2014, Vol. 35
2. 中国科学院城市环境研究所, 厦门 361021
2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China
电化学活性微生物是能够将代谢产生电子传递到细胞外或从细胞外捕获电子进行代谢的一类具有胞外电子传递功能的微生物[1]. 其胞外电子传递在金属的生物地球化学循环，以及生物能源合成过程中具有重要作用[2]. 以微生物燃料电池为基础的生物电化学系统能够富集电化学活性微生物，从而加速石油烃、 多环芳烃等的氧化降解[3]，重金属、 高氯酸盐等的还原修复[4]，CH4、 H2等能源物质的合成. 因此，对生物电化学系统中电化学活性微生物的系统研究，将会极大促进深入理解金属、 碳、 氮、 硫等元素的生物地球化学循环，并加速高效环境生物技术的应用. 微生物群落结构和多样性分析，可以揭示群落结构与功能的联系； 而基于纯种功能微生物的研究，能够深入阐明功能实现的机制[5].
在微生物燃料电池中，通常认为阳极需要维持厌氧条件，以促进电能的收集. Rosenbaum等[6]用恒电位三电极体系研究氧气对Shewanella oneidensis产电的影响，发现少量氧气能够使电流响应增大，增加单位时间电能的收集量. Fan等[7]和Ringeisen等[8]也发现在混合菌群构建的微生物燃料电池阳极通入微量的氧气，能够提升电池功率密度. 此外，TerAvest等[9]发现与厌氧条件相比，在微氧条件下S. oneidensis MR-1可以加速分泌核黄素，从而促进电能的高效收集. Quan等[10]比较了微生物燃料电池有氧与厌氧阳极中的微生物群落结构，发现两种条件下，群落结构有77%的相似度，还存在很多差异群落. 此外，在已报道分离自生物电化学系统的电化学活性微生物中，绝大部分都是采用厌氧分离技术分离获得[1, 11]. 基于以上研究结果，本实验中采用传统的好氧分离技术而不是被广泛应用的厌氧分离技术，从微生物燃料电池的微氧阳极分离电化学活性细菌. 尝试在纯菌水平上探讨微氧阳极中功能微生物与已报道的厌氧阳极中功能微生物的差异，从而进一步阐明微氧阳极提高微生物燃料电池电能捕集的微生物机制. 1 材料与方法 1.1 培养分离
在本实验中建了一个双室微生物燃料电池，微生物燃料电池阳极和阴极室均为5 cm×5 cm×5 cm的立方体，阳极和阴极室均有两块4 cm×4 cm×0.4 cm的碳毡通过钛丝叠加串联，浸于电解液中作为电极. 微生物燃料电池阳极以集美污水处理厂二沉池污泥作为接种污泥. 驯化过程中，10 mmol ·L-1乙酸钠作为阳极电子供体，50 mmol ·L-1铁氰化钾作为阴极电子受体，阳极维持微氧状态，置于32℃培养箱中培养. 微氧环境中溶解氧一般小于1 mg ·L-1[12]. 阳极微氧环境的实现通过在阳极室开一个Φ 1 cm的孔，同时在池底加一个长1.2 cm的转子，置于磁力搅拌器上以100 r ·min-1的低转速进行搅拌来实现. 阳极室溶解氧用溶解氧微电极(REF 321，Unisense，丹麦)进行测定，得到阳极室溶解氧为0.8~1.1 mg ·L-1，即为本研究中微生物燃料电池微氧阳极的维持微氧状态.
待微生物燃料电池运行稳定后，从阳极碳毡刮下生物膜，放入50 mmol ·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate belanced solution,PBS,pH=7.0)中，经漩涡振荡混匀，作为纯菌分离源. 分离所用培养基为Luria-Bertani培养基(LB)：酵母提取物5 g ·L-1，蛋白胨10 g ·L-1，氯化钠5 g ·L-1. 培养基pH=7.0，当配制固体培养基时，加入20 g ·L-1琼脂条. 实验中通过梯度稀释法，进行平板划线初步获得单菌落，然后接入液体LB培养基增殖. 为了确保获得纯菌，固体平板划线和液体增殖的过程依次重复3次. 1.2 菌株鉴定
菌株全基因组的提取参考Yang等[13]的方法. 提取的全基因组样品使用引物对27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和 1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)对 16S rRNA基因片段进行PCR扩增. PCR反应程序参考Xiao等[14]的方法. PCR扩增的DNA片段使用试剂盒进行纯化(DP1401，BioTeke，中国)，纯化产物使用pGM-T连接试剂盒(TianGen，中国) 和Escherichia coli Top10 (Sangon，中国)进行克隆. 克隆DNA片段使用引物对T7f和SP6r进行PCR扩增检验. 阳性克隆样品送上海美吉进行DNA测序. 测序结果提交GenBank并获得登录号. 使用GenBank的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对测序结果进行同源性比较，获得与测定序列相似性最高的已知序列数据. 使用软件DNAStar v5.0(DNASTAR，USA)的MegAlign程序对同源性比对获得的序列数据建立系统发育树. 1.3 菌体形态观察
扫描电镜菌体样品的前处理方法为： LB培养基中培养至稳定期菌体的收集与PBS清洗； 2.5%戊二醛室温固定4h或置于4℃冰箱过夜； 30%、 50%、 70%、 90%、 100%乙醇进行梯度脱水； 乙醇脱水后样品用滤纸包好，置于超临界干燥器(Samdri-PVT-3D，Gatan，美国)中干燥6 h. 处理好的菌体样品固定于导电胶上，经喷金处理后，通过扫描电镜(S-4800，Hitachi，日本)进行菌体形态观察，并采集菌体形态图片. 1.4 循环伏安
循环伏安实验使用三电极体系，通过电化学工作站进行(CHI 660D，上海辰华). 三电极体系中玻碳(Φ 3 mm)、 铂丝和Ag/AgCl(饱和KCl溶液)分别作为工作电极、 对电极和参比电极. 本文所有的电势值都是相对于饱和Ag/AgCl参比电极. Masuda等[15]发现LB培养基中的酵母提取物中含有核黄素，并且此物质能够作为电子中介体在微生物与电极间进行电子传递. 因此本文后续实验中的微生物培养都使用LB(Y-)培养基：蛋白胨10g ·L-1，氯化钠5 g ·L-1.
在循环伏安测试过程中，首先对电解液进行通氮气处理15 min以上，以去除电解液中的氧气. 生长至稳定期的菌体经离心收集后，用PBS清洗3次，以清除菌体表面附着的胞外物质. 清洗后的菌体立即用Nafion(Sigma，美国)固定于玻碳电极，进行循环伏安测试，用于初步研究菌体是否存在直接胞外电子传递能力. 此外，菌体培养液的上清液也进行循环伏安扫描，以确定菌体是否具有分泌氧化还原电子中介体进行间接胞外电子传递的能力. 循环伏安测试中，电势扫描范围为-0.5~0.3 V，扫描速率为10 mV ·s-1，电解液持续通氮气，以保持无氧状态. 1.5 计时电流
计时电流实验使用三电极体系，通过电化学工作站进行(CHI 1000B，上海辰华). 三电极体系中碳毡(3 cm×3 cm)、 碳毡(1 cm×3 cm)和饱和Ag/AgCl分别作为工作电极、 对电极和参比电极. 实验中，三电极反应体系在100 mL蓝盖瓶中进行，通过橡胶塞进行密封，隔绝氧气，同时防止外来微生物的污染. 测试过程中，蓝盖瓶中加入90 mL LB(Y-)培养基，实验组接种2~5 mL稳定期菌液，对照组不接种菌体.
2 结果与讨论 2.1 纯菌的分离与鉴定
采用传统的好氧平板分离技术，结合梯度稀释法，笔者从微生物燃料电池微氧阳极分离获得3株纯菌. 图 1为根据3株纯菌的16S rRNA基因序列构建的系统进化树. 在细菌分类鉴定中，Embley等[16]认为当16S rRNA基因序列的同源性大于97%时，可认为是一个种； Godfellow等[17]认为DNA的G+C mol%差异低于12%以及16S rRNA基因序列同源性不低于95%的种可归属为一个属. 图 1中WS-XY2的16S rRNA基因与Aeromonas属中Aeromonos hydrophila BJ、 Aeromonos punctata W20060720和Aeromonos aquariorum N2这3个种的16S rRNA基因具有99%的相似度，命名为Aeromonas sp. WS-XY2. WS-XY3的16S rRNA基因与Citrobacter属中Citrobacter freundii JZ01、 Citrobacter murliniae FFL15和Citrobacter braakii RCPS-4这3个种的16S rRNA基因具有100%的相似度，命名为Citrobacter sp. WS-XY3. 图 1中WS-XY4，其16S rRNA基因序列在NCBI中的比对结果显示，与其序列相似度大于95%的序列均是未培养细菌； 而与其序列相似度为95%的序列，却是来自于不同种属的几株菌(Enterobacter sp. strain PP9C、 Endophytic bacterium strain GYPB16、 Leclercia adecarboxylata strain C107、 Pantoae agglomerans strain ABAC23和Averyella dalhousiensisi strain Z173). 因此，基于WS-XY4的16S rRNA基因序列的比对结果，笔者初步推断WS-XY4为新种，需要后续的生理生化实验来进一步在分类学上对其进行鉴定，初步命名为Bacterium strain WS-XY4.
 | 图 1 基于3株纯菌的16S rRNA基因序列构建的系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of the 3 pure bacteria
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图 2为3株选定菌株的扫描电镜图片，结果显示3株菌都为杆状，且均约2 μm长. WS-XY2和WS-XY3的以上形态特性都与伯杰氏手册中描述的对应种属细菌的形态特征一致，从而进一步证实了16S rRNA基因鉴定的结果. 变形菌门在BES中是优势功能微生物[18]，很多通过厌氧分离技术从微生物燃料电池厌氧阳极分离的电化学活性微生物都属于变形菌门[1]. 并且关于电化学活性微生物胞外电子传递机制的研究，也主要是集中在变形菌门的Geobacter spp. 和Shewanella spp.中进行. 本实验利用好氧分离技术从微生物燃料电池微氧阳极分离获得的Aeromonas sp. WS-XY2、 Citrobacter sp. WS-XY3和Bacterium strain WS-XY4中，WS-XY2和WS-XY3均属于变形菌门，但是WS-XY4在系统进化关系上与WS-XY2和WS-XY3差异较大. 因此进一步的纯菌电化学活性分析，将有助于揭示微生物燃料电池微氧阳极中的功能微生物.
 | 图 2 Aeromonas sp. WS-XY2、 Citrobacter sp. WS-XY3、 Bacterium strain WS-XY4的扫描电镜图片
Fig. 2 Scanning electron microscope image of Aeromonas sp. WS-XY2,Citrobacter sp. WS-XY3,Bacterium strain WS-XY4
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为了能够判断已知菌株的电化学活性，通常需要循环伏安、 计时电流以及构建纯菌燃料电池等方法进行实验. 此外Yuan等[19]制备了电致变色材料WO3纳米簇，该材料可以用于快速鉴定产电菌，但此种方法因不能具体确定电化学活性微生物的氧化还原峰电位，仅适用于初步筛选电化学活性微生物. 循环伏安曲线能够清晰地呈现出菌体及其培养液上清的氧化还原状况. 通过菌体和培养液上清的循环伏安曲线，可以推断菌体表面或溶液中是否存在氧化还原活性物质，但是关于氧化还原活性物质是否参与菌体代谢过程的电子传递，还需要进一步实验进行验证. 在已有的关于纯菌电化学活性鉴定的文献报道中，通常通过构建微生物燃料电池来测试其产电性能[11]. 然而微生物燃料电池的启动，通常需要数十天才形成稳定的产电生物膜[20]. 同时基于纯菌的燃料电池在长期运行中，大大增加了其被外来细菌污染的风险. Wang等[21]发现控制阳极电位能加速微生物燃料电池的启动，因此本研究中通过构建密闭的恒电位三电极体系进行纯菌电化学活性的进一步验证，缩短实验周期以避免外来细菌的污染. 2.2.1 循环伏安分析
本研究首先采用循环伏安，对分离的纯菌进行初步电化学活性分析. 图 3(a)~3(c)中实验结果表明，3株分离纯菌的菌体表面都存在氧化还原活性物质，能与电极间进行直接胞外电子传递. 它们都在0.1 V左右有一个氧化峰，在-0.2 V左右有一个还原峰. 在已知模式菌S. oneidensis的循环伏安图中，也在以上电势范围内出现氧化还原峰电流[22]. 并且基于S. oneidensis基因和蛋白水平的研究表明，其对应峰电位发生的直接胞外电子传递是由菌体表面蛋白细胞色素c引起[23]. 因此，本研究初步推断图 3(a)~3(c)中出现在0.1 V和-0.2 V左右的峰电流响应可能是由位于菌体表面的细胞色素c引起.
 | 图 3 Aeromonas sp. WS-XY2、 Citrobacter sp. WS-XY3、 Bacterium strain WS-XY4菌体及培养液上清的循环伏安图
Fig. 3 Cyclic voltammetry of Aeromonas sp. WS-XY2,Citrobacter sp. WS-XY3,Bacterium strain WS-XY4 cell and their culture medium supernatant (cell-free)
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此外，WS-XY3和WS-XY4两株菌的循环伏安图中，在-0.4 V左右均存在一对氧化还原峰. Marsili等[24]发现S. oneidensis可以分泌核黄素与电极间进行间接胞外电子传递，而且核黄素的氧化还原电位在-0.4 V左右. 核黄素是生物生长代谢所必需的元素，它可以被大多数微生物合成[25]，并且核黄素很容易吸附在细胞或电极表面而不易被清洗，因此笔者推断WS-XY3和WS-XY4两株菌的循环伏安图中-0.4 V左右的氧化还原峰可能是由吸附于菌体上的核黄素引起.
图 3(a)~3(c)菌体的电化学活性分析初步表明3株菌的菌体表面都存在氧化还原活性物质，但并不能证明菌株是否具有间接胞外电子传递作用. 图 3(d)中空白培养基和3株菌培养液上清的循环伏安图均未出现氧化还原峰电流响应，表明3株菌都不能分泌具有电化学活性的电子中介体，或者分泌的电子中介体浓度太低，以致于不能通过循环伏安检测到. 2.2.2 计时电流分析
通过图 3的循环伏安曲线，可以推断菌体表面存在氧化还原活性物质，为了进一步验证菌体表面氧化还原活性物质是否参与菌体代谢过程的电子传递，笔者进行计时电流分析. 图 4为3株菌的计时电流结果，电流响应曲线表明3株菌都能够将代谢过程中产生的电子传递到细胞外，即3株菌都具有电化学活性. 当在工作电极分别施加0.05 V和0.2 V电位时，随着菌体的代谢，3株菌在两个电位下均出现电流增大的响应. 当设定工作电极电位为0.05 V时，电流的峰值响应是由于-0.4 V处氧化反应的发生引起； 当设定工作电极电位为0.2 V时，电流的峰值响应是由于-0.4 V和0.1 V左右氧化反应的发生引起. 对于WS-XY3和WS-XY4两株菌，结果表明菌体循环伏安图中位于0.1 V和-0.4 V左右的氧化峰均参与菌体的代谢电子传递，这与S. putrefaciens在不同阳极电位下的电流响应相一致[26]. 然而对于WS-XY2，其循环伏安曲线中只在0.1 V左右有一个氧化峰出现，但是当工作电极电位设定为低于0.1 V 的0.05 V时，随着菌体的代谢与增殖，电流也出现峰值响应. Geobacter sulfurreducens在低于其氧化峰电位的阳极电位下也呈现出了与WS-XY2相一致的电流响应[27]. 因此可能是由于菌体能够根据工作电极电位自动调整菌体表面氧化还原活性蛋白氧化态和还原态的比例，来改变菌体表面最终电子供体的电位，使其低于电极电位，从而促进代谢产生电子由菌体传递到电极表面[28]. 最近Okamoto等[29]研究发现Geobacter sulfurreducens细胞表面的细胞色素c能够通过与菌体分泌的核黄素结合，从而降低其氧化还原电位，也进一步证实了菌体自身能够调整表面蛋白氧化还原电位. 综上所述，对于生物电化学体系中的研究结果，如果要用经典的电化学理论进行解释，需要同时根据电化学和生物学数据进行综合考量.
 | 图 4 Aeromonas sp. WS-XY2、 Citrobacter sp. WS-XY3、 Bacterium strain WS-XY4的计时电流
Fig. 4 Chronoamperometry of Aeromonas sp. WS-XY2,Citrobacter sp. WS-XY3,Bacterium strain WS-XY4
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3株菌出现相似的计时电流响应，并且都在0.1 V和-0.2 V左右出现峰电流，这可能是微氧阳极的定向选择，使具有相似电化学性质的微生物富集在阳极，作为功能微生物. WS-XY2和WS-XY3同属于变形菌门，且对应种属中有电化学活性细菌Aeromonas hydrophila[30]和Citrobacter sp. SX-1[31]从微生物燃料电池厌氧阳极分离获得，表明厌氧阳极与微氧阳极有相似的功能微生物. 但是本研究中还分离出初步鉴定为新种的WS-XY4，表明厌氧阳极与微氧阳极功能微生物也存在差异. 以上结论与Quan等[10]在群落水平上得出的厌氧阳极与微氧阳在群落结构存在77%相似相耦合. WS-XY4由于在分类学鉴定上没有与之高度相似的种属，笔者正在尝试通过系统的生理生化鉴定来确定其种属，以便进一步围绕WS-XY4进行深入研究，从而从微生物角度深入理解微氧阳极优于厌氧阳极的机制.
3 结论
(1)本研究采用好氧分离技术从微生物燃料电池微氧阳极分离获得3株纯菌，其中WS-XY2和WS-XY3均属于变形菌门，WS-XY4初步鉴定为新种.
(2)基于循环伏安和计时电流的电化学活性分析表明3株菌都具有电化学活性，且都只有直接胞外电子传递能力. 3株菌在微生物分类学上和电化学性质上的异同，也表明微氧阳极能够定向筛选具有相似电化学性质的电化学活性微生物.
(3)微生物燃料电池微氧阳极具有更高效多样的功能微生物，可能是微氧阳极性能优于厌氧阳极的一个原因. 因此，进一步针对微生物燃料电池微氧阳极中功能微生物的研究，可以更全面地理解生物电化学系统，从而能够深入理解金属、 碳等元素的生物地球化学循环和加速高效环境生物技术的应用.
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