磷是湖泊生态系统限制性营养元素,而沉积物作为湖泊磷的“汇”与“源”,其对湖泊磷循环具有重要影响^[1].沉积物磷在形成稳定矿物(永久埋藏)前,若受有机质矿化降解驱动,可发生复杂的迁移转化^[2].当外源磷输入逐步得到控制后,沉积物磷将成为湖泊重要磷源.因此,关于水-沉积物界面磷迁移转化及生物有效性等方面的研究较多^{[3, 4]}.多种磷形态分级方法被用于表征沉积物磷含量及其形态特征^{[2, 5, 6]}.然而这些方法只能定量分析沉积物不同形态有机磷(organic phosphorus,OP)含量,无法揭示有机磷的结构及其生物有效性.无机磷(inorganic phosphorus,IP)是沉积物生物可利用磷的主要形态,以前湖泊富营养化研究重点关注了无机磷.但是,湖泊沉积物中的磷脂、 肌醇磷酸盐及核酸等多种有机磷化合物可被磷酸酶水解转化为无机磷而被藻类或微生物等利用^[7],且湖泊沉积物有机磷占其总磷(TP)比例高达12%~42%^[8].当上覆水或底泥无机磷消耗殆尽时,沉积物有机磷经磷酸酶水解后可为湖泊维持富营养化提供生物可利用磷源.因此,研究沉积物有机磷组成及其生物有效性对于深入阐明富营养化湖泊磷循环机制尤为重要. 滇池水污染严重,每逢春、 秋两季,藻类“水华”频繁暴发.近年来,滇池外源磷输入已得到一定程度控制,但其水质并未明显改善.内源磷负荷可能是维持滇池富营养化的重要因素.有关滇池沉积物磷内负荷的报道较多^[9~11],且多集中在总磷、 无机磷等方面,而对沉积物有机磷却鲜有报道,尤其针对不同形态有机磷及其垂直分布特征和生物有效性方面研究较少.因此,本研究采用改进的Hendly连续提取法分级提取滇池柱状沉积物有机磷^[12],并用酶水解技术分析其酶可水解磷(enzymatically hydrolysable phosphorus,EHP)^{[7, 13, 14]},以期揭示滇池沉积物不同形态有机磷垂直分布及生物有效性,可为全面评价滇池沉积物磷生物有效性提供依据.保护滇池水质应重视沉积物EHP的贡献,沉积物EHP生物地球化学循环可能也是维持滇池富营养化的重要机制^[7]. 1 材料与方法 1.1 样品采集

滇池以海埂为界分为北部草海和南部外海,用GPS定位在滇池选取了4个代表性采样点位(图 1),分别为草海(D2)和外海北、 中、 南(D10、 D18、 D32).其中,草海D2和外海D10是滇池北岸重污染排水区和藻类密集区,外海D18为花卉主生产区,外海D32则靠近磷矿和磷肥厂. 2013年5月在采样点处用装有有机玻璃管(D=10 cm,L=100 cm)的柱状采样器采集沉积物柱样,上部用原样点水样注满后,两端用橡皮塞塞紧,垂直放置带回实验室.在实验室按表层(0~2 cm,2~5 cm)、 中层(5~8 cm,8~12 cm)和底层(12~16 cm,16~20 cm)分层切样,然后用冷冻干燥仪对分层样干燥,干燥后的沉积物样品研磨过100目筛,装入封口袋中密封分析备用.

Figure 1">图 1

Figure 1">Fig. 1

图 1 滇池采样点位示意 Fig. 1 Sampling sites in Dianchi Lake

沉积物TP、 IP和OP测定采用Ruban等^{[15, 16]}在欧洲标准测试委员会框架下发展的SMT分析方法.用改进的Hendly连续提取法对沉积物中无机磷和有机磷分级提取^[12],获得弱吸附态磷(H₂O-P和NaHCO₃-P)、 铁或铝结合态磷(NaOH-P)、 钙结合态磷(HCl-P)和残渣态磷(Residual-P)^[17],其中弱吸附态磷、 铁或铝结合态磷和钙结合态磷为沉积物可提取磷,残渣态磷为H₂O、 NaHCO₃、 NaOH和HCl不可提取磷.提取液中的无机磷(P_i)采用磷钼蓝比色法测定,120℃条件下高温高压消解后测定提取液总磷(P_t),提取液有机磷(P_o)由P_t与P_i相减得到.TP减去各提取态总磷(P_t)可获得残渣态磷.有机质(organic carbon,OC)测定采用重铬酸钾外加热法^[18]. 1.2.2 沉积物酶可水解磷测定

实验使用的磷酸酶见表 1,Tris-HCl缓冲溶液配置酶溶液并进行组合(表 2)^[13].根据Zhu等^[7]测定沉积物可酶解有机磷的实验步骤并结合Turner等^[14]检测土壤可酶解有机磷的方法,磷钼蓝比色法测定滇池沉积物磷提取液(H₂O-P、 NaHCO₃-P和NaOH-P)酶水解后的正磷酸盐浓度.磷提取液酶水解前后正磷酸盐的差值即为沉积物有机磷酶水解量或正磷酸盐释放量^[7],每个样品做2次平行实验.根据组合酶溶液释放的正磷酸盐量将沉积物中EHP分为3种类型^[7,13]: ①活性单酯磷(Labile monoester P,碱性磷酸酶水解释放的正磷酸盐量)； ②二酯磷(Diester P,磷酸二酯酶和碱性磷酸酶释放的正磷酸盐量与活性单酯磷的差值)； ③类植酸磷(Phytate-like P,植酸酶、 磷酸二酯酶和碱性磷酸酶联合作用释放的正磷酸盐量与活性单酯磷、 二酯磷的差值).EHP=Labile monoester P+ Diester P+ Phytate-like P^[13].同时将沉积物磷提取液中未水解的有机磷定义为“未知有机磷”(unknown P_o)^[7].

表 1(Table 1)

表 1 磷酸酶 Table 1 Phosphatases 磷酸酶(缩写) 编号 Sigma 货号 类别 来源 活性(固体)/U·mg-1 碱性磷酸酶(APase) EC3.1.3.1 P7640 Type Ⅰ-S 牛肠粘膜 28.00 磷酸二酯酶(PDEase) EC3.1.4.1 P4506 磷酸二酯酶Ⅰ型，Type Ⅳ 响尾蛇毒液 0.02 植酸酶(Phytase) EC3.1.3.26 P1259 粗产品 小麦 0.03

表 1 磷酸酶 Table 1 Phosphatases

表 2(Table 2)

表 2 磷酸酶组合 Table 2 Combination of phosphatases 组合 缓冲液 pH 水解温度/℃ 可水解磷 APase Tris-HCl 9.0 37 活性单酯磷+聚合态磷 APase+PDEase Tris-HCl 9.0 37 二酯磷+活性单酯磷+聚合态磷 APase+PDEase+Phytase Tris-HCl 7.0 37 植酸磷+二酯磷+活性单酯磷+聚合态磷

表 2 磷酸酶组合 Table 2 Combination of phosphatases

数据分析采用Excel 2003、 SPSS 18.0、 SigmaPlot 10.0及Sufer 11.0软件进行. 2 结果与分析 2.1 滇池沉积物各形态有机磷含量及垂直分布特征 2.1.1 有机磷含量及垂直分布特征

滇池沉积物TP、 IP、 OP含量分别在566.3~2434.0、 292.1~1751.8、 206.2~597.6mg ·kg^-1(平均1641.0、 1071.2、 416.5 mg ·kg^-1,图 2),其中IP、 OP分别占TP的52%~72%、 17%~38% (平均64.0%、 26.5%).滇池沉积物TP以IP为主,与李宝等^[11]研究结论一致,而太湖^[19]、 红枫湖和百花湖^[2,20]沉积物则是以OP为主.滇池沉积物有机磷具有表层富集特征,其垂向含量总体随深度增加而减小,即表层(485.9mg ·kg^-1)>中层(385.3mg ·kg^-1)>底层(378.1mg ·kg^-1),与高丽等^[10]研究结果相似.各点位沉积物有机磷含量呈现由北向南递增趋势,即D2(298.4mg ·kg^-1)-1)-1)-1).滇池北部藻类生长较中部和南部旺盛,而藻类生长可大量吸收沉积物有机磷,即D2、 D10沉积物有机磷含量低于D18、 D32.

图 2

Fig. 2

图 2 滇池沉积物TP、 IP、 OP垂直分布 (RSD<5%,n=3) Fig. 2 Vertical distribution of TP,IP and OP in the sediments of Dianchi Lake (RSD<5%,n=3)

(1) 弱吸附态磷(H₂O-P和NaHCO₃-P) 滇池沉积物H₂O-P_t、 H₂O-P_i、 H₂O-P_o含量分别在2.1~15.3、 0.1~1.9、 1.9~14.6mg ·kg^-1(平均6.0、 0.6、 5.4 mg ·kg^-1,图 3),其中H₂O-P_o占H₂O-P_t的72.6%~97.1%(平均89.6%).NaHCO₃-P活性稍低于H₂O-P,可在一定程度上指示藻类可利用磷含量^[4],NaHCO₃-P_t、 NaHCO₃-P_i、 NaHCO₃-P_o在滇池沉积物中含量分别为17.8~148.5、 14.8~85.7、 3.0~94.4 mg ·kg^-1(平均59.6、 38、 21.6mg ·kg^-1),其中NaHCO₃-P_o占NaHCO₃-P_t的14.7%~63.5%(平均34%).弱吸附态有机磷垂向含量基本随深度增加而递减,即H₂O-P_o: 表层(8.4mg ·kg^-1)>中层(4.6mg ·kg^-1)>底层>(3.3mg ·kg^-1),NaHCO₃-P_o: 表层(32.0mg ·kg^-1)>中层(20.6mg ·kg^-1)>底层>(12.1mg ·kg^-1).

图 3

Fig. 3

图 3 滇池沉积物不同形态磷含量垂直分布 (RSD<5%,n=3) Fig. 3 Vertical distribution of different P forms in the sediments of Dianchi Lake (RSD<5%,n=3)

(2) 铁、 铝结合态磷(NaOH-P) NaOH-P是滇池沉积物主要磷形态之一,NaOH-P_t、 NaOH-P_i、 NaOH-P_o含量分别在87.1~621.7、 61.8~549.6、 25.3~199.0mg ·kg^-1 (平均346.0、 261.3、 84.7mg ·kg^-1),其中NaOH-P_o占NaOH-P_t的10.2%~45.0%(平均25.7%),其含量随深度增加而减少,表层(131.3mg ·kg^-1)>中层(74.4mg ·kg^-1)>底层>(48.5mg ·kg^-1). (3) 钙结合态磷(HCl-P) HCl-P在沉积物早期成岩(内生作用)过程中产生^[2,21],是一种稳定性较高的非生物可利用磷(包括生物残骸、 羟基磷灰石、 过磷酸钙等)^[22].HCl-P是滇池沉积物可提取磷的主要组成部分,其HCl-P_t含量为189.9~1132.6 mg ·kg^-1 (平均621.1mg ·kg^-1),其中HCl-P_i、 HCl-P_o含量分别在189.9~1132.6、 0.0~47.2mg ·kg^-1 (平均617.0、 4.1mg ·kg^-1),HCl-P_o仅占HCl-P_t的0.0%~8.2%(平均0.6%).

(4) 残渣态磷(Residual-P) Residual-P可永久地与矿物结合,是一种非生物有效磷^[23],其在滇池沉积物中含量为197.8~947.7mg ·kg^-1(平均608.2mg ·kg^-1),占TP的26.4%~54.5%(平均38.1%).滇池沉积物连续提取获得的无机磷(H₂O-P_i、 NaHCO₃-P_i、 NaOH-P_i和HCl-P_i)回收率为72.4%~101.6%(平均86.0%),而有机磷(H₂O-P_o、 NaHCO₃-P_o、 NaOH-P_o和HCl-P_o)回收率为11.2%~50.7%(平均26.7%),所以滇池沉积物Residual-P中绝大部分可能为稳定性较高的非生物可利用有机磷.而且,残渣磷与有机质呈极显著负相关(r=-0.608,P=0.002,n=24),说明其很可能来自沉积物有机质的分解.

综上分析,滇池沉积物可提取磷以无机磷为主(H₂O-P除外),可提取有机磷含量依次为NaOH-P_o(84.7 mg ·kg^-1)>NaHCO₃-P_o(21.6 mg ·kg^-1)>H₂O-P_o(5.4 mg ·kg^-1)>HCl-P_o(4.1mg ·kg^-1). NaOH-P_o是可提取有机磷的主要组成部分,与Zhu等^[7]研究结果相同.H₂O-P_o、 NaHCO₃-P_o和NaOH-P_o是沉积物潜在可释放形态磷,在水-沉积物界面迁移能力较强^{[24, 25]},其含量垂直分布均随深度增加而减小,即表层>中层>底层,表层H₂O-P_o、 NaHCO₃-P_o与NaOH-P_o含量之和(171.5mg ·kg^-1)显著高于中层(99.6mg ·kg^-1)和底层(63.9mg ·kg^-1).可见,H₂O-P_o、 NaHCO₃-P_o和NaOH-P_o在滇池表层沉积物中富集程度较高,说明相比中层和底层沉积物有机磷而言,滇池表层沉积物有机磷具有较高的释放风险,其更容易被生物利用. 2.2 滇池沉积物不同形态有机磷酶解特征

滇池沉积物H₂O-P_o酶可水解磷(EHP)含量在0.11~5.93mg ·kg^-1 (平均1.32mg ·kg^-1,图 4),占H₂O-P_o的5.5%~41.7%(平均18.6%,图 5),其中活性单酯磷、 二酯磷、 类植酸磷含量分别为0.00~1.83、 0.00~2.54、 0.00~4.28mg ·kg^-1(平均0.31、 0.25、 0.76mg ·kg^-1),分别占H₂O-P_o的0.0%~27.6%、 0.0%~17.4%、 0.0%~39.4%(平均5.3%、 4.4%、 8.9%,图 6).

图 4

Fig. 4

图 4 滇池沉积物不同形态有机磷酶解特征 Fig. 4 Enzymatic hydrolysis characteristics of different forms of organic phosphorus in sediments of Dianchi Lake

滇池沉积物NaHCO₃-P_o酶可水解磷(EHP)在滇池沉积物含量为0.00~45.32mg ·kg^-1(平均10.74 mg ·kg^-1),占NaHCO₃-P_o的0.0%~110.0%(平均35.3%),其中活性单酯磷、 二酯磷、 类植酸磷含量分别为0.00~27.07、 0.00~24.88、 0.00~21.72mg ·kg^-1(平均4.89、 3.93、 1.92mg ·kg^-1),分别占NaHCO₃-P_o的0.0%~76.2%、 0.0%~54.6%、 0.0%~35.9%(平均17.0%、 11.7%、 6.6%).

NaOH-P_o酶可水解磷(EHP)是滇池沉积物酶可水解有机磷的主要组成部分,其含量在0.00~107.11mg ·kg^-1 (平均37.29mg ·kg^-1),占NaOH-P_o的0.0%~123.8%(平均37.9%),其中活性单酯磷、 二酯磷、 类植酸磷含量分别为0.00~107.11、 0.00~21.83、 0.00~33.59mg ·kg^-1 (平均32.75、 3.07、 1.47mg ·kg^-1),分别占NaOH-P_o的0.0%~123.8%、 0.0%~48.6%、 0.0%~46.6%(平均31.0%、 4.9%、 2.0%).

滇池沉积物不同形态有机磷EHP含量大小为NaOH-P_o>NaHCO₃-P_o>H₂O-P_o,与Zhu等^[7]研究结果相似,且各形态有机磷EHP含量总体随深度增加而减小(图 4),即表层>中层>底层,而且表层沉积物EHP含量显著高于中层和底层,表明滇池表层沉积物生物可利用有机磷含量较高.不同深度沉积物EHP各组分特征相同,即活性单酯磷>二酯磷>类植酸磷.因此,活性单酯磷是滇池沉积物有机磷EHP的主要组成部分,其次为二酯磷和类植酸磷,与Ding等^[8]用³¹P-NMR表征滇池沉积物有机磷的结果相似.

滇池沉积物存在大量不能被实验所使用的磷酸酶水解的有机磷(图 5),这部分未知有机磷主要包括膦酸盐、 磷脂、 与腐殖质结合的高分子化合物等^[13,17],表征其生物有效性可能需要其它种类的磷酸酶以及更适合的酶水解方法.另外,由于滇池沉积物HCl-P_o较稳定,且含量极低,所以未对HCl-P_o进行酶水解特性研究.

图 5

Fig. 5

图 5 滇池沉积物不同形态有机磷酶水解比例 Fig. 5 Enzymatic hydrolysis ratio of different forms of organic phosphorus in sediments of Dianchi Lake

图 6

Fig. 6

图 6 滇池沉积物不同形态有机磷组分特征 Fig. 6 Composition characteristics of different forms of organic phosphorus in sediments of Dianchi Lake F1=Labile monoester P； F2=Diester P； F3=Phytate-like P； F4=unknown Po

湖泊上覆水和沉积物中存在多种磷酸酶,包括碱性磷酸酶、 磷酸二酯酶、 植酸酶等^[26,27].本研究以酶水解技术表征滇池沉积物有机磷组分,表明活性单酯磷、 二酯磷和类植酸磷均存在于滇池沉积物不同形态有机磷中,与文献[7~8]研究结果一致.沉积物该部分有机磷(EHP)为潜在生物有效磷,经磷酸酶水解后可被生物利用.然而,滇池沉积物EHP含量垂直分布特征表明,其有机磷生物有效性随深度增加而减小,即表层>中层>底层.这可能与滇池演变过程有机磷累积有关.研究表明,湖泊沉积物生物可利用有机磷与其有机质累积关系密切^[4].滇池沉积物EHP与有机质显著正相关(r=0.439,P=0.032,n=24),表明有机质可能是滇池沉积物EHP的重要来源.滇池演变早期水体生产力较低,有机质积累量较小(有机质主要来源于湖体浮游生物残体等内源物质)^[7],从而使沉积物EHP含量较低.同时,部分EHP在长期湖泊演化过程中被水解利用,因而EHP在滇池早期沉积物(底层)中含量较低.近期，滇池进入富营养化,藻类等生产力较高,有机质大量积累,造成EHP在近期沉积物(表层)中积累较多.

如图 7所示,滇池表层沉积物EHP富集明显(表层磷极易释放至上覆水),空间上整体呈现由北向南递增的趋势,这可能是维持甚至加剧滇池北部(尤其是草海)富营养化的原因之一.滇池北部藻类生物量较高,特别是在藻类水华暴发期间,可吸收利用表层沉积物的EHP,从而造成北部沉积物表层EHP含量较低.同时,北部和中部表层沉积物释放EHP于上覆水中,而释放的EHP由于水流和风浪扰动(滇池常年盛行西南风)又源源不断地流向北部,及时补充北部上覆水生物可利用磷.滇池中层和底层沉积物EHP含量空间分布特征不明显,但其较稳定,释放潜力较小,且含量均低于表层,中层和底层沉积物EHP对滇池北部富营养化的影响有限.

图 7

Fig. 7

图 7 滇池沉积物不同形态有机磷EHP空间分布 Fig. 7 Spatial distribution of EHP in different forms of organic phosphorus in sediments of Dianchi Lake

不同深度沉积物有机磷对滇池富营养化有一定影响.一方面,随着滇池富营养化的发生,早期沉积物有机磷生物可利用部分(EHP)逐渐被藻类等生物所消耗,而随着沉积物有机质在富营养化过程中的不断累积,造成了近期沉积物EHP在表层富集,增强了表层沉积物有机磷的生物有效性.另一方面,当滇池上覆水正磷酸盐不足,其表层沉积物富集的EHP经酶水解可被释放进入上覆水,从而继续维持滇池上覆水较高的磷浓度. 3.2 沉积物有机磷生物地球化学循环及其对滇池水质保护的意义

磷酸酶水解作用是湖泊沉积物磷生物地球化学循环过程的重要“参与者”和推动力^[26~28].在富营养化湖泊中,有机质增多会引起磷酸酶活性升高^[29].当滇池“水华”暴发时,浮游生物死亡后其残体可在沉积物中大量积累,沉积物有机质也随之增加,磷酸酶活性升高促进沉积物EHP水解.同时,不断累积的有机质又可促进沉积物EHP增多^[4].沉积物EHP的再循环(经酶水解释放正磷酸盐)可以维持甚至加剧湖泊富营养化.因此,滇池富营养化与其沉积物EHP含量及其转化有关.而且,滇池流域属于富磷区^[30,31],流域内土壤磷本底值较高(尤其是滇池南部).土壤中大量磷随陆地径流汇入滇池,滇池磷污染控制形势较严峻^[32].沉积物EHP的生物地球化学循环可进一步加剧滇池富营养化,这可能是治理滇池富营养化难度较大的原因之一.

以往研究认为,湖泊沉积物生物可利用磷主要来自无机磷,而有机磷较稳定并埋藏于沉积物中,对湖泊内源生物有效磷负荷贡献较小^[33],造成沉积物生物有效磷量常常被低估.然而,滇池沉积物EHP(H₂O-P_o、 NaHCO₃-P_o与NaOH-P_o可酶解磷之和)含量为0.2~157.7mg ·kg^-1 (平均49.3mg ·kg^-1),占TP、 OP的比例分别为0.03%~9.36%、 0.09%~38.50%,与Zhu等^[7]研究结果相似,其中，50%以上的沉积物EHP含量超过20.0mg ·kg^-1,30%以上的沉积物EHP含量超过70.0mg ·kg^-1,只有不到10%的沉积物EHP含量低于10.0mg ·kg^-1.瑞士富营养化湖泊Leman 沉积物EHP含量为14.50~29.30mg ·kg^-1(平均19.40mg ·kg^-1)^[34],澳大利亚墨尔本亚拉河、 拉特罗布河沉积物EHP含量分别为2.01 mg ·kg^-1、 2.69 mg ·kg^-1[35].可见,滇池沉积物生物可利用有机磷含量较高.虽然,滇池沉积物生物有效性无机磷(H₂O-P_i、 NaHCO₃-P_i与NaOH-P_i之和)含量为76.8~581.9 mg ·kg^-1(平均299.8mg ·kg^-1),远高于沉积物生物可利用有机磷(EHP).但是,滇池沉积物EHP是迁移性较强的活性磷,特别是弱吸附态可酶解有机磷H₂O-P_o与NaHCO₃-P_o(上覆水极易获取的生物有效磷).而且,滇池沉积物EHP以活性单酯磷为主,而活性单酯磷是最易被生物利用的有机磷形态(相比二酯磷和类植酸磷)^[14].当浮游生物大量繁殖并消耗沉积物生物有效性无机磷后,沉积物EHP,尤其是活性单酯磷,可成为湖泊生物有效磷的重要补充(EHP经酶水解转化为正磷酸盐).在一定条件下,特别是在湖泊浮游生物生长磷需求量较大时,如藻华暴发期间,沉积物EHP对湖泊生物有效磷的贡献不容忽视.因此,在外部磷输入得到有效控制的情况下,沉积物EHP生物地球化学循环对滇池水质保护具有重要影响. 4 结论

(1)滇池沉积物有机磷具有表层富集特征,各形态有机磷含量大小为NaOH-P_o>NaHCO₃-P_o>H₂O-P_o>HCl-P_o,各形态有机磷EHP含量大小为NaOH-P_o>NaHCO₃-P_o>H₂O-P_o.滇池表层沉积物有机磷释放风险及生物可利用量较高.

(2)滇池沉积物EHP以活性单酯磷为主,其次为二酯磷和类植酸磷.受湖泊演变影响,不同深度沉积物有机磷对滇池富营养化均有一定影响,且其生物有效性大小为表层>中层>底层.

(3) EHP是滇池沉积物生物有效性磷的重要来源之一.当外源入湖磷负荷逐步被控制,沉积物EHP生物地球化学循环对滇池水质保护具有重要影响.