9中缺失[图 1 (a)]； 同样，条带R11和R20也在Y9中存在，而在G9和J9中缺失； R21在J9中存在，而在G9和Y9中缺失； 条带R1和R2在G9中存在，而在Y9和J9中缺失[图 1 (b)]. 上述分析说明，不仅转基因棉和非转基因棉的根际真菌群落结构差异明显，非转基因棉SHIYUAN321和JM20间以及转基因棉之间的根际真菌群落结构也存在一定差异.
 | 泳道字母G、 Y、 J、 P 分别代表转Bt棉SGK321、 对照棉SHIYUAN321、 对照棉JM20和转Bt棉 XP188； 泳道上方的数字6、 7、 8 和9分别代表 4次不同的取样时期图 1 转Bt棉花和其对照棉花根际18S rRNA DGGE图谱分析Fig. 1 Analysis of DGGE profile for rhizosphereic 18S rRNA of transgenic cotton expressing Bt-protein and its control variety at different sampling times |
聚类分析[图 2 (a)]结果表明，转Bt 棉XP188和对照棉根际真菌的群落多样性在4个主要的生长时期主要聚为一大类. 同一采样时期，除P6和Y6聚到一起外，Bt棉和其对照并没有聚到一起，不同取样时期的Bt棉和非转基因棉则聚到了一起. 如P8、Y9和J6聚为一类； P7和J8聚为一类； Y8和J9则聚到一起. 不过，Bt棉SGK321和亲本对照棉SHIYUAN321以及非亲本对照JM20主要聚为两大类，而且它们在苗期和蕾期三者聚为一类[图 2 (b)]，而在其它两个时期并没有聚为一类.
 | 大写字母G、 Y、 J、 P 分别代表转Bt棉SGK321、对照棉SHIYUAN321、对照棉JM20和转Bt棉XP188； 数字6、 7、 8 和9分别代表 4次不同的取样时期月份图 2 转Bt棉和其对照棉根际真菌群落DGGE图谱的聚类分析Fig. 2 Cluster analysis of DGGE profile for fungal community in rhizosphere of transgenic Bt cotton and its control cotton |
香农-威纳指数和丰富度指数[图 3 (a)和3(b)]表明，转Bt棉花SGK321和XP188根际真菌的多样
性除了在花铃期要较各自的对照亲本有较为明显的减少外，其它时期都无明显的减少，而且在苗期真菌多样性还较各自对照有明显的增加. 在两个常规品种 SHIYUAN321和JM20之间差异也较为明显，尤其在苗期和蕾期，常规棉SHIYUAN321要较常规棉JM20根际真菌多样性丰富. 均匀度指数[图 3 (c)]结果则表明，尽管个别时期转Bt棉和非转基因棉之间存在一定差异，但是其差异极为轻微，说明根际真菌群落组成在转基因棉和非转基因棉间分布较为均匀. 因此，Bt棉并不会导致根际真菌多样性的减少.
 | 大写字母G、 Y、 J、 P 分别代表转Bt棉SGK321、 对照棉SHIYUAN321、 对照棉JM20和转Bt棉XP188图 3 不同取样时期转Bt棉和其对照棉根际真菌群落多样性指数分析Fig. 3 Analysis on diversity index of fungal community in rhizosphere of transgenic Bt cotton and its control cotton at different sampling |
Bt棉XP188 DGGE图谱(表 1)的序列比对结果表明，不同时期发生缺失的条带分别是Rhizoctonia solani (E3)、 Aspergillus ustus (E4)、 Uncultured eukaryote (E5)、 Uncultured Orbiliaceae (E9)、 Lasiodiplodia rubropurpurea (E12)、 Uncultured Lecythophora (E15)、 Uncultured fungus (E17)、 Phialosimplex sp.(E20)和Penicillium purpurogenum (E21). 系统进化树信息表明，子囊菌门是棉花根际真菌中最主要的真菌类型，占已知测序序列的59%，而且其分布十分广泛，共有粪壳菌纲(Sordariomycetes)的肉座菌目(Hypocreales)和Coniochaetales目，座囊菌纲(Dothideomycetes)的煤炱目(Capnodiales)、 格孢菌目(Pleosporales)和葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)，圆盘菌纲 (Orbiliomycetes) 圆盘菌目(Orbiliales)以及散囊菌纲(Eurotiomycetes)的散囊菌目(Eurotiales)； 此外，还包括担子菌门的定银耳纲(Tremellomycetes)的银耳目(Tremellales)和个别分类地位不明的真菌.
同样，Bt棉SGK321 DGGE图谱(表 1)中序列比对结果也表明，不同棉花品种间的差异条带分别是Rhizomucor variabilis (R1)、 Uncultured Cystofilobasidiales (R2)、 Rhizoctonia solani (R3)、 Uncultured fungus (R4)、 Uncultured fungus (R5)、 Aspergillus ustus (R6)、 Aspergillus oryzae (R7)、 Uncultured Orbiliaceae (R9)、 Lepidosphaeria nicotiae (R11)、 Uncultured Lecythophora(R15)、 Phialosimplex caninus (R20)和Uncultured fungus (R22). 系统进化树信息表明，Bt棉SGK321及其对照根际真菌主要由子囊菌门和担子菌门组成. 其中子囊菌门包括粪壳菌纲(Sordariomycetes)的Magnaporthales和Coniochaetales，座囊菌纲(Dothideomycetes)的格孢菌目(Pleosporales)，圆盘菌纲 (Orbiliomycetes) 圆盘菌目 (Orbiliales)以及散囊菌纲(Eurotiomycetes)的散囊菌目(Eurotiales)，锤舌菌纲(Leotiomycetes)的半知菌类(Leotiomycetes incertae sedis)； 担子菌门则包括银耳纲(Tremellomycetes)的Cystofilobasidiales目以及伞菌纲(Agaricomycetes)的鸡油菌目(Cantharellales). 此外，还包括半知菌类(Fungi incertae sedis)的毛霉目(Mucorales)以及不可培养真菌.
2.4 转基因棉花根际真菌生物量的定量分析及其动态变化图 4是对不同取样时期Bt棉花和其对照棉花根际样品中的18S rRNA基因的拷贝数进行定量的结果. 结果表明Bt棉花和其亲本对照棉之间差异不一. Bt棉SGK321除在苗期真菌 18S rRNA基因的拷贝数明显低于亲本对照外，其他3个时期并没有显著降低，而且蕾期和吐絮期其基因拷贝数还高于对照亲本SHIYUAN321； 与SGK321不同，Bt棉XP188除在花铃期较对照有轻微降低外，其他时期都表现出明显的增加优势. 而且Bt棉XP188和SGK321之间真菌的基因拷贝数 也存在差异. 此外，两个对照棉SHIYUAN321和JM20之间真菌的18S rRNA基因的拷贝数也存在一定差异，其中以苗期最为明显. 由此可以看出，Bt棉花和其亲本对照棉之间以及对照棉之间根际真菌的生物量的差异并不是都由Bt蛋白的表达而导致.
 | 表 1 Bt棉XP188和SGK321 DGGE指纹图谱中对应的单个条带的序列比对分析Table 1 Sequence identities of DNA recovered from single bands in DGGE fungal fingerprints of Bt cotton XP188 and SGK321 |
 | P表示转Bt棉XP188，J表示对照棉JM20，G表示转Bt棉SGK321，Y表示对照棉SHIYUAN321图 4 不同取样时期转Bt棉和其对照棉根际真菌生物量的定量分析Fig. 4 Quantitative analysis of fungal biomass in rhizosphere of transgenic Bt cotton and its control variety at different sampling times |
目前，关于转基因植物对土壤真菌、 根际真菌和从枝菌根影响的研究已有报道，但是结果众说纷纭[14, 20, 21, 22, 23, 24, 25]. Lamarche等[21]的结果表明，转几丁质酶白皮松对土壤真菌多样性没有影响. Lee 等[22]通过多样性指数分析发现，转Bt水稻和其亲本对照之间真菌的多样性和数量没有显著差异. 而Kuramae等[23]认为转Bt玉米对土壤真菌的群落结构和多样性无影响，但是因取样时期的改变而造成的真菌群落结构的改变则非常明显. Velasco等[24]则发现，转Bt玉米不但可以提高根际微生物的生物活性，而且也可以导致微生物群落结构的改变，但是时空的变化要较转Bt玉米对微生物群落结构的影响更为明显. 而Castaldini等[25]发现温室条件下，Bt玉米对从枝菌根的定植有影响. 本研究则发现，不仅转Bt基因棉和非转基因棉的根际真菌群落结构差异明显，非转基因棉SHIYUAN321和JM20间以及转Bt基因棉SGK321和XP188之间的根际真菌群落结构也存在一定差异. 不过这与Li等[14]、 Kuramae等[23]和Velasco等[24]的研究结果也不一致，而且他们的研究表明，季节的变对棉花土壤真菌的数量有明显影响，这也与本研究不尽一致. 其原因可能在于温室和大田环境的不一致有关. 本研究DGGE条带的测序及比对结果表明，个别差异条带(E19)为非真菌序列； 而且香农-威纳指数统计结果显示，转Bt棉花根际真菌的多样性仅在花铃期较各自的对照亲本有较为明显的减少外，其它时期都无明显的减少. 均匀度指数结果则表明，根际真菌群落组成在转基因棉和非转基因棉间分布较为均匀. 所以Bt棉和非转基因棉的根际真菌群落结构差异并不完全是由Bt的表达而引起，外界环境因素的影响也很大.
张美俊等[13]的研究表明转Bt基因棉对细菌和真菌生长繁殖有促进作用. 本研究的 Q-PCR定量结果表明，Bt棉除在个别时期，真菌生物量有降低趋势外，其他时期都没有显著的降低趋势，而且多数还表现出较高的正效应. 而且也有报道称转基因植物对从枝菌根真菌有明显的负面影响[25, 26]，这也与本研究结果存在一定差异. 而Lamarche等[21]的结果表明，转几丁质酶白皮松对土壤真菌的生物量都没有影响. 此外，还有研究也报道了转基因植物对从枝菌根真菌的定植无影响或影响甚微[27, 28, 29]. 这也与本研究不尽一致. 其原因可能在于所选生境及植物的种类不同. 而且本研究还发现，Bt棉XP188和SGK321之际真菌的基因拷贝数也存在差异. 此外，两个对照棉SHIYUAN321和JM20之间真菌的18S rRNA 基因的拷贝数也存在一定差异，其中以苗期最为明显. 由此可以看出，Bt棉花和其亲本对照棉之间根际真菌的生物量的差异并非完全是由Bt蛋白的表达而导致，品种的不同也会产生一定影响，这一结论也得到了范巧兰等[30]的研究证实.
段杉等[31]的研究表明，转基因抗虫棉的种植对根区土壤真菌主要类群的数量会产生一定的影响，且种植时间长短也会对真菌主要类群数量产生不同的影响. 而本研究结果表明，转Bt基因棉与对照棉根际真菌优势条带组成在不同的取样时期极为相似，三者间差异条带多为不清晰的条带. 其原因可能在于所采用的方法不同. 而且段杉等[31]的结果认为棉花根际主要以毛霉(Mucor)、 根霉(Rhizopus)、 镰刀菌(Fusarium)、 曲霉(Aspergillus)、 青霉(Penicillium)和链格孢(Alternaria)为主. 与之不同，本研究的结果则不仅检测到根毛霉属(Rhizomucor)、 丝核菌属(Rhizoctonia)、 曲霉菌(Aspergillus)、 地丝菌属(Geomyces)、 Lepidosphaeria属、 稻瘟病(Magnaporthe)真菌，而且还检测到包括不可培养的圆盘菌(Uncultured Orbiliaceae) 、 不培养的Cystofilobasidiales真菌、 不可培养烧瓶状霉(Uncultured Lecythophora)和分类地位不清的不可培养真菌(Uncultured fungus)的存在. 这说明不同的土壤生境对棉花根际真菌的种类也有很大影响. 同时这也说明不可培养方法可以检测到更为完全的根际真菌的存在，从而更好地反映根际真菌多样性的存在.
4 结论(1)与对照非转基因棉相比，转Bt基因棉在不同取样时期对根际真菌群落结构产生一定影响，不过对优势菌群影响甚微. 而且对照棉SHIYUAN321和JM20间以及转基因棉SGK321和XP188之间的根际真菌群落结构也存在一定差异.
(2)转Bt棉在花铃期对根际真菌的多样性和生物量影响较大，在其它时期影响甚微，甚至有增加趋势. 同样，对照棉SHIYUAN321和JM20之间以及转基因棉SGK321和XP188之间的根际真菌的多样性和生物量也存在一定差异.
(3)Bt并不是造成转基因棉和非转基因棉根际真菌群落结构差异、 多样性改变和生物量减少的唯一诱因，品种的不同也对它们有较大影响.
(4)棉花根际真菌多样性非常丰富，其中尤以子囊菌门真菌最为占优，其次为担子菌门真菌. 此外，还包括部分半知菌类和不可培养真菌.
| [1] | James C. 2013年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. 中国生物工程杂志, 2014, 34 (1): 1-8. |
| [2] | Lynch J M, Whipps J M. Substrate flow in the rhizosphere[J]. Plant and Soil, 1990, 129 (1): 1-10. |
| [3] | 陆雅海, 张福锁. 根际微生物研究进展[J]. 土壤, 2006, 38 (2): 113-121. |
| [4] | Hinsinger P, Marschner P. Rhizosphere-perspectives and challenges-a tribute to Lorenz Hiltner 12-17 September 2004-Munich, Germany[J]. Plant and Soil, 2006, 283 (1-2): vii-viii. |
| [5] | Lozzia G C, Furlanis C, Manachini B, et al. Effects of Bt corn on Rhopalosiphum padi L. (Rhynchota: Aphididae) and on its predator Chrysoperla carnea stephen (Neuroptera: Chrysopidae)[J]. Bolletino di Zoologia Agraria e di Bachicoltura, 1998, 30 (2): 153-164. |
| [6] | Aly N A H. PCR detection of cry genes in local Bacillus thuringiensis isolates[J]. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2007, 1 (4): 461-466. |
| [7] | Grossi-de-Sa M F, de Magalhes M Q, Silva M S, et al. Susceptibility of Anthonomus grandis (cotton boll weevil) and Spodoptera frugiperda (Fall armyworm) to a Cry1Ia-type toxin from a Brazilian Bacillus thuringiensis strain[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2007, 40 (5): 773-782. |
| [8] | Crickmore N, Zeigler D R, Feitelson J, et al. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62 (3): 807-813. |
| [9] | LeBlanc P M, Hamelin R C, Filion M. Alteration of soil rhizosphere communities following genetic transformation of white spruce[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73 (13): 4128-4134. |
| [10] | Dunfield K E, Germida J J. Seasonal changes in the rhizosphere microbial communities associated with field-grown genetically modified Canola (Brassica napus)[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 (12): 7310-7318. |
| [11] | Kapur M, Bhatia R, Pandey G, et al. A case study for assessment of microbial community dynamics in genetically modified Bt cotton crop fields[J]. Current Microbiology, 2010, 61 (2): 118-124. |
| [12] | 陈俊辉, 王扬扬, 郑婕, 等. 转基因抗虫棉对棉田土壤细菌数量及群落结构的影响[J]. 农业环境科学学报, 2012, 31 (4): 736-742. |
| [13] | 张美俊, 杨武德, 李燕娥. 不同生育期转Bt基因棉种植对根际土壤微生物的影响[J]. 植物生态学报, 2008, 32 (1): 197-203. |
| [14] | Li X G, Liu B, Cui J J, et al. No evidence of persistent effects of continuously planted transgenic insect-resistant cotton on soil microorganisms[J]. Plant and Soil, 2011, 339 (1-2): 247-257. |
| [15] | May L A, Smiley B, Schmidt M G. Comparative denaturing gradient gel electrophoresis analysis of fungal communities associated with whole plant corn silage[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2001, 47 (9): 829-841. |
| [16] | Luo H F, Qi H Y, Zhang H X. Assessment of the bacterial diversity in fenvalerate-treated soil[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2004, 20 (5): 509-515. |
| [17] | Ning J Y, Bai Z H, Gang G, et al. Functional assembly of bacterial communities with activity for the biodegradation of an organophosphorus pesticide in the rape phyllosphere[J]. FEMS Microbiology Letters, 2010, 306 (2): 135-143. |
| [18] | Fierer N, Jackson J A, Vilgalys R, et al. Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71 (7): 4117-4120. |
| [19] | Stubner S. Enumeration of 16S rDNA of Desulfotomaculum lineage 1 in rice field soil by real-time PCR with SybrGreen detection[J]. Journal of Microbiological Methods, 2002, 50 (2): 155-164. |
| [20] | Hannula S E, de Boer W, van Veen J A. Do genetic modifications in crops affect soil fungi? a review[J]. Biology and Fertility of Soils, 2014, 50 (3): 433-446. |
| [21] | Lamarche J, Stefani F O P, Séguin A, et al. Impact of endochitinase-transformed white spruce on soil fungal communities under greenhouse conditions[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76 (2): 199-208. |
| [22] | Lee S H, Kim C G, Kang H. Temporal dynamics of bacterial and fungal communities in a genetically modified (GM) rice ecosystem [J]. Microbial Ecology, 2011, 61 (3): 646-659. |
| [23] | Kuramae E E, Verbruggen E, Hillekens R, et al. Tracking fungal community responses to maize plants by DNA-and RNA-based pyrosequencing[J]. PLOS One, 2013, 8 (7): e69973. |
| [24] | Velasco A G V, Kowalchuk G A, Manero F J G, et al. Increased microbial activity and nitrogen mineralization coupled to changes in microbial community structure in the rhizosphere of Bt corn[J]. Applied Soil Ecology, 2013, 68 : 46-56. |
| [25] | Castaldini M, Turrini A, Sbrana C, et al. Impact of Bt corn on rhizospheric and soil eubacterial communities and on beneficial mycorrhizal symbiosis in experimental microcosms[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71 (11): 6719-6729. |
| [26] | Turrini A, Sbrana C, Nuti M P. Development of a model system to assess the impact of genetically modified corn and aubergine plants on arbuscular mycorrhizal fungi[J]. Plant and Soil, 2005, 266 (1-2): 69-75. |
| [27] | Pasonen H L, Lu J R, Niskanen A M, et al. Effects of sugar beet chitinase Ⅳ on root-associated fungal community of transgenic silver birch in a field trial[J]. Planta, 2009, 230 (5): 973-983. |
| [28] | de Vaufleury A, Kramarz P E, Binet P, et al. Exposure and effects assessments of Bt-maize on non-target organisms (gastropods, microarthropods, mycorrhizal fungi) in microcosms[J]. Pedobiologia, 2007, 51 (3): 185-194. |
| [29] | Knox O G G, Nehl D B, Mor T, et al. Genetically modified cotton has no effect on arbuscular mycorrhizal colonisation of roots[J]. Field Crops Research, 2008, 109 (1-3): 57-60. |
| [30] | 范巧兰, 陈耕, 李永山, 等. 转基因棉花不同生物量对土壤微生物群落结构的影响[J]. 棉花学报, 2012, 24 (1): 85-90. |
| [31] | 段杉, 谢响明, 李世东, 等. 转基因抗虫棉对根区土壤真菌影响的初步研究[J]. 微生物学杂志, 2008, 28 (4): 7-12. |