光照是影响微藻细胞生长及生化成分变化最重要的环境因子之一，它对微藻的生长代谢、 光合作用、 藻体颜色、 细胞形态建成及代谢产物积累均有重要的影响^[1,2]. 自然界中光照的变化具有一定规律性和稳定性，微藻在长期进化过程中形成了对光照反应的特异性. 因此，研究光照作用及应用适当的光照技术培养微藻，加快其生长繁殖，调节其营养成分，是提高其产量和质量的重要途径^{[3, 4, 5]}. 光照作为一个复杂的生态因子，其对微藻生长的作用因素主要包括光质、 光强和光周期^{[6, 7, 8]}. 由于光强和光周期的调节较容易实现，以往研究光环境对微藻生长的调节作用，偏重于光强和光周期. 而对于传统的生态照明光源，其比较难以实现合适配比的混光，因此光质对微藻生长及代谢的影响研究主要以单色光的影响为主^{[1, 2, 3, 4, 5, 6]}.

目前用于微藻培养的光源有荧光灯、 水银灯和卤钨灯等，并主要以荧光灯为主^[9,10]. 荧光灯作为日常照明，无论从光谱结构还是从发光效率上看都是比较理想的选择，但是其发射光谱与水生生物的选择性吸收光谱不匹配，针对性差、 光效低、 能耗大、 大量发热影响水温，故将其作为生态照明光源用于微藻的培养还存在很大的局限性. 近年来，发光二极管(light emitting diode,LED)作为一种新型冷光源因具有电源电压低、 耗电少、 投光远、 工作温度范围宽、 机械强度高、 节能高效、 稳定性强、 多色、 窄带、 直流、 显色性好、 安全、 环保、 高亮度、 低能耗、 长寿命、 体积小、 发热少、 响应快、 无频闪、 无污染、 无辐射、 无故障等优点^[11]，已经在生态照明领域展现出非常广阔的应用前景^{[12, 13]}. 此外，LED具有冷却负荷低、 电光转换效率高、 可设特定波长的光质等特点，光源发热量小，且LED光源光质纯，可按需获得纯正单色光与复合光谱，对微藻培养是一种非常适合的人工光源^{[13, 14, 15]}. 到目前为止，LED光源的应用研究多以组培苗为主，且应用研究主要集中于单色光对植物生长发育的影响，而用于改进微藻培养方面研究的生态光源主要以荧光灯为主，基于LED光源不同配比混光对微藻细胞培养特征影响的研究报道较少^{[1, 2, 3, 4, 5, 6]}. 因此，本研究以LED光源为基础，分析了单色光和不同配比混光对蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)生长特征及生化组成的影响，以期为LED光源在微藻培养中的广泛应用提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 实验材料与培养基 1.1.1 实验藻种

选择蛋白核小球藻(FACHB-9)为实验藻种，购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库. 1.1.2 培养基

蛋白核小球藻培养采用SE培养基，具体配方参考文献^[16]. 1.2 培养方法

将培养至对数生长期的藻种转接到装有150 mL新鲜无菌培养基的三角瓶中(250 mL)，使初始D₆₈₀约为0.1，并用灭菌的多层纱布进行封口包扎. LED光质条件(红蓝光不同配比)分别设置为红光 ∶蓝光8 ∶1、 红光 ∶蓝光8 ∶2、 红光 ∶蓝光8 ∶3、 蓝光(463 nm)、 红光(620 nm)和白光，培养温度为(25±1)℃，光照强度均为100 μmol ·(m² ·s)^-1，光暗周期为12 h/12 h，每个处理设置3个重复，相同的CO₂条件下，采用一次性培养，研究不同光质对蛋白核小球藻的生长特征和生化组成的影响，接种培养30 d后对蛋白核小球藻生长特征和生化组成的指标进行测定. 实验所用LED灯具均由杭州汉徽光电科技有限公司提供. 1.3 测定指标与测定方法 1.3.1 微藻细胞生长测定

每隔24 h取样一次，用紫外可见分光光度计测定藻液在680 nm处的光密度值，用D₆₈₀的变化表征微藻细胞的生长情况^[16]. 1.3.2 比生长速率

在蛋白核小球藻对数生长期开始和结束分别选取两个时间点t1和t2，分别测定藻细胞在680 nm处的光密度值，其比生长速率通过公式μ=(lnX2-lnX1)/(t2-t1)进行计算，式中，μ为比生长速率(d^-1)，X1和X2分别为实验开始和结束时的D₆₈₀值^[16]. 1.3.3 微藻生物量测定

在生长末期，取一定体积的藻液，10 000 r ·min^-1离心10 min，收集藻细胞，双蒸水洗涤2次后10 000 r ·min^-1离心5 min，收获新鲜藻体，将藻体烘干，称重，通过公式(生物量=烘干藻体重量/藻液体积)计算生物量. 1.3.4 叶绿素含量测定

离心收获体积为20 mL的藻类细胞，加入90%丙酮，在4℃黑暗条件下抽提12 h，分别于630 nm和664 nm处测定光密度值，通过公式计算出叶绿素含量^[16]. 1.3.5 β-胡萝卜素含量测定

离心收获体积为20 mL的微藻细胞，加入90%丙酮，在4℃黑暗条件下抽提 12 h，于450 nm处测定光密度值，通过公式计算出β-胡萝卜素含量^[16]. 1.3.6 藻蛋白含量测定

分别测定藻液中总氮含量及离心(10 000 r ·min^-1，5 min)后上清液中总氮含量，两者之差为藻体的含氮量，藻体含氮量的6.27倍即为藻体内蛋白含量^[16]. 1.3.7 总脂含量测定

参照胡章喜等^[17]的干重法. 称取一定量干藻粉用蒸馏水悬浮，加入6 mL甲醇/氯仿混合液(2 ∶1，体积分数)振荡2 h，离心，将氯仿层转移至预先称重的螺口试管中，60℃下用氮气将氯仿吹干，称重. 螺口试管前后质量之差即为总脂质量，按照以下公式计算藻粉中总脂所占质量分数(ω)：ω=(总脂质量/藻粉质量)×100%. 1.4 统计方法

本研究的数据处理和图表制作采用Excel 2010进行，统计分析采用SPSS 19.0进行. 2 结果与分析 2.1 光质对蛋白核小球藻生长特征的影响 2.1.1 不同光质蛋白核小球藻的生长曲线

蛋白核小球藻接种之后在不同光质下的生长曲线如图 1. 接种后的前15 d，藻细胞处在迟滞生长期，增长速度缓慢，不同光质藻细胞光密度没有显著差异. 接种20 d后，藻细胞进入对数生长期，不同光质藻细胞光密度开始呈现明显差异，蓝光下蛋白核小球藻长势较好，并且随着培养时间的增加，蓝光下的生长优势越显著. 接种30 d后，蓝光下蛋白核小球藻D₆₈₀约为2.4，红光下约为1.2，其它光质条件下约在1.0~1.7之间.

图 1

Fig. 1

图 1 不同光质蛋白核小球藻的生长曲线 Fig. 1 Growth curve of Chlorella pyrenoidosa under different light quality

接种之后第12~30 d，不同光质蛋白核小球藻的比生长速率在0.07~0.10 d^-1之间，其中蓝光下其比生长速率较高，约为0.10 d^-1，红光下较低，约为0.07 d^-1(图 2).

图 2

Fig. 2

图 2 不同光质蛋白核小球藻的比生长速率 Fig. 2 Growth rate of Chlorella pyrenoidosa under different light quality

蛋白核小球藻接种后培养30 d，不同光质其生物量积累的差异较大，红蓝8 ∶1、 红蓝8 ∶2、 红蓝8 ∶3、 红光、 白光下蛋白核小球藻生物量分别为0.27、 0.36、 0.32 、 0.31、 0.38 g ·L^-1，蓝光下蛋白核小球藻生物量最大，达到0.64 g ·L^-1(图 3)，分别约为红蓝8 ∶1、 红蓝8 ∶2、 红蓝8 ∶3、 红光、 白光生物量的2.4倍、 1.8倍、 2.0倍、 2.1倍和1.7倍.

图 3

Fig. 3

图 3 不同光质蛋白核小球藻的生物量 Fig. 3 Biomass of Chlorella pyrenoidsa under different light quality

图 4

Fig. 4

图 4 不同光质蛋白核小球藻的叶绿素含量 Fig. 4 Chlorophyll content of Chlorella pyrenoidsa under different light quality

蛋白核小球藻接种后在不同光质条件下培养30 d，不同光质藻细胞内叶绿素含量变化趋势如图 4. 从中可以看出，单位细胞干重的叶绿素a含量蓝光最低，约为8.4 mg ·g^-1，红蓝混光较高，红蓝8 ∶1、 红蓝8 ∶2、 红蓝8 ∶3叶绿素a含量分别约为13.5、 12.8、 13.2 mg ·g^-1，而红光为11.5 mg ·g^-1. 单位细胞干重的叶绿素b含量红光最低，约为4.8 mg ·g^-1，其它光质没有显著差异，红蓝8 ∶1、 红蓝8 ∶2、 红蓝8 ∶3、 蓝光和白光叶绿素b含量分别为6.3、 6.1、 6.6、 6.4和 6.4 mg ·g^-1. 不同光质叶绿素a+b含量的变化趋势与叶绿素a的基本相同，单位细胞干重的叶绿素a+b含量蓝光最低，约为14.8 mg ·g^-1，红蓝混光较高，红蓝8 ∶1、 红蓝8 ∶2、 红蓝8 ∶3叶绿素a含量分别约为19.8、 18.8、 19.8 mg ·g^-1，而红光为16.4 mg ·g^-1. 2.2.2 不同光质蛋白核小球藻的β-胡萝卜素含量

不同光质条件下β-胡萝卜素含量的变化规律如图 5. 单位细胞干重的β-胡萝卜素含量蓝光最低，为3.6 mg ·g^-1，而红蓝8 ∶1和红蓝8 ∶3的β-胡萝卜素含量分别约为5.8 mg ·g^-1和5.7 mg ·g^-1，红光则为4.9 mg ·g^-1.

图 5

Fig. 5

图 5 不同光质蛋白核小球藻的β-胡萝卜素含量 Fig. 5 The β-carotene content of Chlorella pyrenoidsa under different light quality

不同光质条件下蛋白质含量的变化规律如图 6. 单位细胞干重的蛋白质含量红蓝8 ∶3和白光较高，分别为489.3 mg ·g^-1和488.5 mg ·g^-1，蓝光下蛋白质含量较低，为400.9 mg ·g^-1，而红光下蛋白质含量为456.7 mg ·g^-1.

图 6

Fig. 6

图 6 不同光质条件蛋白核小球藻的蛋白质含量 Fig. 6 Protein content of Chlorella pyrenoidsa under different light quality

不同光质条件下蛋白核小球藻总脂含量的变化规律如图 7. 总脂含量红蓝8 ∶1较高，为31.1%，蓝光下较低为23.2%，而红光下为25.2%.

图 7

Fig. 7

图 7 不同光质条件蛋白核小球藻的总脂含量 Fig. 7 Total lipid content of Chlorella pyrenoidsa under different light quality

光合作用是微藻合成细胞内物质的基本途径，微藻通过对光能的吸收、 传递和转化将光能转化为自身所需的物质^[18]. 与高等植物相比，微藻的色素体及色素组成相对复杂，如蓝藻门色素体无质体，色素分散，含有叶绿体a、 β-胡萝卜素、 藻蓝素、 藻黄素和藻红素等多种色素； 绿藻门色素体和叶绿体呈杯、 环节螺旋带状、 星状、 网状等多种，而不同的色素体和色素组成对光质的需求不完全相同^[19]. Aidar等^[3]发现微小环藻(Cyclotella caspia)在蓝-绿光下生长速率最高，而亚心形扁藻(Tetraselmis gracilis)在红光下生长较快； Wang等^[15]发现红光能够提高钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)比生长速率，而其在蓝光下光量子转换成生物量的效率最低； Das等^[5]研究发现蓝光能够提高微拟球藻(Nannochloropsis sp.)的比生长速率，而红光下微拟球藻的比生长速率最低； Shu等^[20]在研究中发现红光有利于小球藻(Chlorella sp.)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混合培养体系生物量的积累； 沈银武等^[21]报道了蓝光下中华植生藻(Richelia sinica)生长缓慢； 王伟^[22]发现中华盒形藻在白光下的细胞日增殖率最大，蓝光次之； 毛安君^[13]采用单色LED光源和荧光灯从效率和速率两个角度研究了光源光谱对海生小球藻(Chlorella vulgari)和等鞭金藻(Isoch rysis galbana Parke 8701)生长的影响，发现连续光谱能够促进最大生长率，蓝光促进生长的效率较高，两者组合能够较好地兼顾效率和速率. 以上的研究结果说明，不同微藻的色素系统组成不同，其在光合作用过程中对光质的需求不同. 如钝顶螺旋藻生长需要较低[330 μmol ·(m² ·s)^-1]的光强，而蓝光具有较高的光量子和光合效率，因此红光更能促进钝顶螺旋藻的生长^[23]，而红光能够高效激活原始河口底栖微藻叶绿素分子，加速其光合作用和细胞分裂速率，促进底栖微藻叶绿素等细胞内含物的积累^[24].

微藻光合器官中捕获光能主要是由光合色素完成，所以光环境(包括光质、 光强和光周期)的改变对微藻光合色素形成具有重要影响^[25]. 本研究发现红蓝光有利于蛋白核小球藻叶绿素a和β-胡萝卜素的合成，蓝光可促进叶绿素b的合成. 然而，对于中华植生藻(Richelia sinica)，蓝光更有利于叶绿素a和β-胡萝卜素的合成^[21]，绿光下紫球藻细胞体内的藻红素含量增加，红光下藻红素含量下降，叶绿素含量增加. 因此，微藻培养过程中光质条件的变化会引起其光合色素含量的改变. 微藻进行光合作用的能量来源主要是光合色素捕获的光能，所以光合色素含量的高低，与微藻的光合速率密切相关. 红光可在转录水平上调节捕光色素蛋白复合体(LHC)的合成，而蓝光和近紫外光对光合作用的调控，主要集中于叶绿体的分化和运动以及调节光合作用酶的活性等. 中华植生藻光合放氧与吸氧都以黄光和白光最高，而绿光、 红光和蓝光下较低，代谢作用相对较弱^[21]，红光对底栖藻类光合作用速率有促进作用而蓝光对藻类细胞生长有抑制和伤害作用^[24]，因此微藻种类不同，其光合色素组成机构受不同光质调控的差异显著. 当环境条件(如光照条件和营养盐等)改变时，会影响到藻类光合色素和色素前体的周转和转化(比如类胡萝卜素循环)，从而引起藻类光合色素的变化. 不同光质处理蛋白核小球藻出现了光合色素含量的变化，可能是由于不同光质的作用影响了细胞内光合色素的周转和转化，从而引起了藻细胞色素的降解或合成.

光质的选择对微藻细胞内物质的积累具有十分重要影响，不同光质对蛋白核小球藻蛋白质和总脂的合成积累差异显著. 本研究发现，蓝光虽然有利于蛋白核小球的生长及生物量的积累，但单位细胞干重的蛋白质和总脂含量在所有光质中都是较低的，而红蓝混光更有利于蛋白核小球藻蛋白质和总脂的积累. 王伟^[22]发现蓝光能够促进中华盒形藻蛋白质的合成，而红光下碳水化合物含量增加，脂类含量在蓝光、 红光下有所下降； You等^[6]研究发现红光和蓝光能促进紫球藻(Porphyridium cruentum)的光合效率和胞外多糖的积累； Korbee等^[23]在研究红黄绿蓝白等5种光质对红藻紫菜(Porphyra leucostict)代谢影响时发现，蓝光更加有利于其氮代谢产物的合成与积累，蓝光能促进类菌胞素氨基酸porphyra-334、 palythine和asterine-330的积累，而红黄绿白光有利于shinorine的积累； Shu等^[20]研究发现蓝光更加有利于小球藻和酿酒酵母混合培养体系中油脂的积累； Das等^[5]发现蓝光能够促进微拟球藻脂肪酸甲酯(FAME)的积累. 以上研究均发现不同光质条件下微藻细胞的生化组成不同，而光质对微藻细胞代谢产物合成的影响机制需要进一步进行探索和研究. 4 结论

以LED光源为基础，研究了单色光和不同配比混光对蛋白核小球藻生长特征及生化组分的影响，结果发现: ①蓝光能够明显有利于蛋白核小球藻的生长及促进其生物量的积累； ②红蓝光有利于蛋白核小球藻叶绿素a和β-胡萝卜素的合成，而蓝光可促进叶绿素b的合成； ③红蓝混光更有利于蛋白核小球藻蛋白质和总脂的积累，单位细胞干重的蛋白质和总脂含量蓝光条件下均较低.