环境科学  2014, Vol. 35 Issue (10): 3764-3768   PDF    
引用本文
刘丹丹, 李正魁, 叶忠香, 张万广. 伊乐藻和氮循环菌技术对太湖氮素吸收和反硝化的影响[J]. 环境科学, 2014, 35(10): 3764-3768.
LIU Dan-dan, LI Zheng-kui, YE Zhong-xiang, ZHANG Wan-guang. Nitrogen Uptake and Denitrification Study on the Joint Treatment of Aquatic Vegetation and Immobilized Nitrogen Cycling Bacteria in Taihu Lake[J]. Environmental Science, 2014, 35(10): 3764-3768.
伊乐藻和氮循环菌技术对太湖氮素吸收和反硝化的影响
刘丹丹, 李正魁 , 叶忠香, 张万广    
南京大学环境学院, 污染控制与资源化研究国家重点实验室, 南京 210023
收稿日期: 2014-3-25; 修订日期: 2014-5-7.
基金项目： 国家水体污染控制与治理科技重大专项（2012ZX07101-006，2013ZX07101-014）
作者简介：刘丹丹（1989~），女，硕士研究生，主要研究方向为湖泊水体修复，E-mail：liudandan602@163.com
通讯联系人, 李正魁, E-mail：zhkuili@nju.edu.cn
摘要：从太湖梅梁湾采集无扰动泥芯样，分别添加固定化氮循环细菌、水生植物伊乐藻建立室内微宇宙，模拟生态修复，探讨不同修复处理下，硝氮的去除机制. 采用15 N标记结合同位素配对技术测定了各生态模拟柱中的反硝化速率和植物吸收速率. 结果表明，不同处理的实验柱反硝化速率差异明显，同时添加了水生植物和固定化氮循环细菌的实验柱反硝化速率最高，为99.35 μmol ·（m2 ·h）-1，植物氮吸收速率为36.55 μg ·（m2 ·h）-1. 沉水植物伊乐藻在自身吸收氮素的同时也提高了耦合硝化反硝化的作用. 与植物吸收相比，反硝化过程是主要的氮去除途径. 沉水植物与固定化氮循环菌组合生态修复技术促进了湖泊水体氮素的脱除，起到了净化作用.
关键词： 伊乐藻     氮循环菌     15 N稳定性同位素标记     反硝化     植物吸收     生态修复    
Nitrogen Uptake and Denitrification Study on the Joint Treatment of Aquatic Vegetation and Immobilized Nitrogen Cycling Bacteria in Taihu Lake
LIU Dan-dan, LI Zheng-kui , YE Zhong-xiang, ZHANG Wan-guang    
State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China
Abstract: Undisturbed sediment cores were collected from Meiliang Bay, Taihu Lake. Immobilized nitrogen cycling bacteria (INCB), Elodea nuttallii were added to four groups of restoration incubation chambers respectively to explore the nitrogen removal mechanism in different restoration treatments. 15 N tracer and isotope pairing technique were used to determine the rates of plant uptake and denitrification in different treatments. The results showed that denitrification rates were significantly different among the treatments, while cores with addition of both INCB and Elodea nuttallii achieved the highest denitrification rate of 99.35 μmol ·(m2 ·h)-1 and plant uptake rate of 36.55 μg ·(m2 ·h)-1. Elodea nuttallii in the cores could assimilate nitrate itself and enhance coupled nitrification-denitrification. Compared with plant uptake, denitrification was the main pathway of nitrogen removal. The results also showed that the combination of Elodea nuttallii and INCB could promote benthic nitrogen removal and purification of water body.
Key words: Elodea nuttallii     nitrogen cycling bacteria     15 N stable isotope tracer     denitrification     plant uptake     ecological restoration    

近年来，随着社会和经济的发展，进入水体的营养盐也在急剧增加. 工业、 农业和城市污水中排放的大量氮营养盐会导致水体的富营养化. 湖泊富营养化已经成为目前全世界共同面临的重大环境问题之一[1]. 作为我国长江中下游五大淡水湖之一，太湖也处于富营养化状态. 因此，采取合适的方法降低湖泊氮素营养盐浓度，具有重要意义[2]. 在湖泊生态系统中，水体中的氮素的去除转化过程包括微生物转化、 植物吸收作用、 挥发沉降过程、 吸附和固定化过程[3]. 氮循环微生物和水生植物能影响氮素的转化，促进湖泊水体氮素的去除[4]. 近年来，许多学者对利用水生植物或固定化氮循环菌进行生态修复去除水中氮素进行了研究[5, 6, 7, 8]. 关于沉水植物固定化微生物联用进行生态修复去除水体中氮素的研究也已有报道[9]. 然而以上的研究主要是针对水体氮素的去除效果研究，并没有定量地对氮素去除过程进行研究，对氮循环菌与沉水植物联合作用下，反硝化过程和植物吸收过程减低水体氮素的机制研究尚不多见[10]. 因此本研究选择种植沉水植物伊乐藻结合氮循环细菌，选取太湖污染较严重梅梁湾作为采样点，通过实验室模拟实验分析了添加氮循环细菌、 种植伊乐藻对湖泊水体反硝化速率、 植物氮吸收速率的影响，探讨了不同生态修复手段下氮素去除的机制.

1 材料与方法 1.1 采样点及实验设计

2013年1月用有机玻璃柱采泥器(内径90 mm，长600 mm)在太湖梅梁湾(31°12′14N，119°55′12E，图 1)采集12根完整无扰动的泥柱样，每根柱样中泥深约为20 cm，保留部分原上覆水于柱样上部，两端用橡胶塞塞紧密封，垂直放置，无扰动地带回实验室，同时采集200 L上覆水并采集沉水植物伊乐藻,一并带回实验室. 小心将采回的泥样分别移入相同尺寸的有机玻璃生态修复模拟柱中. 将生态修复模拟培养柱分为3组，每一组中有4个柱样，对每组中的4个柱样分别进行以下处理：A柱中仅有泥样，为裸泥组，作为对照样不做任何处理； B柱中添加制备好的固定化氮循环细菌； C柱采用扦插法种植5株约10 cm长势茁壮的伊乐藻； D柱采用相同方法种植伊乐藻同时添加固定化氮循环菌. 处理完后，在培养柱中尽量无扰动引采集上覆水，进行预培养，每周更换培养柱内上覆水和氮循环菌载体. 6个星期后，实验柱内生态系统趋于稳定，柱内伊乐藻生长情况良好，用新采集的湖水更换柱内的水，更换氮循环菌载体，添加Na15 NO3，静置稳定24 h后，收集水样和植物样，测定实验柱中水体各理化指标以及15 N同位素丰度，分析各实验柱中反硝化速率，植物同化吸收速率的变化.

图 1 太湖梅梁湾采样点示意 Fig. 1 Location of sampling site in Meiliang Bay,Taihu Lake
1.2 固定化氮循环菌制备

采集太湖水样、 底泥、 植物根区微生物样品，在选择性培养基上培养，并进行富集筛选得到纯化的太湖土著氨化细菌(Alcaligenes sp.)、 硝化(Nitrospira sp.)、 反硝化细菌(Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans 与 Achromobacter sp.). 通过连续培养将经活化培养的氮循环细菌固定于通过辐照法制成的载体上，得到固定化氮循环菌(immobilized nitrogen cycling bacteria,INCB)[11].

1.3 反硝化速率，植物吸收速率的测定

反硝化实验在柱内生态系统趋于稳定后进行. 在反硝化实验前采集水样，土样以及植物样品，添加前测定15 N丰度. 向3组平行实验柱中分别加入Na15 NO-3(99.21%),使其在水中浓度最终达到100 μmol ·L-1，连续24 h进行无顶空密闭静态培养. 在24 h后，小心的用注射器采集沉积物表层水样，在无气泡产生情况下溢流收集到细长的气体采集管中，气体采集管中预先加入0.5 mL ZnCl2溶液(质量分数，50%)，恒温保存收集到的样品并立即送往中国科学院南京地理与湖泊研究所分析中心，使用膜接口质谱仪(Prisma QMS200f)测定溶解性气体28N2、 29N2、 30N2、 O2. 另外，采集水样以及植物样，处理后送至南京师范大学地理科学学院使用同位素比质谱仪(Europa Scientific,Seron,Cheshire,UK)测定15 N丰度[12,13].

利用下列公式计算反硝化速率：

式中，r29和r30分别代表29N2和30N2产生速率，D15代表利用15 NO-3的反硝化速率，D14代表利用14NO-3的反硝化速率，Dw代表非耦合硝化反硝化速率，Dn耦合硝化反硝化速率，Dtot代表总反硝化速率，ε代表培养实验中15 NO-3的丰度，a代表添加同位素之前，b代表添加同位素之后[14,15].

利用下列公式计算植物吸收速率[ρt，μg ·(m2 ·h)-1]：

式中，δ15 N(water,time=ambient) 表示添加前水中同位素15 Nδ,δ15 N(water,time=0)表示添加后立刻水中同位素15 Nδ,δ15 N(veg,time=ambient)表示添加前植物同位素15 Nδ,δ15 N(veg,time=t)培养结束后植物的同位素15 Nδ,TN(veg)表示植物总氮(g ·kg-1)； Biomass(veg)表示柱子中植物总生物量(g ·m-2)[16,17].

1.4 样品的采集及测定 1.4.1 植物样品的采集处理

收割实验柱中伊乐藻植株，用蒸馏水洗净，于恒温干燥箱中60℃烘48 h，称重. 烘干后用球磨机将烘干的样品磨成粉状，将粉末状植物样品包于锡囊中，于南京师范大学地理科学学院使用同位素比质谱仪(Europa Scientific,Seron,Cheshire,UK)测定15 N丰度.

1.4.2 水质指标及测定方法

采用纳氏试剂分光光度法测定水中氨氮； 采用紫外分光光度法测定水中硝态氮； 总氮利用过硫酸钾氧化紫外分光光度计(日本岛津 UV-2450)测定； 采用便携式pH计(YSI pH计pH100)测定水体； 水中DO由便携式溶氧仪(550A)测定.

1.5 数据分析

本研究中的数据归纳采用Excel 进行； 图表分析采用Origin 8.0进行； 数据统计分析采用SPSS 13.0分析，不同处理下水质参数比较采用方差分析LSD检验，显著性水平设置为P<0.05.

2 结果与讨论 2.1 水体DO、 pH变化

在实验进行中，在10:00~20:00期间，每隔2 h测定各实验柱中的DO、 pH等参数，从而确定DO、 pH的日变化(图 2和图 3). 实验结果表明，各实验柱中水体DO值在实验过程中变化程度各不相同，有沉水植物与无沉水实验柱中DO值存在显著性差异(P<0.05). 添加沉水植物伊乐藻C、 D实验柱中，最高溶解氧达到了20 mg ·L-1 以上，最大值出现在14:00，此时是1 d中光照强度最强的时间，植物强烈的光合作用释放氧气，显著的改变了水中O2的含量，使水体DO增加达到过饱和状态[18]. 16:00后，随着光照强度的降低，光合作用也因此减弱，水体DO随之降低. 裸泥组的DO在实验过程中无明显变化. 添加氮循环菌的B组，溶解氧有轻微下降趋势，且D组的DO也比A组略低. 这可能是由于氮循环菌的添加，增加了水中氮循环菌的数量，细菌的新陈代谢活动消耗了水中的氧气. 从图 3可以看出，添加了伊乐藻的C、 D柱的pH高于未添加伊乐藻的A、 B组，分别达到了10.08和9.23，这可能是由于沉水植物光合作用过程会消耗水中二氧化碳，从而导致水体pH升高[18]. 随着光合作用的降低，水体pH逐渐下降. 未添加植物的A、 B组，水体pH变化不明显.

图 2 实验柱水体溶解氧变化

Fig. 2 Variation of DO in the experiment chambers

图 3 实验柱水体pH变化 Fig. 3 Variation of pH in the experiment chambers
2.2 反硝化速率测定结果

采用同位素配对技术(IPT)测定不同处理情况下各实验柱的反硝化速率(图 4). 各实验组的总反硝化速率存在显著性差异(P<0.05). 裸泥对照组A组的总反硝化速率为最低，是25.31 μmol ·(m2 ·h)-1； 添加氮循环菌的B组总反硝化速率为88.66 μmol ·(m2 ·h)-1； 种植沉水植物伊乐藻的C组总反硝化速率为40.10 μmol ·(m2 ·h)-1； 同时添加伊乐藻和氮循环菌的D组总反硝化速率最高，为99.35 μmol ·(m2 ·h)-1. 通过添加氮循环菌可以增加系统中氮循环菌的数量，促进氮素形态转化，从而提高反硝化速率[19]. 沉水植物根系提供了利于氮循环菌附着生长的表面，Eriksson等[20] 提出湿地中沉水植物的表面对反硝化过程与底泥具有等同的重要性，同时植物根系分泌的有机物为反硝化作用提供了碳源，促进反硝化作用[21, 22, 23]. 同时添加氮循环菌和种植沉水植物伊乐藻，氮循环细菌的加入提高了微生物的数量，反硝化菌的整体活性增强，从而更多硝态氮被反硝化，促进了非耦合反硝化. 植物为氮循环菌硝化-反硝化提供了合适的反应条件，促进了耦合反硝化[24]. 实验结果表明,在植物和氮循环共同作用下，湖泊生态系统的反硝化速率得到了显著提高，沉水植物与氮循环菌组合能促进水体氮素去除.

图 4 不同生态处理实验柱的反硝化速率

Fig. 4 Denitrification rates of different treatments
2.3 植物吸收速率测定结果

采用微宇宙15 N-NO-3实验测定水生植物对NO-3的吸收速率，得到不同处理组中沉水植物对NO-3的吸收速率(图 5). 结果表明，对照组A组和微生物B组未添加伊乐藻，所以吸收速率是0 μg ·(m2 ·h)-1. 添加伊乐藻的C组植物吸收速率是36.55 μg ·(m2 ·h)-1，种植伊乐藻同时添加氮循环菌的D柱的植物吸收速为20.34 μg ·(m2 ·h)-1. 添加氮循环菌及植物组的植物吸收速率低于仅添加植物组. 这可能是由于氮循环菌的加入，增加了系统中氮循环菌的数量，促进硝态氮的反硝化，与植物的吸收产生了竞争作用，降低了植物氮吸收速率[25].

图 5 不同生态处理实验柱的植物吸收速率

Fig. 5 Plant uptake rates of different treatments
2.4 植物吸收速率与反硝化速率的比较

通过换算对各处理下实验柱植物吸收速率与反硝化速率进行比较(表 1). 结果表明，在模拟生态柱A和B中，由于没有水生植物,主要的氮去除是通过反硝化过程,在模拟生态柱C和D中,反硝化速率分别是40.10 μmol ·(m2 ·h)-1和99.35 μmol ·(m2 ·h)-1,而植物吸收速率分别为2.61 μmol ·(m2 ·h)-1和1.45 μmol ·(m2 ·h)-1. 反硝化氮素去除速率要大于水生植物的氮吸收速率，沉水植物对微生物反硝化过程的促进大于它本身对于氮素的吸收作用，在加入伊乐藻和氮循环菌的D组，氮循环菌的加入降低了植物吸收速率，但是总体的氮素去除大于只添加氮循环菌的B组和只添加伊乐藻的C组. 结果表明,在各生态模拟系统中，植物吸收和反硝化作用都能去除水中的氮素，与植物吸收相比，反硝化过程是更主要的氮去除途径[26, 27, 28].

表 1 植物吸收速率与反硝化速率比较 /μmol ·(m2 ·h)-1

Table 1 Comparison of plant uptake rates and denitrification rates/μmol ·(m2 ·h)-1
3 结论

(1)沉水植物可以通过本身吸收作用去除水中的氮素，并且通过光合作用提高水体溶解氧，增加底泥溶解氧侵蚀深度，创造好氧-厌氧微环境，促进微生物的硝化-反硝化作用.

(2)通过添加氮循环菌，种植沉水植物伊乐藻的生态修复方法处理显著增加了梅梁湾沉积物的反硝化速率，在伊乐藻与氮循环菌组合技术生态修复下，实验柱中的反硝化速率最高.

(3)氮循环菌会与植物竞争利用水中的硝氮，微生物的反硝化速率大于植物氮吸收速率，与植物吸收相比，反硝化过程是更主要的氮去除途径.

(4)室内模拟实验表明，伊乐藻与氮循环菌组合技术可以通过植物吸收和微生物反硝化去除水体氮素，显著提高湖泊水体氮素的去除速率，促进湖泊水体净化.

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