畜牧养殖业的集约化发展过程中，兽用抗生素起到了重要的作用^[1]，其中兽用四环素由于具有较强的抗炎、 免疫作用且价格低廉^[2]，常被作为饲料添加剂及防病药物在养殖业中广泛使用^[3]，这些大量使用的四环素多会以原药或代谢物的形式随粪便及尿液排出动物体外^[4]. 在全球范围内许多地区的土壤、 水体、 底泥，甚至饮用水中都能检出四环素的残留^{[5, 6, 7, 8]}. 近年来，有报道指出环境中残留的四环素一般为μg ·kg^-1级别^[9]并能诱导及维持一定含量水平的抗性基因^[10]，无疑增加了抗生素残留对环境的威胁. 为消除抗性基因的环境污染，国内外学者开展了多种方向的研究^{[11, 12, 13]}，其中就有研究证明环境因素与抗生素抗性基因的去除之间存在着一定的关联，例如Pei等^[14]在研究生物处理对废水中抗生素抗性基因的作用时发现，厌氧和光照处理能够加速四环素类抗生素抗性基因tetO、 tetW的去除. Diehl等^[15]和Munir等^[16]也发现，温度与氧气条件能明显影响污泥等基质中抗性基因的含量. 目前国内外许多研究多围绕不同环境条件中四环素抗性基因去除方法的探索，而针对四环素抗性基因形成过程中环境因素影响作用的研究则较为缺乏. 本研究采取实验室条件下人工模拟自然条件的方式，通过人为改变环境因素诱导测试土壤，利用实时荧光定量PCR法检测被诱导土壤中的四环素抗性基因(tetA、 tetC)的含量水平，探索温度、 光照及pH条件对环境中四环素抗性基因形成的影响规律.

试验所需土壤采集于江苏省沭阳市某地，受人为活动较少，土壤性质为黄棕壤，标记为S，采集后的土壤过2 mm筛，混合均匀，放于4℃冰箱保存.

在无菌条件下称取土壤S 100 g，按1mg ·kg^-1的比例向土壤中添加四环素标准溶液(1000mg ·L^-1)，混合均匀，平铺于已在121℃下灭菌20 min的500 mL空三角瓶底部. 土壤含水量控制在田间持水量的65%，用封口膜封住瓶口，将三角瓶置于避光恒温恒湿生化培养箱中. 分别设置培养温度为4、 10、 25、 37和42℃，每组设置3个平行. 每隔2 d称重补充损失的水分，培养周期为21 d.

无菌条件下称取土壤S 100 g，平铺于已在121℃下灭菌20 min的带盖透明玻璃平皿中，在土壤表面均匀喷洒四环素标准溶液(1 000 mg ·L^-1)使土壤中四环素残留量为1mg ·kg^-1，混合均匀，土壤含水量为田间持水量的65%. 玻璃平皿置于光照培养箱中，光照度分别设置为0、 500、 1000、 5000、 10000、 20000 lx，每日光照时间为12 h，培养箱温度设置为37℃. 每个试验组设置3个平行，每隔2 d称重补充损失水分，培养周期为21 d.

在无菌条件下称取50 g土壤S，平铺于已在121℃下灭菌20 min的500 mL空三角瓶底部. 向三角瓶中加入双蒸水，制成土壤悬液. 配置磷酸盐缓冲液，利用磷酸盐缓冲液调节土壤悬液pH至6、 6.5、 7、 7.5、 8和8.5，按1 mg ·L^-1的浓度向土壤悬液中添加四环素标准溶液，均匀混合，用封口膜封住瓶口，每个试验组设置3个平行，记录每个平行的质量. 三角瓶置于避光、 37℃、 200 r ·min^-1摇床中，每隔两天称重补充损失水分. 21 d后阴干取土壤进行分析.

称取培养后的土壤0.25 g，按照PowerSoilDNA Isolation Kit(MoBio,美国)试剂盒说明书提取土壤总DNA.

称取培养后的土壤样品5 g，分别加入到装有45 mL无菌生理盐水和若干小玻璃珠的三角瓶中，37℃下200 r ·min^-1振荡30 min制成土壤悬液，记为稀释度1，然后按照10倍倍比稀释的方法将样品梯度稀释至10^-2、 10^-3、 10^-4、 10^-5. 分别取各稀释梯度的土壤悬液200 μL涂布于含16 μg ·mL^-1四环素和不含抗生素的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，各稀释度制备3个平行板. 平板倒置于生化培养箱中，37℃恒温培养2~5 d，根据菌落生长情况确定培养时间(H). 计数每个平板上的菌落数，从而计算每克土壤样品中的菌落形成单位(CFU). 计算公式为: 菌落数(CFU ·g^-1)=(9×平均菌落数×稀释倍数)/0.2.

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen,China)提取阳性样品中的基因组DNA，提取的DNA用1.0%琼脂糖电泳及紫外分光光度计(UV-8000PC)检测含量以及纯度(A260/A280值在1.8~2.0之间).

试验所有引物参照文献^{[17, 18]}. 建立25 μL扩增体系，其中含100~200 ng模板DNA、 10×Taq plus buffer(1.5 mmol MgCl₂)、 1.5 U Taq plus DNA聚合酶、 2.5 mmol dNTP、 10 μmol 上/下游引物、 ddH₂O补充体积至25 μL.混匀上述反应液后，94℃预变性5 min，然后按94℃变性1 min，58℃、 60℃、 59℃ (16S rRNA、 tetA、 tetC)退火30 s，72℃延伸45 s，最后于72℃延伸7 min结束反应. PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对比目标条带的大小. E. coli DH5α不含tet基因，被当作阴性对照.

采用PCR产物纯化试剂盒(Sangon,China)纯化扩增后的目标条带，纯化后的产物连接到pEASY-T3 Cloning Vector(TransGen,China)，连接产物转化于Trans1-T1(TransGen,China)感受态细胞中. 涂布平板，挑选阳性克隆子接种于LB/Amp+ 的液体培养基中，过夜培养. 利用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(Axygen,America)提取质粒DNA，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序插入的基因片段. 从Internet 进入NCBI站点后，用“Nucleotide Blast”程序对测序序列进行同源性检索比对.

利用紫外分光光度计(UV-8000PC)检测提取的质粒DNA含量以及纯度，A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8~2.0之间，表明提取的质粒DNA纯度较高. 基因拷贝数按以下公式计算: 拷贝数=(质量/相对分子质量)×6.02×10²³. 提取的质粒DNA按10倍浓度梯度稀释作为阳性反应模板，以拷贝数的log值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线. 制成的标准曲线如图 1~图 3.

图 2

Fig. 2

图 2 tetA基因标准曲线Fig. 2 Standard curve of tetA gene

图 1

Fig. 1

图 1 16S rRNA标准曲线Fig. 1 Standard curve of 16S rRNA

图 3

Fig. 3

图 3 tetC基因标准曲线Fig. 3 Standard curve of tetC gene

参照Ultra SYBR mixture(CWbio，China)试剂盒说明书在CFX96 Touch^TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，美国)仪器上进行RT-PCR扩增，扩增条件为95℃热变性10 min，其后进行40个循环，每个循环包括95℃变性15 s，60℃反应1 min，最后60℃升到95℃，其间每隔0.5℃采集一次荧光以生成溶解曲线，根据溶解曲线的变化检测扩增结果的特异性.

图 4

Fig. 4

图 4 不同温度条件下四环素抗性基因的含量Fig. 4 Amount of tetracycline resistance genes in soil at different temperature

从图 4中可以看出，土壤中tetA基因的含量范围为6.53×10⁴~2.62×10⁵ copies ·g^-1，tetC基因的含量范围为1.33×10⁶~4.37×10⁶ copies ·g^-1. 不同温度条件下的四环素抗性基因的含量却存在着不同，tetC基因含量在 25℃时达到峰值4.37×10⁶ copies ·g^-1，与其他条件下含量存在明显差异(P<0.05)，37℃时tetA基因的含量最高2.62×10⁵ copies ·g^-1，与其他条件下含量存在明显差异(P<0.05). 将tetA和tetC基因含量之和记为四环素抗性基因的总含量，25℃时抗性基因的总含量出现峰值，42℃时最低. 值得注意的是，0℃、 10℃、 37℃、 42℃条件下四环素抗性基因的总含量仅占25℃时含量的41.82%、 49.55%、 69.44%和31.15%，各条件下四环素抗性基因总含量差异明显. 可以看出温度条件能够影响土壤中四环素抗性基因的含量，其中低温或高温条件可以有效降低土壤中四环素抗性基因的含量，这与Diehl等^[15]发现的温度可以影响四环素抗性基因含量的结论较为一致. 如图 5所示，tetA、 tetC基因与16S rRNA表达量的比值分别介于10^-2.005~10^-1.5296与10^-0.671~10^-0.312之间，在37℃时tetA与16S rRNA表达量比值最大，在25℃时tetC基因与16S rRNA表达量的比值最大. 不同温度间tetA、 tetC基因与16S rRNA表达量的比值的变化趋势与tetA、 tetC基因含量在各温度条件间的变化趋势相近，说明不同温度条件下，土壤中tetA、 tetC基因的含量与土壤中整体微生物丰度有关.

图 5

Fig. 5

图 5 不同温度条件下四环素抗性基因相对表达量Fig. 5 Copies of tet genes/copies of 16S rRNA at different temperature

通过测定土壤中可培养细菌及四环素耐药菌的丰度，可以看出不同的温度条件下可培养菌菌落数和四环素耐药菌菌落数之间存在着明显差异(如表 1). 25℃和37℃条件下可培养细菌菌落数和四环素耐药菌菌落数均显著高于其他条件(P<0.05)，可以判断温度条件能促进或抑制细菌的生长. 其中在25℃时，四环素耐药菌菌落数达到最大，(2.13±0.07)×10⁶ CFU ·g^-1，为42℃时最低值的2.5倍. 值得注意的是土壤中四环素耐药菌菌落数在各个温度条件下的变化趋势与四环素抗性基因总含量在各个温度下的变化趋势接近，可以看出四环素耐药菌菌落数对四环素抗性基因的总含量产生影响. 从而可以推断出温度条件有效影响了四环素耐药菌的生长，又间接影响到了耐药菌中四环素抗性基因的生成. 同时土壤中tetA、 tetC基因的含量与土壤中四环素的残留水平有正相关性^[19],而且温度条件能够影响土壤中四环素的残留量^{[20, 21]}，这可能也影响到了土壤中四环素抗性水平及四环素抗性基因含量的变化.

表 1(Table 1)

表 1 不同温度条件下土壤中可培养菌及四环素耐药菌菌落数Table 1 Amount of cultivable and drug resistant bacteria in soil under different temperature conditions 温度/℃ 可培养菌菌落数×106/CFU·g-1 四环素耐药菌菌落数×106/CFU·g-1 4 2.07±0.12 1.20±0.07 10 2.44±0.11 1.39±0.04 25 3.27±0.11 2.13±0.07 37 3.79±0.16 1.98±0.08 42 1.62±0.13 0.85±0.04

表 1 不同温度条件下土壤中可培养菌及四环素耐药菌菌落数Table 1 Amount of cultivable and drug resistant bacteria in soil under different temperature conditions

图 6

Fig. 6

图 6 不同光照条件下四环素抗性基因的含量Fig. 6 Amount of tetracycline resistant genes in soil under different illumination

从图 6中可以看出不同的光照条件下，土壤中四环素抗性基因的含量存在着不同， tetA基因的含量范围为6.99×10⁴~2.19×10⁵ copies ·g^-1，远低于tetC基因的含量范围0.86×10⁶~2.36×10⁶ copies ·g^-1. 当光照度达到500 lx时，tetA和tetC基因的含量为最大，但数值大小基本与0 lx时持平(tetA P=0.661，tetC P=0.631).500~20 000 lx范围内，tetA和tetC基因的含量都会随着光照度的增加而减小，其中20 000 lx时四环素抗性基因总含量(0.93×10⁶ copies ·g^-1)仅占500 lx时的35.98%. 500~1 000 lx之间是抗性基因总含量下降最为明显的一段，抗性基因的总含量同比降低了28.87%. 由此可以看出光照度能够对四环素抗性基因的生成产生一定的影响，当光照度超过500 lx时，抗性基因的总含量与光照度会呈现负相关关系，即光照度值越大，抗性基因的含量越低. 这与Engemann等^[22]研究的光照能加速四环素抗性基因降解的结论存在相关性. 如图 7所示，tetA、 tetC基因与16S rRNA表达量的比值分别介于10^-2.075~10^-1.447与10^-0.986~10^-0.417之间，在500 lx时tetA、 tetC基因与16S rRNA表达量比值最大，当光照度大于500 lx时，随着光照度增加比值在逐渐减小，这与土壤中tetA、 tetC基因含量在各光照条件间的变化趋势相近，说明在不同光照条件下，土壤中tetA、 tetC基因的含量与土壤中整体微生物丰度有关.

图 7

Fig. 7

图 7 不同光照条件下四环素抗性基因相对表达量Fig. 7 Copies of tet genes/copies of 16S rRNA under different illumination

不同光照条件下土壤中的可培养细菌菌落数之间不存在较大差异，都在3.52×10⁶~3.78×10⁶ CFU ·g^-1范围之内(如表 2)，属于同一个数量级，但不同光照条件下土壤中的四环素耐药菌菌落数却差异明显(P＜0.05)，随着光照度的增加四环素耐药菌菌落数逐渐减少. 在本研究中可以看出相同条件下，土壤中四环素耐药菌菌落数的减少对应着四环素抗性基因总含量的降低，两者的变化趋势相契合，由此可以推断在不同的光照条件下，四环素耐药菌菌落数与四环素抗性基因总含量之间具有对应关系，四环素耐药菌菌落数可以决定土壤中四环素抗性基因总含量. 究其其他原因，tetA、 tetC基因的含量与土壤中四环素的残留量存在着正相关性^[19]，四环素类抗生素具有光解特性^[23]，强光照更易促进四环素类抗生素的降解^[24]，同时本试验中采用的是日光灯光源，日光灯光源相较其他光源更有利于四环素类抗生素的降解^[25]，这可能也导致了土壤中四环素抗性基因生成量的减少.

表 2(Table 2)

表 2 不同光照条件下土壤中可培养菌菌落数与四环素耐药菌菌落数Table 2 Amount of cultivable and drug resistant bacteria in soil under different illumination 光照度/lx 可培养菌菌落数×106/CFU·g-1 四环素耐药菌菌落数×106/CFU·g-1 0 3.69±0.09 1.93±0.04 500 3.52±0.03 1.72±0.03 1000 3.54±0.07 1.54±0.05 5000 3.67±0.07 1.18±0.05 10000 3.78±0.04 0.51±0.07 20000 3.64±0.04 0.27±0.04

表 2 不同光照条件下土壤中可培养菌菌落数与四环素耐药菌菌落数Table 2 Amount of cultivable and drug resistant bacteria in soil under different illumination

图 8

Fig. 8

图 8 不同pH条件下四环素抗性基因相对表达量Fig. 8 Copies of tet genes/copies of 16S rRNA under different pH condition

利用RT-PCR绝对定量得到了不同pH条件下土壤中tetA和tetC基因的含量，根据表 3可以看出 tetA基因和tetC基因的含量范围分别为527~6 954 copies ·g^-1和1.21×10⁶~2.54×10⁶ copies ·g^-1. 相较于在pH=7时tetA基因的含量达到最大，tetC基因的含量在pH=7.5时达到峰值. 在pH=7.5时四环素抗性基因的总含量最高，为2.55×10⁶ copies ·g^-1，与pH=7时相当(P=0.151). 同时这两个pH条件下tetA和tetC基因的含量都明显区别于其他条件(P<0.05)，说明pH条件能够影响四环素抗性基因的生成. 比较酸性(pH<7)、 中性(7≤pH≤7.5)与碱性(pH>7.5)条件下四环素抗性基因的含量可以发现，中性条件下四环素抗性基因的含量明显高于酸性和碱性条件(P<0.05)，同时碱性条件下四环素抗性基因的含量又明显低于酸性条件(P<0.05)，更为直观的是在pH=8.5时，tetA和tetC基因的含量仅为527 copies ·g^-1和1.21×10⁶ copies ·g^-1，与tetA和tetC基因的含量峰值相比各减少了92.42%和52.22%. 由此可以推断中性条件比较适宜四环素抗性基因的生成，碱性条件下抗性基因的生成量会随着pH值的升高而减小. 同时从图 8中可以看出，tetA、 tetC基因与16S rRNA表达量的比值分别介于10^-3.777~10^-2.759与10^-0.409~10^-0.262之间，在pH=7时tetA基因与16S rRNA表达量比值最大，pH=6时tetC基因与16S rRNA表达量比值最大，tetA基因与16S rRNA表达量比值与土壤中tetA基因含量在各pH条件间的变化趋势相近，说明不同pH条件下，土壤中tetA基因的含量与土壤中整体微生物丰度有关. 而tetC基因与16S rRNA表达量比值与土壤中tetC基因含量在各pH条件下呈现不同的变化趋势，说明土壤中tetC基因的含量与土壤中整体微生物丰度无关.

表 3(Table 3)

表 3 不同pH值下土壤中四环素抗性基因的含量Table 3 Amount of tetracycline resistant genes in soil under different pH conditions pH 可培养菌菌落数×106/CFU·g-1 四环素耐药菌菌落数×106/CFU·g-1 tetA基因含量/copies·g-1 tetC基因含量×106/copies·g-1 6 1.97±0.03 0.11±0.01 860±98 1.75±0.06 6.5 2.01±0.06 0.15±0.02 4290±321 1.96±0.04 7 2.13±0.09 0.14±0.01 6954±391 2.20±0.07 7.5 2.09±0.07 0.16±0.01 4470±255 2.54±0.08 8 1.27±0.04 0.05±0.01 2010±139 1.40±0.06 8.5 1.04±0.03 0.04±0.01 527±31 1.21±0.04

表 3 不同pH值下土壤中四环素抗性基因的含量Table 3 Amount of tetracycline resistant genes in soil under different pH conditions

本研究中，随着pH条件的改变，土壤中四环素耐药菌菌落数也随着产生相应变化(如表 3)，当pH值在6.5~7.5之间时土壤中四环素耐药菌菌落数相当，变化比较平缓，远大于pH>7.5时土壤中四环素耐药菌菌落数. 将土壤中四环素耐药菌菌落数的变化趋势与tetA与tetC基因含量的变化趋势进行比对，发现两者随pH改变的变化趋势吻合，进一步证明了土壤中四环素耐药菌与四环素抗性基因的对应关系. 可以推断pH的变化带动了四环素耐药菌菌落数的改变，耐药菌菌落数的改变影响到了四环素抗性基因的生成. 同时Jiao等^[26]的研究发现，四环素在碱性条件易分解，而酸性条件则能明显促进四环素的稳定性，四环素残留量的改变也可能影响到了四环素抗性基因的生成.

分析比较本研究中所有的土壤培养条件可以发现，温度、 光照条件的设置都以好氧培养作为前提，pH条件是在缺氧条件下进行培养，因此可以把本研究中采用的环境条件分为两大类，即好氧条件诱导与缺氧条件诱导. 本研究中每个试验组都设置3个平行对照，因此将本研究对象分为好氧条件下的30个样本，缺氧条件下的18个样本. 将好氧条件与缺氧条件下土壤中可培养细菌菌落数与四环素抗性基因含量(tetA与tetC含量之和)进行线性拟合发现，好氧条件下得线性方程为y=0.1631x+1.7045 (n=30)，线性系数R2=0.0141，缺氧条件下线性方程为y=0.7963x+0.3445(n=18)，线性系数R2=0.2536，可以发现好氧与缺氧条件下可培养细菌菌落数与四环素抗性基因含量水平之间不存在明显的线性关系.

进一步将好氧条件与缺氧条件下土壤中四环素耐药菌菌落数与四环素抗性基因含量进行线性拟合发现，好氧条件下线性方程为y=1.2008x+0.4992(n=30),线性系数R²=0.7872(图 9)，缺氧条件下线性方程为y=9.3166x+0.8328(n=18)，线性系数R²=0.8841(图 10)，可以说明在好氧与缺氧条件下土壤中四环素耐药菌与四环素抗性基因含量之间存在较强的线性关系，即土壤中四环素耐药菌丰度可以决定土壤中四环素抗性基因的含量水平.

图 9

Fig. 9

图 9 好氧条件下四环素抗性基因总量与四环素耐药菌菌落数线性方程(n=30)Fig. 9 Liner equation of tetracycline resistance bacterial colonies and the total amount of resistance genes under aerobic conditions (n=30)

图 10

Fig. 10

图 10 缺氧条件下四环素抗性基因总量与四环素耐药菌菌落数线性方程(n=18)Fig. 10 Liner equation of tetracycline resistance bacterial colonies and the total amount of resistance genes under hypoxic conditions (n=18)

(1)温度、 光照及pH等环境因素都能对四环素抗性基因的形成产生明显的影响，较为合适的环境条件能够显著地促进四环素抗性基因的形成，影响的主要方式为通过影响土壤中四环素耐药菌的诱导与生长，进而影响到耐药菌中四环素抗性基因的生成. 通过调节环境因素可以控制环境中四环素抗性基因的生成量，高温、 强光照及较高的pH条件都能够有效抑制土壤中四环素抗性基因的生成，从而能抑制四环素抗性基因的污染与扩散，促进四环素抗性基因污染水平的控制.

(2)不同的温度、 光照条件下，tetA、 tetC基因的含量与土壤中整体微生物丰度有关，而在不同pH条件下，仅能得出tetA基因的含量与土壤中整体微生物丰度有关.

(3)四环素抗性基因含量水平与土壤中四环素耐药菌数量之间存在着较为显著的正相关关系，土壤中四环素耐药菌丰度对四环素抗性基因的形成也起到了关键性作用，并决定土壤中四环素抗性基因的含量水平. 因此，在目前养殖业中四环素处于持续高水平投入的情况下，有必要调节畜禽粪便的处理条件，减少四环素耐药菌的生长，降低畜禽粪便再利用过程中四环素抗性基因的环境风险，从而保障环境中抗生素抗性基因污染风险处于可控程度.