近年来高氨氮废水(氨氮浓度>200mg ·L^-1)日益增多，若处理不当排入水体，会导致富营养化等现象日趋严重，造成水体质量恶化. 氮素在废水中以分子态氮、 有机氮、 氨氮、 硝态氮以及亚硝态氮等多种形式存在，而氨氮是最主要的存在形式. 《国家环境保护“十二五”规划》在继续降低COD排放量的基础上，将氨氮加入约束性指标进行总量控制. 如何经济有效去除废水中的氮素已经成为高氨氮废水处理中亟需解决的问题之一. 目前，国内外对高氨氮废水的处理方法有物理化学脱氮法和生物脱氮法^{[1, 2, 3]}. 污水生物脱氮法与物理化学法相比较，以它经济、 高效以及无二次污染等不可比拟的优点已被人们所广泛认可，成为水处理领域研究的主要内容之一. 传统脱氮理论认为废水中的氮素需要经过微生物一系列的硝化作用与反硝化作用来实现的^[4]，由于硝化菌和反硝化菌对环境条件的要求不同，使实际污水生物脱氮工艺复杂^[5]. 近年来有学者研究发现某些细菌还可同时具备异养硝化和好氧反硝化的能力^[6]. 这一新发现突破了传统认识，揭示了异养硝化-好氧反硝化菌在自然界氮素循环过程中的重大意义. 异养硝化-好氧反硝化菌可使硝化-反硝化反应在同一个反应器中进行，具有大大减少占地面积和建设资金、 高效去除废水中的氨氮、 降低成本等优点而受到人们关注. 一些异养硝化-好氧反硝化菌逐步被人们选育出来，并研究其脱氮性能^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]}. 对这种异养硝化-好氧反硝化现象展开深入研究，可以对自然界中的氮循环过程的认识上升到一个新的高度，并增强人类对生物脱氮过程的控制能力，为废水生物脱氮处理带来更广阔的应用前景. 然而目前人们对异养硝化-好氧反硝化菌的分离和应用研究工作大多数集中在对其异养硝化和好氧反硝化能力的研究，很少涉及该类菌种耐受高氨氮的性能研究. 而实际一些废水(如养猪废水)，其氨氮浓度非常高，处理该类废水的传统生物处理系统中，普通活性污泥往往由于低碳、 高氨氮的基质而受到抑制，最终导致处理效果不好. 本研究从自然环境中选育出1株新型不动杆菌Acinetobacter sp. TN-14，对其进行脱氮活性、 产絮特性以及耐受高氨氮能力的分析，并将该菌株接种到实际高氨氮养猪废水中，探讨其除污性能，将拓宽人们对特殊环境微生物的认识和应用，以期为高氨氮有机废水的生物强化技术提供良好的菌源，并提供可靠的实验基础和理论依据.

取少量富营养化较严重的校园水沟底泥接种于硝化富集培养基中，利用微孔曝气头进行间歇曝气，每天分两个周期进行，每个周期均以新鲜的硝化富集培养基更换其中的培养液. 富集驯化30 d后，取少量污泥接种于异养硝化培养基中培养，1~2 d后再转接于好氧反硝化培养基进行反硝化培养，1~2 d后取细菌悬液0.5~1 mL，用灭菌蒸馏水进行梯度稀释，取10 μL稀释倍数为10³~10⁸倍的细菌悬液分别在BTB分离培养基上进行平板涂布，培养2~5 d后，挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的菌落作为初筛菌； 在新鲜的BTB分离培养基上进行重复划线以获得纯的单菌株，通过考察菌株的异养硝化和好氧反硝化脱氮能力，最终得到TN-14菌株.

硝化富集培养基(g ·L^-1)：(NH₄)₂SO₄ 0.5，柠檬酸三钠 4.08，KH₂PO₄ 1.0，FeCl₂ ·6H₂O 0.5，CaCl₂ ·7H₂O 0.2，MgSO₄ ·7H₂O 1.0，pH 7.0~7.5. 异养硝化培养基(g ·L^-1)：(NH₄)₂SO₄ 0.25~0.5，琥珀酸钠 2.8~5.6，50 mL维氏盐溶液，pH 7.0~7.5. 其中：维氏盐溶液(μg ·L^-1)：K₂HPO₄ 5.0，FeSO₄ ·7H₂O 0.05，NaCl 2.5，MgSO₄ ·7H₂O 2.5，MnSO₄ ·4H₂O 0.05； 琼脂20(固).

反硝化培养基A(B)(g ·L^-1)：KNO₃ 0.72(NaNO₂ 0.5)，KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄ ·7H₂O 1.0，琥珀酸钠 2.8，pH 7.0.

溴百里酚蓝(BTB)初筛培养基(g ·L^-1)：KNO₃ 1.0，L-天冬酰胺 1.0，用酒精稀释0.1%的溴百里酚蓝(BTB) 5 mL，柠檬酸三钠8.5，KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄ ·7H₂O 1.0，CaCl₂ ·6H₂O 0.2，FeCl₂ ·6H₂O 0.05，琼脂 20，pH 7.0~7.5.

本实验中，养猪废水采用水泡粪方式的模拟废水. 污水主要污染指标平均浓度ρ(COD)为4 800 mg ·L^-1，ρ(氨氮)为600.20 mg ·L^-1，ρ(总氮)为680.40 mg ·L^-1，ρ(总磷)=30.30 mg ·L^-1，pH值在7.0左右.

根据菌株TN-14的形态、 革兰氏染色、 菌落等生理生化特征以及16S rDNA基因序列初步进行菌种鉴定. 采用扫描电镜观察菌体形态； 菌落特征是将菌株稀释涂布在异养硝化固体培养基上培养，待长出单个菌落后进行观察； 主要生理生化实验依据《常见细菌系统鉴定手册》进行； 16S rDNA基因序列采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取，以其为模板进行PCR扩增，扩增引物选用一对通用引物(引物由上海生工生物有限公司合成),上游引物为27f(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′),下游引物为1492r(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′). PCR反应体系为50 μL，加入1 μL模板DNA(0.1 μg)，1 μL P1和 P2 (终浓度为0.5 μmol ·L^-1)，1 μL dNTP (每种NTP 0.2 mmol ·L^-1)，12.5 μL 2×Taq PCR Mastermix和34.5 μL ddH₂O. PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，经30个循环后72℃延伸10 min，4℃终止扩增反应. 用1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测. 将TN-14的16S rDNA的扩增产物进行序列测序. 采用BLAST，将获得的16S rDNA片段序列.

挑取TN-14单菌落于100 mL富集培养基中过夜培养为种子培养液，取其种子培养液按照体积比2%的比例接种到异养硝化培养基内，30℃，190 r ·min^-1下培养2 d，间隔6 h检测培养液中菌体生长D₆₀₀、 氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮和总氮浓度变化.

将TN-14种子培养液按照体积比2%的比例接种到以NO^-₃-N和NO^-₂-N的反硝化培养基中，190 r ·min^-1下培养48 h，间隔6 h后检测培养液中菌体生长量D₆₀₀以及硝态氮、 亚硝态氮和总氮的浓度变化.

取TN-14种子培养液按照体积比2%的比例接种到发酵培养基^[15]，190 r ·min^-1下振摇培养，每隔6 h取其上清液按照体积比为(0.5~1) ∶100投加到4 g ·L^-1的高岭土悬浊液中，1% CaCl₂溶液做助凝剂，pH值为7.0，快速220 r ·min^-1，1 min； 慢速80 r ·min^-1，30 s进行搅拌，静置10 min后，吸取上清液以蒸馏水作空白于721型分光光度计在550 nm处测定其吸光度. 絮凝率计算公式为：

将菌株TN-14种子培养液按照体积比2%的比例接种到不同氨氮浓度的异养硝化培养基内，30℃，190 r ·min^-1下振摇培养60 h，定期监测培养液中菌体生长量D₆₀₀.

将菌株TN-14种子培养液按照体积比5%的比例接种到猪场废水中，30℃，190 r ·min^-1下培养2 d. 测定处理前后污水COD、 氨氮、 总氮以及总磷浓度变化.

水体中氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮、 总氮、 总磷指标均采用文献^[16]的标准方法测定.

通过富集分离，从环境中筛选出1株具有异养硝化、 好氧反硝化、 产絮且耐高氨氮的菌株TN-14. 个体成杆状，大小0.8 μm×1.2 μm(图 1)，菌落为黄白色，圆形，稍凸起，表面湿润、 光滑，不透明(见图 2). 主要生化特征见表 1. 将菌株TN-14的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较发现，细菌TN-14与不动杆菌属(Acinetobacter sp.)多个菌株的同源性高达98%以上. 综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，可确定细菌TN-14为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，查阅资料，尚缺乏不动杆菌属有关实际高氨氮废水脱氮除碳性能以及耐受高氨氮并产絮的具体报道. 不动杆菌Acinetobacter sp. TN-14为新菌株，已于2013年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，典藏号：CCTCC NO.M2013247. 本研究获得的菌株TN-14，具有较好耐高氨氮、 产絮、 脱氮性能，在实际高氨氮养猪废水中具有高效脱氮除碳磷的功能. 这就拓宽了人们对不动杆菌Acinetobacter sp. TN-14在其功能方面的应用研究思路，并为高氨氮废水高效生物脱氮提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值.

图 1

Fig. 1

图 1 TN-14菌株扫描电镜照片(×5 000)Fig. 1 Scanning electronic microscope photograph of strain TN-14

图 2

Fig. 2

图 2 TN-14菌株菌落Fig. 2 Bacterial colony of strain TN-14

表 1(Table 1)

表 1 菌株TN-14的主要生化特征1)Table 1 Biochemical characteristics of strain TN-14 实验项目 结果 实验项目 结果 硝酸盐还原 + 半乳糖产酸产气 +/+ 亚硝酸盐还原 + 葡萄糖产酸产气 +/+ 葡萄糖氧化利用 + 蔗糖产酸产气 +/+ 柠檬酸盐利用 + 乳糖产酸产气 +/- 阿拉伯糖产酸产气 -/- 果糖产酸产气 +/+ 1)“+”表示反应显示为阳性,“-”表示反应显示为阴性

表 1 菌株TN-14的主要生化特征1)Table 1 Biochemical characteristics of strain TN-14

异养硝化培养基体系中，菌株TN-14菌体生长D₆₀₀、 氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮和总氮浓度变化见图 3.

图 3

Fig. 3

图 3 异养硝化培养基中各指标的动态变化Fig. 3 Dynamic changes of each indicator in the heterotrophic nitrification medium

菌株TN-14在20 h之内，增长最快，之后基本长时间处于稳定期，随着菌体的增值过程，反应体系中氨氮和总氮的浓度从反应前的100 mg ·L^-1分别降至2.87mg ·L^-1和6.47 mg ·L^-1，24 h内，菌株对氨氮、 总氮的去除率分别达到97.13%和93.53%.一般自养硝化细菌好氧条件下，会把水体中的氨氮氧化为亚硝酸盐氮和硝酸盐，只具备硝化能力，并没有明显去除水体中的总氮，而本实验中，菌株TN-14在整个生长过程中，反应体系产生的硝酸盐和亚硝酸盐含量极少，最高积累量分别为2.42 mg ·L^-1和1.11 mg ·L^-1，表明该菌株TN-14具备高效的异养硝化能力和脱氮能力.

好氧反硝化培养体系中，菌株TN-14菌体生长D₆₀₀、 氨氮、 硝态氮、 亚硝态氮以及总氮浓度变化见图 4和5. 菌株在氮源为硝酸盐反硝化培养基中培养时(初始硝态氮浓度为94.24 mg ·L^-1)，36 h时菌体生长D₆₀₀达到最大，其生长速率低于氮源为硫酸铵的硝化培养基，而反应体系中硝态氮浓度在24 h内，降到39.32 mg ·L^-1，菌株对硝态氮的去除率达到58.28%，反硝化速率为2.28 mg ·(L ·h)^-1. 在进行反硝化过程中，基本无亚硝态氮积累，其含量极低，在0.98~1.22 mg ·L^-1变化. 在氮源为亚硝酸盐反硝化培养基中培养时(初始亚硝态氮浓度为97.78 mg ·L^-1)，30 h时菌体生长D₆₀₀达到最大，其生长速率低于氮源为硫酸铵的硝化培养基，但略高于氮源为硝酸盐的反硝化培养基. 并且，在整个培养时间内，反应体系中亚硝态氮随着菌体的增值而持续下降，从反应初始浓度97.78 mg ·L^-1下降到21.30 mg ·L^-1，去除率达78.22%，反硝化速率为2.55 mg ·(L ·h)^-1. 实验中还发现，30 h之内，伴随着生物的生长，反应体系中的硝态氮略有增加，30 h为14.26 mg ·L^-1，在菌株的稳定期时，其含量又下降，降到4.02 mg ·L^-1. 综上，菌株能将亚硝酸盐氮以及硝化过程产生的硝酸盐氮通过反硝化作用转化为气态产物，具有良好的好氧反硝化能力.

图 4

Fig. 4

图 4 硝酸盐反硝化培养基中各指标的动态变化Fig. 4 Dynamic changes of each indicator in the nitrate denitrification medium

图 5

Fig. 5

图 5 亚硝酸盐反硝化培养基中各指标的动态变化Fig. 5 Dynamic changes of each indicator in the nitrite denitrification medium

在研究TN-14的脱氮能力实验时，发现其生长的培养基菌悬液具有一定的絮凝效果. 对TN-14在不同的生长阶段的絮凝效果进行了测定，其结果见图 6. 从中可知，TN-14的絮凝效率随培养时间而增大，在18 h时趋于平衡，絮凝率为90.7%，此后絮凝效率稳定，在培养结束时达到了94.74%. 目前，关于异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮性能的报道很多，但是，对该类菌群产絮性能的研究鲜见报道. 于申等^[17]曾报道过关于1株好氧反硝化假单胞菌属Pseudomonas sp. Y1在脱氮的同时，具有良好的产絮特性. 蔡亚君等^[18]分离出1株多功能水处理菌CDN1，具有较强的反硝化活性，对硝态氮的降解率最高可达94.01%，但对高岭土的絮凝活性最高为79.82%. 本研究证明不动杆菌属Acinetobacter sp.TN-14具有相似的脱氮产絮功能，具有很好的工程应用前景.

图 6

Fig. 6

图 6 絮凝性能Fig. 6 Flocculating performances

菌株TN-14在不同氨氮浓度的硝化培养基中生长曲线及处理猪场废水的效果分别见图 7和图 8. 从图 7可见，当反应体系中氨氮浓度从250~1 200 mg ·L^-1时，菌株TN-14都能良好的生长，并且当氨氮浓度大于400 mg ·L^-1时，其生长D₆₀₀值更大，说明该菌株生长喜欢高氨氮的环境，具有很好的耐受高氨氮的能力. 而传统生物脱氮好氧工艺的硝化过程由两种不同的细菌即氨氧化细菌和亚硝酸氧化菌联合完成. 根据文献^[19]报道：氨氮在水中存在形式包括铵根离子和游离态氨氮，当pH=7时，常温下游离氨约占氨氮的1%，游离氨普遍对两种硝化菌产生抑制作用. 本实验菌株TN-14却能够在氨氮高达1 200 mg ·L^-1的环境下生长，根据游离氨的计算公式^[16]可知，游离态氨氮浓度已经超过对普通两种硝化菌的抑制浓度，表明菌株TN-14具有很好的耐受高氨氮的能力，是处理高氨氮有机废水的良好工程菌剂. 为了进一步推进菌株TN-14在实际高氨氮废水中的应用，将按照接种体积比为5%接种到猪场废水中，30℃，190 r ·min^-1下培养2 d，其废水COD、 氨氮、 总氮以及总磷浓度变化如图 8. 在菌株培养22 h之内，废水中COD、 氨氮、 总氮和总磷去除速率最快，废水COD、 氨氮、 总氮和总磷的浓度由初始的4 800、 600.20、 680.40和30.30 mg ·L^-1分别降到705.60、 205.77、 239.08和6.24 mg ·L^-1，菌株对废水COD、 氨氮、 总氮和总磷去除率分别达到 85.30%、 65.72%、 64.86%和79.41%.

图 7

Fig. 7

图 7 耐受高氨氮的能力Fig. 7 Tolerance to high ammonia nitrogen

图 8

Fig. 8

图 8 菌株TN-14对养猪废水的除污性能Fig. 8 Decontamination performances of strain TN-14 in treatment for swine wastewater

目前，人们对不动杆菌Acinetobacter sp．的异养硝化-好氧反硝化能力的研究并不多，且筛选出的异养硝化菌在异养硝化系统有的呈现较慢的生长速度、 脱氮效率不高或亚硝酸盐积累的情况. 如金敏等^[20]通过异养硝化培养基获得1株高效脱氮细菌Acinetobacter sp. YY-5，该菌株能在3 d内将氨氮由95.23 mg ·L^-1降解至1.29 mg ·L^-1，降解率达到98.6%，同时未发现亚硝酸盐氮和硝酸盐氮积累； 但是不能发生好氧反硝化. 辛玉峰等^[21]筛选的不动杆菌Acinetobacter sp.YF14，研究其在以琥珀酸钠为唯一碳源，以硫酸铵为氮源的异养硝化培养基中生长时，经过3 d的培养，氨氮和总氮浓度持续下降，3 d后降解率可达到92%和91%.刘芳芳等^[22]报道的Alcaligenes sp. L116 经 48 h氨氮和总氮降解率分别达61.29%和43.37%. 王弘宇等^[23]分离Alcaligenes faecali ZW5经60 h培养氨氮去除率达48.52%. 刘健楠等^[24]报道的异养硝化菌在硝化和反硝化过程中都有较高的硝酸盐和亚硝酸盐积累. 而菌株TN-14是1株生长速度快、 脱氮效率高的异养硝化-好氧反硝化菌，异养硝化体系内培养24 h，对反应体系氨氮、 总氮的去除率分别达到97.13%和93.53%，说明该菌株具有生长速度快，脱氮效率高等优点； 并且在硝态氮反硝化体系，菌株对硝态氮去除率分别达到58.28%； 亚硝态氮反应体系中，菌株对亚硝态氮去除率达78.22%，具有良好的好氧反硝化能力. 菌株Acinetobacter sp.TN-14除了具有高效同步硝化-反硝化能力，还具有良好的产絮特性. 对0.4%高岭土悬浊液的絮凝率可达94.74%，这就进一步扩展了人们对不动杆菌属在环境科学与工程领域中新的用途的认识.

目前筛出的许多异养硝化菌耐受氨氮浓度不够高^[25]. 为了进一步推进异养硝化-好氧反硝化菌剂在高浓度氨氮废水生物处理中的应用，一些学者开始注重耐高氨氮能力的异养硝化菌的选育. 如司文攻等^[26]用筛选出的配伍菌群(N4+N5+N6)处理氨氮为450 mg ·L^-1的合成废水，52 h 时氨氮浓度已由起始的446.90 mg ·L^-1 降至0.61 mg ·L^-1，总氮的去除比氨氮稍滞后，总体上随着氨氮的去除而减少，最终去除率为66.5%，表现出很好的耐受高氨氮能力及去除氨氮的性能.比较而言，前者是配伍菌群(N4+N5+N6)，废水中氨氮浓度最高只报道了450 mg ·L^-1，前10 h 氨氮降解较缓慢，10 h 后氨氮浓度开始快速下降； 而本实验中筛选的菌株TN-14耐受氨氮浓度更高，当氨氮浓度为1 200 mg ·L^-1时仍然然表现出很好的生长能力. 吴建江等^[27]从垃圾渗滤液活性污泥中筛选出1株异养硝化菌 Pseudomonas sp. XS76，能够在起始氨氮浓度约为 420 mg ·L^-1的环境下存活，并且废水C/N(COD/NH⁺₄-N)比对菌株 XS76 的氨氮去除特性影响比较显著，C/N 比越低，菌株的氨氮去除效果越不好，当废水C/N比低于10 ∶1以下，XS76的去除氨氮能力明显下降. 而一些高浓度实际废水C/N比较低，这样就会影响其去除氨氮的能力或增加污水补充碳源处理成本. 并且模拟废水和实际废水有很大差异，本实验中选育的菌株TN-14除了能耐受高氨氮的能力外，当以实际猪场废水(C/N约8 ∶1)为培养基质时，菌株TN-14对实际高氨氮猪场废水的脱氮除碳表现出很好的降解速率，22 h之内，能把猪场废水中的COD、 总氮、 氨氮、 总磷大部分去除. 表明TN-14能在实际的高氨废水生物处理中具有良好的应用前景.

(1)从环境中筛选出1株新型环境工程菌TN-14，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果为不动杆菌Acinetobacter sp..

(2)菌株TN-14具备高效的异养硝化能力和产絮能力. 异养硝化反应体系内，24 h内菌株对氨氮、 总氮的去除率分别达到97.13%和93.53%； 并具有良好的产絮特性，其培养液对0.4%的高岭土悬浊液的絮凝率可达94.74%.

(3)菌株TN-14具有良好的好氧反硝化能力. 氮源为硝酸态氮反硝化培养基中培养，反应体系中硝态氮浓度在24 h内，从94.24 mg ·L^-1降到39.32 mg ·L^-1，硝态氮的去除率达到58.28%，反硝化速率为2.28 mg ·(L ·h)^-1； 在氮源为亚硝态氮盐反硝化培养基中培养24 h，反应体系中亚硝态氮从反应初始浓度97.78 mg ·L^-1下降到21.30 mg ·L^-1，亚硝态氮去除率达78.22%，反硝化速率为2.55 mg ·(L ·h)^-1.

(4)菌株TN-14具有良好的耐氨氮和除污能力. 菌株TN-14能够在氨氮高达1 200 mg ·L^-1的环境下生长； 22 h之内能把实际猪场废水中的COD、 总氮、 氨氮、 总磷大部分去除，在实际高氨废水生物处理中具有良好的应用前景.