厌氧氨氧化是指在厌氧的条件下厌氧氨氧化菌利用NH⁺₄-N作为电子供体，NO^-₂-N作为电子受体，通过氧化还原作用将这两种化合态氮转为氮气的生化过程. 与传统的生物脱氮工艺相比，厌氧氨氧化工艺具有脱氮效能高，且在生物反应过程中无需分子氧和有机碳源的参与，节省了大量动力和能源的消耗. 因此，对厌氧氨氧化反应的研究成为热点^[1].

研究者发现厌氧氨氧化菌生长缓慢，影响因子较多，严重制约着反应器的快速启动^{[2, 3, 4]}. 目前众多研究者将研究目标集中于溶解氧、 pH、 温度、 营养基质等环境因子对厌氧氨氧化菌活性的影响^{[5, 6, 7, 8]}，很少关注微量元素对厌氧氨氧化活性的影响. 本课题组前期研究表明适当提高铜、 锌的浓度对厌氧氨氧化菌活性具有明显的刺激作用，有利于厌氧氨氧化反应器的启动^[9]. da Graaff等^[10]研究表明Ca²⁺不仅能够刺激厌氧污泥的活性，同时也能够影响厌氧颗粒污泥的结构. 说明部分微量元素对微生物活性的提高具有重要的意义.

近年来van Niftrik 等^[11]研究表明，厌氧氨氧化菌体内的厌氧氨氧化体单元内含有大量的Fe颗粒. 张蕾等^[12]研究表明Strous^[13]的模拟废水配方中Fe含量不能满足厌氧氨氧化菌的需求. 同时厌氧氨氧化体内含有大量血红素，Fe是血红素的重要组成物质，因此，Fe很有可能成为厌氧氨氧化反应器启动过程中的缺乏元素. 然而有关Fe离子浓度变化对厌氧氨氧化菌活性影响的相关报道很少. 另一方面，模拟废水中Fe²⁺易氧化为Fe³⁺，进入到厌氧氨氧化装置中的Fe基本以Fe³⁺为主. 因此研究不同Fe离子价态变化对厌氧氨氧化活性影响也具有重要的意义. 为此本研究通过接种厌氧氨氧化污泥研究了不同价态Fe离子及其浓度对厌氧氨氧化菌活性的影响，旨在为厌氧氨氧化菌培养和反应器启动过程中控制条件的优化提供参考.

接种污泥取至本课题组自2008年成功驯化后长期运行至今的厌氧氨氧化种泥^[14]. 整个培养过程中厌氧氨氧化效果较好，出水NH⁺₄-N、 NO^-₂-N的去除率均保持在98%以上，脱氮效能为20 kg ·(m³ ·d)^-1. 该污泥形态基本为颗粒状，颗粒粒径主要分布在0.5~2 mm之间，MLVSS/MLSS为0.7~0.8.

实验所用废水由人工配置. 废水主要由NH₄Cl(按需配制)、 NaNO₂(按需配制)、 NaHCO₃ 1 000 mg ·L^-1、 KHCO₃ 1 000 mg ·L^-1、 KH₂PO₄ 27 mg ·L^-1、 CaCl₂ ·2H₂O 136 mg ·L^-1、 MgSO₄ ·7H₂O 200 mg ·L^-1、 微量元素Ⅰ1 mL ·L^-1和微量元素Ⅱ1.25 mL ·L^-1组成. 微量元素浓缩液Ⅰ: EDTA 5 000 mg ·L^-1，ZnSO₄ ·7H₂O 430 mg ·L^-1，CoCl₂ ·6H₂O 240 mg ·L^-1，MnCl₂·4H₂O 990 mg ·L^-1，CuSO₄ ·5H₂O 250 mg ·L^-1，NaMoO₄ ·2H₂O 220 mg ·L^-1，NiCl₂·6H₂O 190 mg ·L^-1，NaSeO₄ ·10H₂O 210 mg ·L^-1，H₃BO₄ 14 mg ·L^-1； 微量元素浓缩液Ⅱ: EDTA 5 000 mg ·L^-1，FeSO₄或者FeCl₃(按需配置)，其中为了保持Fe²⁺不被氧化，在废水的配制过程中首先利用高纯氮气将水中的分子氧去除，然后投加Fe粉保持. 其它废水配置后通过高纯氮气进行30 min的曝气，使水中的分子氧能够得到去除.

指标测定方法均按照《水和废水监测分析方法》^[15]. NH⁺₄-N采用纳氏分光光度法； NO^-₂-N采用N-(1萘基)-乙二胺分光光度法； NO^-₃-N采用紫外分光光度法； pH采用哈纳pH211型酸度计^[19]，Fe²⁺、 Fe³⁺采用邻菲啰啉分光光度法.

Fe²⁺、 Fe³⁺浓度变化分别对厌氧氨氧化污泥脱氮效能的影响实验方法: 为了能够等分含水量较高的厌氧氨氧化湿污泥，在每批Fe离子影响实验前，将厌氧氨氧化污泥等分为24份，每份污泥湿重2 g. 在100 mL血清瓶中培养8 h后，选取脱氮效能相近(每批脱氮效能最大差值控制在5％以内，标准偏差分别为1.25，1.33，1.2，1.28)的12支作为一批，进行单一价态Fe离子的影响实验. 每种价态Fe离子影响做2批平行实验. 对每批试管分别进入含有不同Fe²⁺或者Fe³⁺浓度的废水(氨氮和亚硝氮浓度分别为94.2 mg ·L^-1、 128 mg ·L^-1)进行培养，经过10 h培养后，测定废水中含氮化合物的变化，评估Fe²⁺、 Fe³⁺浓度对厌氧氨氧化污泥脱氮效能的影响，以氮去除速率表征污泥活性.

Fe离子价态分别对厌氧氨氧化污泥脱氮效能的影响: 采用2个有效体积500 mL的血清瓶，接种10 g同样的厌氧氨氧化湿污泥，分别标记为R1、 R2. R1进行Fe²⁺长期影响实验，R2进行Fe³⁺长期影响实验. 每个反应器分别接种厌氧氨氧化湿污泥10 g，运行周期设定为10 h. 在研究Fe离子价态对厌氧氨氧化污泥脱氮效能影响的过程中，随着脱氮效能的提高，可适当提高进水氨氮和亚硝氮浓度.

将含有不同Fe²⁺和Fe³⁺浓度培养后的厌氧氨氧化反应器取出，测得出水氨氮和亚硝氮浓度变化如图 1所示(同一价态两批培养瓶的测定值已作平均). 由图 1(a)可知，Fe²⁺浓度变化对厌氧氨氧化菌脱氮效能显著影响. 随着进水Fe²⁺浓度由0 mg ·L^-1增加到5 mg ·L^-1，出水氨氮和亚硝氮浓度分别由50.47 mg ·L^-1和66.37 mg ·L^-1逐渐下降到17.57 mg ·L^-1和29.51 mg ·L^-1. 说明厌氧氨氧化菌的活性受到刺激，增强了其脱氮效能. 许婷等^[16]研究表明，当进水中FeSO₄浓度为0.1mol ·L^-1(Fe²⁺浓度为5.6 mg ·L^-1)时，其出水氮浓度明显低于对照实验. 张蕾等^[12]研究表明，当进水Fe离子浓度为0.075 mmol ·L^-1(4.2 mg ·L^-1)时，厌氧氨氧化反应器最大氮去除速率明显大于进水Fe离子浓度0.03 mmol ·L^-1(1.68 mg ·L^-1)的反应器，并认为总Fe浓度的提高明显增加了氮化合物的转化速度和转化率. 当进水Fe²⁺浓度由5 mg ·L^-1上升到65 mg ·L^-1时，出水氨氮和亚硝氮浓度略有上升，围绕在17.99 mg ·L^-1和30.86 mg ·L^-1左右波动，未观察到因Fe离子浓度过高产生的抑制现象.

图 1

Fig. 1

图 1 Fe2+和Fe3+浓度变化对厌氧氨氧化脱氮效能的影响 Fig. 1 Effect of the change in Fe2+ and Fe3+ concentration on nitrogen removal efficiency of ANAMMOX sludge

Fe³⁺浓度变化对厌氧氨氧化菌脱氮效能短期影响基本与Fe²⁺相同，如图 1(b)所示. 随着进水Fe³⁺浓度由0增加到5 mg ·L^-1，出水氨氮和亚硝氮浓度分别由50.4 mg ·L^-1和66.6 mg ·L^-1逐渐下降到16.66 mg ·L^-1和29.56 mg ·L^-1，说明Fe³⁺浓度的升高也能够对厌氧氨氧化污泥的活性产生刺激. 当进水Fe³⁺浓度由5 mg ·L^-1上升到65 mg ·L^-1时，出水氨氮和亚硝氮浓度围绕在16.46 mg ·L^-1和33.88 mg ·L^-1左右波动，也未观察到因Fe离子浓度过高产生的抑制现象.

前期的实验研究表明铜和锌金属离子对厌氧氨氧化污泥活性的影响可分为3个阶段，分别为刺激阶段、 稳定阶段和抑制阶段^[9]. 而在研究铁离子对厌氧氨氧化活性影响过程中未发现过量的Fe离子对厌氧氨氧化污泥活性产生抑制. 通过测定进出水的Fe离子浓度后发现，随着进水Fe离子浓度的升高，出水Fe离子浓度也会相应地升高. 但是当进水Fe离子浓度大于5 mg ·L^-1时，出水Fe浓度基本不会增加，维持在5~6 mg ·L^-1之间. 通过查阅相关文献资料发现，Fe离子容易产生Fe(OH)₃或者Fe(OH)₂沉淀[Fe(OH)₃溶度积为2.64×10^-39]. 同时厌氧氨氧化过程是一个产生OH^-的过程，所以当pH值达到一定浓度后，更易形成氢氧化物沉淀. 从而避免了高浓度Fe离子对厌氧氨氧化污泥活性的影响. 说明在短时间内Fe²⁺和Fe³⁺浓度变化对氨氧化污泥的影响基本相同，未因价态差异发生显著变化.

为研究Fe²⁺对厌氧氨氧化污泥脱氮效能影响，实验过程中将进水Fe²⁺浓度设定在5 mg ·L^-1，为防止Fe²⁺被氧化，废水中投加了少量铁粉，最终测定进水中Fe²⁺浓度为5.05~5.08 mg ·L^-1之间. 由图 2可知，在反应器R1运行初期，进水氨氮和亚硝氮浓度分别为100.2 mg ·L^-1和128 mg ·L^-1，最高出水氨氮和亚硝氮浓度分别为46.1 mg ·L^-1和54.4 mg ·L^-1，脱氮效能大约0.28 kg ·(m³ ·d)^-1. 随着反应器R1运行时间的延长，出水氨氮和亚硝氮的浓度逐渐下降. 当反应器R1运行到35个周期时，氨氮和亚硝氮去除率达到98%以上，脱氮效能升高到0.47 kg ·(m³ ·d)^-1. 为了进一步增加反应器脱氮效能，在反应器R1运行的第36个周期，增加进水氨氮和亚硝氮浓度分别为120 mg ·L^-1和150 mg ·L^-1，出水氨氮和亚硝氮浓度略有升高，但是经过数周期培养后很快就降低到2.6 mg ·L^-1和7 mg ·L^-1左右，脱氮效能稳定在0.56 kg ·(m³ ·d)^-1. 在反应器R1运行的第60个周期再次增加进水氨氮和亚硝氮浓度分别至140 mg ·L^-1和175 mg ·L^-1，氮负荷增加到0.76 kg ·(m³ ·d)^-1. 又经过12个周期的培养，出水氨氮和亚硝氮浓度降低到6.58 mg ·L^-1和7.5 mg ·L^-1左右，出水硝酸盐浓度增加到29.55 mg ·L^-1左右，脱氮效能最终稳定在0.65 kg ·(m³ ·d)^-1.

图 2

Fig. 2

图 2 Fe2+对厌氧氨氧化菌脱氮的长期影响 Fig. 2 Long-time effect of Fe2+ on nitrogen removal efficiency of ANAMMOX

在研究Fe³⁺浓度对厌氧氨氧化污泥脱氮效能长期影响的实验过程中将进水Fe³⁺浓度设定在5 mg ·L^-1. 如图 3所示，初始进水氨氮和亚硝氮浓度分别为100.2 mg ·L^-1和128 mg ·L^-1，相应地初期出水氨氮和亚硝氮最高浓度为46.75 mg ·L^-1和66.6 mg ·L^-1，脱氮效能为0.29 kg ·(m³ ·d)^-1. 经过57个周期的运行，反应器R2的脱氮效能逐步得到提高，当进水氨氮和亚硝氮浓度分别为95.2 mg ·L^-1和122 mg ·L^-1，出水浓度相应降低到7.2 mg ·L^-1和16.5 mg ·L^-1，此时脱氮效能为0.43 kg ·(m³ ·d)^-1. 在反应器R2运行的第58个周期，进一步增加进水氨氮和亚硝氮浓度至120 mg ·L^-1和150 mg ·L^-1，氮容积负荷增加到0.65 kg ·(m³ ·d)^-1. 当反应器R2运行至71个周期时，出水氨氮和亚硝氮浓度下降到12.9 mg ·L^-1和23.5 mg ·L^-1，脱氮效能稳定在0.51 kg ·(m³ ·d)^-1，是反应器R1脱氮效能的0.78倍. 说明Fe³⁺对厌氧氨氧化污泥活性的刺激作用明显低于Fe²⁺.

图 3

Fig. 3

图 3 Fe3+离子对厌氧氨氧化菌脱氮的长期影响 Fig. 3 Long-term effect of Fe3+ on nitrogen removal efficiency of ANAMMOX

Stours等^[13]最早通过物料守恒计算出厌氧氨氧化过程亚硝氮与氨氮的转化比为1.32，硝态氮与氨氮的转化比为0.26，因此众多研究者在厌氧氨氧化菌富集培养过程中将氮素转化比作为厌氧氨氧化反应特性的重要评价指标^[17]. Fe²⁺和Fe³⁺对厌氧氨氧化反应过程氮转化比的影响如图 4所示. 在进入含Fe²⁺的反应器R1中，亚硝态氮与氨氮的平均转化比为1.24，硝态氮与氨氮的平均转化比为0.22，均低于Strous所报道的计量比^[18]. 这与众多研究者的研究结果相似^[19,20]. 在含Fe³⁺的反应器R2中，亚硝态氮与氨氮的平均转化比为1.17，硝态氮与氨氮的平均转化比为0.19. 含有Fe³⁺反应器R2中的亚硝氮与氨氮转化比明显低于含有Fe²⁺的反应器R1. 张蕾等^[12]研究表明，添加过量的Fe²⁺之后，反应消耗的氨氮多于理论计量值，亚硝态氮与氨氮的平均值分别为1. 02~1. 15，小于理论计量值. 但是未对原因进行详细分析. 从张蕾的实验材料与方法看出，在研究两个Fe²⁺浓度对厌氧氨氧化污泥活性影响的过程中，未对废水进行特别处理. 因此，进入反应器内的Fe²⁺很容易被氧化为Fe³⁺，所以观察到过量的氨氮被转化的现象可能是Fe³⁺引起的. Shrestha等^[21]通过湿地土壤实验室模拟和自然环境中湿地土壤的原位验证研究发现，在湿地厌氧环境中NH⁺₄与Fe³⁺可以进行反应，同时有N₂产生的现象. 进入到反应器R2的所有废水均进行了除氧处理，所以在厌氧氨氧化过程中不可能存在分子氧将氨氮氧化的亚硝化过程. 反应器R2也可能存在某种微生物能够利用Fe³⁺与氨氮进行氧化还原反应，相关研究还需进一步深入分析.

图 4

Fig. 4

图 4 Fe2+和Fe3+离子对厌氧氨氧化过程氮转化比的影响 Fig. 4 Effect of Fe2+ and Fe3+ on nitrogen conversion ratio of ANAMMOX

Fe是生物的重要微量元素之一，同时也是血红蛋白的主要成分. 其浓度不足必然会影响到微生物体内的血红素合成或者能量的传递. Zhu等^[22]证明，铁离子浓度不足时，光合产氢菌(Rhodobacter sphaeroides)的活性会受到限制，铁离子浓度为3. 2 mg ·L^-1时，其产氢量升至最大值. Wei等^[23]利用充足和缺乏Fe³⁺的培养基分别培养氨氧化细菌,在Fe³⁺充足的培养基中生物量较大，是缺乏Fe³⁺培养基生物量的1.6～3.3倍，同时前者的血红素C含量也远远高于后者.

与传统的活性污泥不同，厌氧氨氧化污泥的外观颜色为红色，一般通过观察表面颜色就能比较出厌氧氨氧化污泥活性的高低. 其主要原因就是厌氧氨氧化污泥中含有大量的血红素. 例如，每个羟氨氧化酶含有26个血红素，每个联氨氧化酶含有8个血红素等^[24,25]. 因此，在厌氧氨氧化的富集培养过程中，Fe元素很有可能成为限制因子. Zhang等^[26]利用铁电极研究其对厌氧氨氧化污泥活性的影响，发现电极产生的Fe²⁺对厌氧氨氧化污泥具有较强的刺激作用. 随着电压的提高，出水Fe²⁺浓度也相应提高，促使厌氧氨氧化污泥的活性大幅提高. 由本实验可知，随着进水Fe²⁺和Fe³⁺离子浓度的提高，厌氧氨氧化污泥的活性逐步提高. 当进水铁离子浓度达到5 mg ·L^-1时厌氧氨氧化污泥的活性达到最大. 而Strous等^[18]营养盐配方中铁离子浓度才1.8 mg ·L^-1，明显不能满足厌氧氨氧化菌的需求. 由于厌氧氨氧化反应过程中pH值变化导致溶解性Fe离子浓度降低，阻止了厌氧氨氧化污泥活性的进一步提高. 但同时厌氧氨氧化体系的碱性环境，很好地防御了过多的Fe离子对微生物活性产生抑制作用.

Fe²⁺在水中易氧化为Fe³⁺，根据本课题组长期观察可知进入到厌氧氨氧化装置的模拟废水中Fe离子基本为Fe³⁺. 另一方面，亚硝化作为厌氧氨氧化的前置装置，是一个好氧环境，必然导致进入到厌氧氨氧化体系的Fe离子以Fe³⁺形态存在. 由本实验可知，Fe²⁺比Fe³⁺更有利于厌氧氨氧化菌的快速富集. 因此可以建议在厌氧氨氧化反应器内增加适量的铁块，使得进入反应器内的Fe³⁺转化为Fe²⁺，将更有利于厌氧氨氧化菌的繁殖.

(1)Fe²⁺和Fe³⁺离子浓度变化对厌氧氨氧化菌脱氮效能影响研究结果表明，不同价态的Fe离子对厌氧氨氧化污泥脱氮效能影响没有显著性差异. 当Fe离子浓度由0增加到5 mg ·L^-1时，厌氧氨氧化污泥的活性受到刺激，脱氮效能增加. 当进水Fe离子浓度大于5 mg ·L^-1时，由于厌氧氨氧化反应产生OH^-，Fe离子会形成氢氧化物沉淀，从而避免了Fe离子的毒性抑制.

(2)不同Fe离子价态对厌氧氨氧化菌脱氮效能影响研究结果表明，经过71个周期的培养Fe²⁺反应器的脱氮效由0.28 kg ·(m³ ·d)^-1上升至0.65 kg ·(m³ ·d)^-1，亚硝氮、 硝氮与氨氮的转化比分别为1.24和0.22； Fe³⁺反应器的脱氮效能由0.29 kg ·(m³ ·d)^-1上升至0.51 kg ·(m³ ·d)^-1，亚硝氮，硝氮与氨氮的转化比分别为1.17和0.19. 说明Fe²⁺更适合于厌氧氨氧化菌生长的需求.