2014, Vol. 35
厌氧氨氧化(anaerobic ammonia oxidation，ANAMMOX)是指在厌氧或缺氧条件下，厌氧氨氧化菌以氨氮为电子供体，以亚硝态氮为电子受体，将两者转化为氮气的过程[1, 2]. 与传统硝化-反硝化工艺相比，厌氧氨氧化具有耗氧量少、 污泥产量低、 无需外加碳源和无二次污染等优点[2]，是目前最简捷的废水生物脱氮途径.
影响厌氧氨氧化反应的因素很多，主要包括温度[3]、 pH值[4]、 溶解氧(dissolved oxygen，DO)[5]、 废水水质[6]、 光照[1]和生物量[7]等，厌氧氨氧化菌生长缓慢，倍增时间长达11 d[8]，并且只有高细胞浓度时才具有活性. 由于厌氧氨氧化反应的最适温度在30~43℃[9]之间，最适pH值在6.70~8.40[8]之间，因此，目前厌氧氨氧化的研究主要集中在污泥消化上清液和垃圾渗滤液等高温高氨氮废水[10, 11]，但对常温低基质下的厌氧氨氧化工艺还研究甚少[12]. 本文研究了进水碱度、 光照条件和DO对常温低基质上向流厌氧氨氧化生物滤柱的脱氮性能的影响，同时利用16S rRNA克隆测序及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术对滤柱内的厌氧氨氧化菌群进行了分析，旨在为以后厌氧氨氧化工艺应用于处理城市污水工程中碱度和溶解氧的控制作参考.
1 材料与方法 1.1 实验装置实验是在一个有效容积3.8 L的上向流生物膜反应器中进行，采用1~5 mm粒径的页岩陶粒作为载体，孔隙率为39.8%，反应器装置如图 1. 本实验初期，反应器外侧用黑色塑料布覆盖，以防止光对厌氧氨氧化菌活性的影响，待考察光照对反应器效能的影响时，再将塑料布揭开.
 | 图 1 实验装置及流程示意 Fig. 1 Schematic diagram of the ANAMMOX reactor |
厌氧氨氧化反应器实验用水成分[13]为: KHCO3 500 mg ·L-1,KH2PO4 27.2 mg ·L-1,MgSO4 ·7H2O 300 mg ·L-1,CaCl2 136 mg ·L-1,FeSO4 ·7H2O 9 mg ·L-1,EDTA 5 mg ·L-1,微量元素 1 mL ·L-1 (EDTA 15000 mg ·L-1,CuSO4 ·5H2O 250 mg ·L-1,ZnSO4 ·7H2O 430 mg ·L-1,CoCl2 ·6H2O 240 mg ·L-1,MnCl2 ·4H2O 990 mg ·L-1,NaMoO4 ·2H2O 220 mg ·L-1,NiCl2 ·6H2O 190 mg ·L-1,NaSeO4 ·10H2O 210 mg ·L-1,H3BO3 14 mg ·L-1)，NaNO2和(NH4)2SO4分别提供电子受体和电子供体，其添加量适时调整. 反应器进水用氮气进行吹脱以降低DO含量. 进水碱度、 DO、 pH随实验阶段的不同而变化. 本实验开始前，反应器已经在高温(33℃±1℃)和常温(20℃±2℃)条件下分别运行了338 d和111 d[14]，常温阶段平均总氮去除负荷为1.1 kg ·(m3 ·d)-1.
1.3 分析方法NH+4-N: 纳氏试剂分光光度法； NO-2-N: N-(1-萘基)-乙二胺光度法； NO-3-N: 麝香草酚分光光度法； pH采用inoLab pH740 pH测定仪； DO、 T均采用inoLab Oxi730溶解氧仪； 碱度(CaCO3): 酸碱指示剂滴定法.
1.4 总DNA提取第141 d，取200 mL滤柱下部微生物样品，12.000 g，4℃离心10 min，收集沉淀. 沉淀加入10 mL，0.1 mol ·L-1的磷酸缓冲液(PBS，pH 8.0)重悬2次. 总DNA提取参考文献[15]进行，之后进行纯化回收.
1.5 PCR扩增采用细菌通用引物27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[16]进行扩增，反应体系组成为: DNA模板1.0 μL，10×Buffer 2.5 μL,dNTPs (2.5 mmol ·L-1) 2.0μL，上游引物和下游引物(20 μmol ·L-1)各0.5 μL，Ex Taq 酶(5 U ·μL-1) 0.125 μL，补水至终体积为25 μL. PCR扩增条件为: 95℃，5 min； 95℃，45 s； 55℃，45 s； 72℃，1 min； 30个循环； 72℃，10 min. PCR产物采用DNA纯化回收试剂盒(天根，中国)纯化回收.
1.6 克隆测序及系统发育分析将纯化回收的PCR产物连接到载体pMD19-T(TaKaRa，日本)上，并转化到感受态细胞Escherichia coli DH5α(天根，中国)中. 阳性克隆送交上海生工生物公司(中国)进行测序. 获得的序列通过NCBI网站的BLAST工具搜索相近序列，并进行比对. 本研究所测得的ANAMMOX菌16S rRNA序列已提交至GenBank，登录号为KF810104~KF810111.
1.7 FISH分析第141 d，另取10 mL滤柱下部微生物样品，按照Amann等[17]的操作方法进行FISH分析. 所用的寡核苷酸探针列于表 1. 最后用DAPI溶液(10 mg ·L-1)复染所有微生物，室温下染色5 min，超纯水冲洗，空气风干. 采用OLYMPUS BX-51荧光显微镜对污泥样品随机拍摄20张照片进行定量分析[18,19].
2 结果与讨论 2.1 进水碱度及光照对厌氧氨氧化反应器效能的影响实验滤柱为已稳定运行449 d的厌氧氨氧化生物滤柱. 其中高温(33℃±1℃)和常温(20℃±2℃)条件下分别运行了338 d和111 d[14]，常温阶段平均总氮去除负荷为1.1 kg ·(m3 ·d)-1，水力停留时间(hydraulic residence time，HRT)为3 h，平均进水氨氮和亚硝氮浓度分别为72 mg ·L-1、 77 mg ·L-1，平均进水碱度为350 mg ·L-1. 碱度是厌氧氨氧化菌的重要基质. 通过逐渐降低进水碱度/氨氮浓度(Alkalinity/ammonia，A/a)，分别在平均进水A/a值为5、 1.9、 1.2、 0.6、 0的条件下考察厌氧氨氧化反应器效能，见图 2(1~38 d). 随着平均进水A/a值的降低，进水pH值从7.61依次降至6.6，出水氨氮浓度从最初的1.9 mg ·L-1持续升高至20.6 mg ·L-1，氨氮去除率从97.2%降至71.6%，当平均进水A/a值≥0.6时，出水亚硝氮浓度为0.21 mg ·L-1±0.2 mg ·L-1，亚硝氮去除率稳定在99.7%，仅当平均进水A/a值降至0时，出水亚硝氮浓度突跃至4.9 mg ·L-1. 在整个过程中，由于配水中不含碳源，反应器中反硝化菌的活性受到抑制[22]，而随着碱度的降低，出水硝氮浓度从13.5 mg ·L-1增至19.4 mg ·L-1，总氮去除率从89.7%±1.7%降至70.6%±0.3%，说明进水碱度≤350 mg ·L-1时，碱度的变化对于厌氧氨氧化菌活性的影响较大. 碱度的降低对于亚硝氮去除率的影响较小，原因可能是反应器进水用自来水配水，虽然用氮气进行吹脱除氧，但仍含有一定浓度的DO，由于长时间的运行，反应器内存在一定数量的硝酸菌，而在常温条件下，这些硝酸菌对于碱度或者pH的耐受范围较强所致，出水硝氮浓度的增加也证实了碱度的降低对于硝酸菌活性影响较小.
 | 表 1 FISH分析中采用的寡核苷酸探针 Table 1 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes used |
 | 图 2 进水碱度及光照对反应器效能的影响 (HRT=3 h) Fig. 2 Effects of alkalinity and light on nitrogen removal performance in the reactor (HRT=3 h) |
从第40 d起，进水碱度恢复至350 mg ·L-1，进水pH为7.6，反应器进行了两周的活性恢复阶段，总氮去除率恢复至第1 d的水平，随后，第56~66 d，揭去覆盖在反应器外侧的黑色塑料布. 当存在自然光照情况下，氨氮去除率较没有光照时的氨氮去除率降低12.3%. 光能抑制厌氧氨氧化菌的活性，降低30%~50%的氨氮去除率[1]. 但是由于反应器是以陶粒为填料的生物滤柱，自然光由于外部陶粒的阻挡，内部陶粒表面的生物膜不受其影响，所以氨氮去除率下降较少.
 | 图 3 进水DO对反应器效能的影响 (HRT=1.5 h) Fig. 3 Effects of DO on nitrogen removal performance in the reactor (HRT=1.5 h) |
第119 d，进水氨氮和亚硝氮浓度分别降至29 mg ·L-1和41 mg ·L-1，但进水量加倍，故总进水负荷不变，HRT 从3 h缩短至1.5 h. 本研究暂不讨论HRT因素的影响. 随后当HRT为1.5 h时，考察了DO的变化对于厌氧氨氧化反应器效能的影响，见图 3. 第120~145 d和前120 d一样，进水配水用氮气进行吹脱除氧，同时配水桶用氮气袋进行密封，平均进水DO<2.0 mg ·L-1. 总氮去除率升高并稳定在87.1%±2.7%，厌氧氨氧化活性得到恢复. 第146~165 d，进水配水不再用氮气进行吹脱除氧，仅配水桶用氮气袋进行密封. 由于氮气袋的存在，隔绝了外界的空气，而配水桶或自来水里存在一定量的好氧菌，使得平均进水DO在配水2 h后降至2.5 mg ·L-1±0.5 mg ·L-1. 如图 3所示，平均氨氮去除率和亚硝氮去除率维持在接近100%，总氮去除率最开始呈现了缓慢下降的趋势，但逐渐稳定在83.8%±0.6%. 第166~177 d，进水配水不再用氮气进行吹脱除氧，配水桶也不再用氮气袋进行密封，平均进水DO为8.6 mg ·L-1. 如图 3所示，出水氨氮浓度升至5.6 mg ·L-1，说明高溶解氧对于厌氧氨氧化菌的活性有抑制作用. 但当进水DO≤3 mg ·L-1时，总氮去除率依然保持较高的水平，平均氨氮去除率和亚硝氮去除率分别为99.7%和100%，平均总氮去除负荷为1.0 kg ·(m3 ·d)-1. 对于生物滤柱反应器，生物膜外侧的亚硝酸菌和硝酸菌消耗一定量的DO，从而保护生物膜内层的厌氧氨氧化菌，同时水相中的DO进入到生物膜内部也需要一定的阻力[23]，因此厌氧氨氧化菌活性得到维持，平均总氮去除负荷较本实验进行前的1.1 kg ·(m3 ·d)-1下降很少.
2.3 克隆测序分析实验得到36条16S rRNA有效序列，序列长度为1 505 bp左右. 测序结果在GenBank数据库中进行Blast比对. 将序列比对结果相同的克隆子定义为一个操作单元(operational taxonomic unit，OTU)，共得到15个OTU，属于厌氧氨氧化菌的有2个OTU，其中所含克隆子比例及相似菌株见表 2. 16S rRNA克隆测序鉴定结果表明，滤柱下部的厌氧氨氧化菌种类为Candidatus Jettenia asiatica和Candidatus Brocadia sp.，这两种菌对20℃±2℃水温有很好的适应性. 大多数对于废水处理厌氧氨氧化菌的研究发现，虽然不同反应器内ANAMMOX菌属可能不同，但其种类比较单一，以某一种为主[24]，本实验反应器内ANAMMOX菌属以Candidatus Jettenia asiatica为主.
| 表 2 反应器内厌氧氨氧化菌16S rRNA测序结果 Table 2 16S rRNA sequence of ANAMMOX bacteria in the reactor |
利用ANAMMOX菌的特异性探针Amx820(红色)和NOB的特异性探针Nit3(绿色)、 NSR1156(绿色)对反应器底部第141 d微生物样品进行杂交，FISH结果如图 4所示. 当反应器运行到第141 d时，ANAMMOX菌占总菌群的比例为38.1%±1.7%，NOB为1.9%±0.3%. 说明在常温20℃±2℃，主反应区存在一定量DO的情况下，ANAMMOX菌是系统中的优势菌属，其对20℃±2℃水温有很好的适应性. 另外，反应器中存在一定量的硝化细菌，能够消耗水中的溶解氧为ANAMMOX菌去除氧毒[25]，与之前分析结果一致. 反应器的总氮去除负荷依然保持在很高的水平，实现厌氧氨氧化菌工艺的稳定运行，为以后厌氧氨氧化工艺应用于处理城市污水工程提供一定参考.
 | 图 4 反应器底部微生物的荧光原位杂交图像 (141 d) Fig. 4 FISH micrograph of microorganisms obtained from the bottom of the reactor (141 d) |
(1)当进水碱度≤350 mg ·L-1时，随着碱度的降低，总氮去除率从89.7%±1.7%降至70.6%±0.3%，当进水碱度为350 mg ·L-1时，总氮去除率稳定在89.7%±1.7%.
(2)当存在自然光照情况下，氨氮去除率较没有光照时的氨氮去除率降低12.3%.
(3)当进水DO≤3 mg ·L-1时，总氮去除率依然保持较高的水平，平均氨氮去除率和亚硝氮去除率分别为99.7%和100%，平均总氮去除负荷为1.0 kg ·(m3 ·d)-1.
(4)16S rRNA克隆测序鉴定结果表明，滤柱下部的厌氧氨氧化菌种类为Candidatus Jettenia asiatica和Candidatus Brocadia sp.，这两种菌对20℃±2℃水温有很好的适应性.
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