腐殖质和Fe(Ⅲ)广泛存在于自然界中且含量十分丰富. 腐殖质/Fe(Ⅲ)还原在有机或无机污染物的厌氧生物转化中发挥了重要作用^[1,2,3]. 大量研究表明，微生物在厌氧条件下，可以将腐殖质和Fe(Ⅲ)作为电子受体，介导污染物的降解转化过程^[4]. 由于腐殖质/Fe(Ⅲ)还原在元素地球化学循环以及污染物原位修复等方面表现出重要应用前景，成为当前环境微生物研究的热点^[5]. 微生物电子传递途径的研究是揭示微生物环境行为及其电子转移特性的基础. 目前，已有大量关于腐殖质/Fe(Ⅲ)还原过程电子传递途径的研究，主要集中在革兰氏阴性模式菌地杆菌属(Geobacter)和希瓦氏菌属(Shewanella). 现有研究基本阐明了这一电子传递途径中相关电子载体以及关键细胞色素c蛋白和调控基因的功能^[6,7,8,9]. 但是，关于其它菌属的电子传递机制了解甚少. 另外，呼吸抑制剂实验和微生物基因组/转录组分析结果表明，不同电子受体条件下，微生物可能采取不同的电子传递方式实现物质还原. 特别是可溶性和不溶性电子受体条件下，微生物的电子传递链和相关基因表达可能存在明显差异^[10,11]. 然而，不同受体条件下，微生物电子传递途径的比较研究仍不深入，有许多问题待解决.

Fontibacter 属于鞘脂杆菌科(Cyclobacteriaceae)，2010年由Kmpfer等发现^[12]. 目前，该属仅有一个模式菌株Fontibacter flavus^[12]. 2012年，本实验室从厌氧污泥-微生物燃料电池中分离到该属的1株新菌，命名为Fontibacter sp. SgZ-2 (CCTCC M 2011498^T=KACC 16525^T)，并首次发现该属具有Fe(Ⅲ)和腐殖质还原能力^[13]. 本文在前期研究基础上，将详细考察Fontibacter sp. SgZ-2腐殖质/Fe(Ⅲ)还原特性，并比较氧气、 9,10-蒽醌-2-磺酸(9,10-anthraquinone-2-sulfonic acid,AQS)、 Fe-EDTA和水铁矿(hydrous ferric oxide,HFO)电子受体条件下的电子传递链组分，以期为理解Fontibacter属的电子转移特性及环境行为提供理论基础. 1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

实验中使用的试剂除非特别注明，均为分析纯(A. R.). 腐殖酸购自Sigma-Aldrich corp. 和国际腐殖酸协会(International Humic Substances Society,IHSS)，IHSS腐殖酸主要包括：Elliott Soil Humic Acid Standard (1S102H),S-HA; Pahokee Peat Humic Acid Standard (1S103H),PP-HA; Leonardite Humic Acid Standard (1S104H),L-HA. 实验中用到的铁氧化物均自行配置，方法参照文献^[14]. 呼吸抑制剂种类包括鱼藤酮(rotenone)、 双香豆素(dicumarol)、 二盐酸奎吖因水合物(quinacrine)、 二环己基碳二亚胺(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide,DCCD)、 羰基氰基3-氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone,CCCP)、 抗霉素A(antimycin A)和辣椒素(capsaicin)，纯度均为98%以上，购自成都贝斯特试剂有限公司和百灵威公司. 1.2 研究方法 1.2.1 厌氧恒温培养法研究菌株腐殖质/Fe(Ⅲ)还原特性 采用20.0 mL西林瓶厌氧培养体系，生物处理包含基础盐培养基(2.50 g ·L^-1 NaHCO₃,0.25 g ·L^-1 NH₄Cl,0.68 g ·L^-1 NaH₂PO₄ ·2H₂O,0.10 g ·L^-1 KCl)、 10.0 mmol ·L^-1 电子供体(乙酸、 丙酸、 丙酮酸、 乳酸、 葡萄糖、 蔗糖)、 1.0 mL菌悬液(1.0×10⁷CFU)和电子受体[10.0 mmol ·L^-1 Fe(Ⅲ),1.0 mmol ·L^-1 9,10-蒽醌-2,6-二磺酸(9,10-anthraquinone-2,6-disulfonic acid,AQDS)或2.0 g ·L^-1腐殖酸(humic acids,HA)]，对照为非生物对照(不添加细菌悬液)和不添加供体对照^[2,15]. 电子穿梭体对水铁矿(hydrous ferric oxide,HFO)的促进实验中，AQDS和AQS添加浓度为0.5 mmol ·L^-1，腐殖酸的添加浓度为2.0 g ·L^-1. 可溶性Fe(Ⅱ)采用邻菲罗啉比色法测定^[16]，还原态AQDS/AQS检测方法参照文献^[2]. 1.2.2 呼吸抑制剂法研究菌株电子传递链组分

呼吸抑制剂实验体系与厌氧还原体系基本相同，电子受体分别为氧气、 1.0 mmol ·L^-1 AQS、 5.0 mmol ·L^-1 Fe-EDTA和5.0 mmol ·L^-1 水铁矿. 实验组中加入不同浓度的抑制剂，对照组中加入抑制剂溶剂(rotenone/DCCD-丙酮； dicumarol-NaOH、 quinacrine-H₂O、 CCCP/antimycin A/capsaicin-乙醇)，比较抑制剂处理同抑制剂溶剂处理之间受体还原效果的差异，来确定相应电子传递链组分是否参与电子传递过程^[17,18]. 通过菌体生长量间接判断抑制剂是否影响菌株的氧气电子传递过程. 2 结果与讨论 2.1 腐殖质/Fe(Ⅲ)还原特性

菌株SgZ-2利用不同电子供体还原AQDS和Fe-EDTA的结果如图 1所示. 经过10 d反应，在乙酸、 丙酸、 丙酮酸、 葡萄糖、 蔗糖和乳酸处理中分别生成了0.029、 0.036、 0.050、 0.31、 0.71和0.047 mmol ·L^-1 的还原态AQDS(AHDS)[图 1(a)]. 在所试供体中，葡萄糖和蔗糖是菌株SgZ-2还原AQDS的最佳电子供体，乙酸、 丙酸、 丙酮酸和乳酸为供体时还原效果较差. 图 1 (b)揭示了菌株利用不同电子供体还原Fe-EDTA的效果，所试供体均可以还原Fe-EDTA. 反应10 d后，可溶性Fe(Ⅱ)生成量分别是0.27 mmol ·L^-1 (乙酸)、 0.35 mmol ·L^-1 (丙酸)、 1.0 mmol ·L^-1 (丙酮酸)、 1.1 mmol ·L^-1 (葡萄糖)、 1.2 mmol ·L^-1 (蔗糖)和0.86 mmol ·L^-1 (乳酸). 因而，丙酮酸、 葡萄糖、 蔗糖和乳酸可以作为菌株SgZ-2还原Fe-EDTA的良好受体. 综合以上结果，菌株SgZ-2 还原AQDS和Fe-EDTA的最佳电子供体是发酵性糖类(葡萄糖和蔗糖). 这一结果与菌株发酵产酸的生化实验结果基本一致^[13].

图 1

Fig. 1

acetate：乙酸； propionate:丙酸； pyruvate：丙酮酸； glucose：葡萄糖； sucrose：蔗糖； lactate：乳酸图 1 菌株SgZ-2利用不同电子供体还原AQDS和Fe-EDTA效果图Fig. 1 Effects of alternative electron donors on AQDS and Fe-EDTA reduction by strain SgZ-2

菌株SgZ-2对腐殖质模式物和腐殖酸的还原效果见图 2. 菌株SgZ-2还原腐殖质模式物的效果较好，反应12 h可以观察到AQDS被还原(即样品颜色从无色变为黄色). 菌株对AQS的还原效果明显优于AQDS. 反应72 h后，约有0.59 mmol ·L^-1 AQS被还原，0.32 mmol ·L^-1 AQDS被还原. 菌株对不同来源HA的还原能力相当. 反应8 d后，在sigma-HA、 S-HA、 L-HA和PP-HA 处理中，还原态HA还原柠檬酸铁生成的Fe(Ⅱ)含量符合以下规律：sigma-HA(0.93 mmol ·L^-1)>PP-HA(0.88 mmol ·L^-1)>L-HA(0.79 mmol ·L^-1)>S-HA(0.59 mmol ·L^-1). 腐殖质及其模式物的醌基相对含量采用傅里叶变换红外光谱扫描(FT-IR)测定，波长1600-1680 cm^-1的峰响应值表示物质中具有C O和C C结构，响应强度代表相对含量，腐殖质中不含C C，因此该波长范围内的峰值应为C O(醌基)^[2]. 根据文献^[2]中红外光谱FT-IR数据和国际腐殖酸协会网站提供的商品化腐殖酸红外光谱数据，常见腐殖质的醌基相对含量符合以下规律：AQS>AQDS>sigma-HA>L-HA>PP-HA>S-HA，菌株对不同腐殖质的还原规律与其醌基相对含量基本一致.

图 2

Fig. 2

图 2 菌株SgZ-2以葡萄糖为供体时腐殖质及其模式物的还原效果Fig. 2 Reductive ability of alternative humus and its analogy by strain SgZ-2

菌株SgZ-2对Fe(Ⅲ)的还原效果如图 3. 菌株对Fe-EDTA的还原效果明显高于柠檬酸铁(Fe-cit)，可溶性Fe(Ⅱ)生成量分别为1.60 mmol ·L^-1 和0.60 mmol ·L^-1 [图 3(a)]. Fe-EDTA(96 mV,pH 7.0,25℃)的氧化还原电位明显低于柠檬酸铁(372 mV,pH 7.0,25℃). 但是在实验培养温度下，Fe-cit溶解度随时间而逐渐降低，可溶态三价铁的浓度不高，所以其还原效果较差. 图 3(b)显示了不同电子穿梭体作用下，菌株SgZ-2对水铁矿的还原效果. 在反应初期，可溶性Fe(Ⅱ)生成量缓慢上升； 反应第30 d时，Fe(Ⅱ)生成量开始下降，可能由于Fe(Ⅱ)参与成矿作用而被消耗. 通过零级动力学方程拟合，不同电子穿梭体条件下Fe(Ⅲ)还原速率符合： 不加电子穿梭体处理(0.0086 mmol ·(L ·d)^-1,R2=0.894)-1,R2=0.985)-1,R2=0.997)-1,R2=0.957). 电子穿梭体本身的性质(如氧化还原电位、 醌基相对含量和电子接受能力等)和反应条件都是影响Fe(Ⅲ)还原的重要因素^[19,20]. 电子穿梭体对Fe(Ⅲ)还原的促进规律与穿梭体自身性质规律均吻合：Fe(Ⅲ)还原速率与电子穿梭体氧化还原电位反相关，与其醌基相对含量和电子接受容量正相关. 实验中还发现，腐殖酸模式物(AQDS和AQS)比腐殖酸对Fe(Ⅲ)还原的促进作用明显，可能原因有：①腐殖酸模式物分子量小，在铁氧化物界面和水相体系中穿梭能力强，因而电子运输速率快^[21]； ②在实验体系下(pH=7.2)，腐殖酸模式物的溶解度高，而腐殖酸的溶解度有限(碱性条件下易溶解)，因而可自由移动的穿梭物质浓度低^[21]； ③活性基团数量决定了其对Fe(Ⅲ)还原的促进效果，腐殖酸模式物醌基相对含量明显高于腐殖酸^[2]； ④实验已经证明，腐殖酸模式物的电子接受容量大，所以其充当电子穿梭体时更容易接受电子并穿梭到铁氧化物表面^[2].

图 3

Fig. 3

图 3 菌株SgZ-2以葡萄糖为供体，添加电子穿梭体对Fe(Ⅲ)还原效果的影响Fig. 3 Effects of electron mediators on the Fe(Ⅲ) reduction with glucose as electron donor by strain SgZ-2

不同电子受体条件下，呼吸抑制剂对菌株SgZ-2电子传递过程的抑制作用如图 4所示. 呼吸抑制剂对电子传递链的抑制位点见图 5(a)：quinacrine抑制FAD脱氢酶活性，capsaicin抑制NADH脱氢酶活性，dicumarol抑制醌类活性，antimycin A抑制细胞色素b-c，DCCD抑制ATP合成酶活性，CCCP抑制质子跨质膜转运. 通过综合分析呼吸抑制剂的抑制作用(图 4)，得到了以下结果.

图 4

Fig. 4

图 4 菌株SgZ-2不同受体条件下呼吸抑制剂对电子传递过程的抑制效果Fig. 4 Respiratory inhibition on electron transport chains with alternative electron acceptors by strain SgZ-2 抑制剂浓度(从左至右)：dicumarol,(20,200,400,500) μmol ·L-1; quinacrine: (20,200,400) μmol ·L-1；DCCD: (20,40,80) μmol ·L-1; CCCP: (10,20,40) μmol ·L-1; antimycin A: (150,300) μmol ·L-1; capsaicin: (500,1000) μmol ·L-1; rotenone: (40,100,200) μmol ·L-1

所试抑制剂对氧气电子传递过程均具有抑制作用，抑制效率均在50%以上[图 4(a)]. 所以，氧气条件下，菌株SgZ-2电子传递链与常规电子传递链基本相似[见图 5(a)]，包括脱氢酶、 醌类、 细胞色素和ATP合成酶. quinacrine(抑制FAD脱氢酶)抑制效果(80%)稍高于capsaicin(抑制NADH脱氢酶) (60%)，所以FAD脱氢酶在氧气电子传递过程中的参与程度稍高于NADH脱氢酶. 本实验结果与Aeromonas hydrophila Fe(Ⅲ)电子传递过程得到的结果相似^[17]. 另外，DCCD和CCCP对氧气电子传递过程均产生抑制作用，所以此过程可能偶联质子跨膜转运和ATP合成.

Fe-EDTA电子受体条件下，除了rotenone外，所试抑制剂均对菌株SgZ-2电子传递过程产生抑制作用[图 4(b)]. 其中，dicumarol抑制率较低，仅为20%-30%，所以醌类在此电子传递过程中的参与程度较低. 另外，当quinacrine(作用于FAD脱氢酶)对电子传递有明显抑制作用时，rotenone抑制作用不明显(即NADH脱氢酶不参与电子传递)，同时capsaicin也表现出明显抑制作用. 据文献^[22]报道，rotenone和capsaicin抑制NADH脱氢酶活性. 当NADH脱氢酶不参与电子传递时，这两种抑制剂的作用位点是辅酶Q (也叫quinone). 因此，Fe-EDTA受体条件下，本实验中capsaicin抑制位点可能是FAD脱氢酶的辅基辅酶Q. 综合以上结果，参与Fe-EDTA还原的电子传递途径可能有两条[图 5(b)]：电子通过脱氢酶、 醌类和细胞色素b-c或者通过另一条途径FAD脱氢酶(醌基作为其辅酶)和细胞色素b-c. 另外，DCCD和CCCP对Fe-EDTA还原过程均产生抑制作用，所以此过程可能偶联质子跨膜转运和ATP合成. 但两者抑制率均低于氧气电子传递过程，因而产能效率较低.

图 5

Fig. 5

图 5 菌株SgZ-2不同受体条件下电子传递链模型 Fig. 5 Models of electron transport chains with different electron acceptors

以AQS作为电子受体时，dicumarol和antimycin A对电子传递基本没有抑制作用，所以醌类和细胞色素b-c不参与AQS还原过程的电子传递. 另外，当quinacrine抑制率为70%时，rotenone抑制作用不明显(抑制率仅有17%左右). 同时，capsaicin抑制率在55%左右[图 4(c)]. 因而，与Fe-EDTA还原过程相似，capsaicin抑制位点也是FAD脱氢酶的辅基辅酶Q. 综上所述，菌株SgZ-2参与AQS还原的电子载体只包含FAD脱氢酶[图 5(c)]. 另外，CCCP和DCCD对此电子传递过程的抑制率较低(均在20%左右)，所以此过程偶联质子跨膜转运的产能效率也较低.

以水铁矿为电子受体时，CCCP、 DCCD和rotenone抑制作用较低，抑制率约在20%-30%. quinacrine的抑制作用最强(70%)，因而FAD脱氢酶参与水铁矿还原的电子传递过程[图 4(d)]. dicumarol、 capsaicin和antimycin A对水铁矿还原过程均没有明显的抑制作用(部分结果未列出). 所以，菌株SgZ-2参与水铁矿还原的电子载体主要是FAD脱氢酶，并且偶联质子跨膜的产能效率较低[图 5(d)]. 这一实验结果与已报道的结果存在差异. 目前，多数研究者认为，这3种抑制剂对Fe(Ⅲ)还原过程均具有抑制作用，即醌类、 NADH脱氢酶和细胞色素b-c均参与Fe(Ⅲ)还原. 但是，多数研究结论是基于柠檬酸铁等可溶性Fe(Ⅲ)的抑制剂实验^[22]，关于不溶性Fe(Ⅲ)还原过程电子载体的报道还十分罕见.

综合以上结果，不同电子受体条件下，菌株SgZ-2电子传递链组分存在明显差异. 氧气和Fe-EDTA条件下，参与电子传递的电子载体与常规电子传递链基本相似，与参与AQS和HFO还原的电子传递链成分差别较大. AQS电子受体条件下，参与电子传递的电子载体与HFO还原过程基本相似. 所以，可溶性和不溶性Fe(Ⅲ)还原过程的电子传递链组分存在明显差异，并且可溶性受体之间的电子传递链成分也不同. 与模式菌Shewanella相比，菌株SgZ-2氧气条件下的电子传递链组分基本相似^[23,24]. 与模式菌Shewanella不同，醌类可能在菌株SgZ-2的厌氧电子传递中参与程度较低. 特别是在AQS和HFO还原过程中，醌类可能不是电子传递链主要组分. 另外，本实验结果也表明，不同电子传递途径可能存在重叠性，即同一电子传递链可能同时具有多种电子传递功能，如氧气与Fe-EDTA条件下，菌株SgZ-2可能共用部分电子传递链组分. 据报道，微生物的硝酸盐还原和可溶性Fe(Ⅲ)还原也共用部分电子传递链组分^[17,25].

目前，不同电子受体条件下，微生物电子传递途径的比较研究还不深入. 现有的观点也没有统一定论. 有研究认为，微生物利用可溶性电子受体AQDS和可溶性Fe(Ⅲ)时，电子传递途径相似，部分还原酶位于周质中，部分存在于细胞外膜^[26,27]. 也有研究报道，可溶性电子受体(AQDS和螯合铁)同不溶性电子受体(电极和铁氧化物)之间的电子传递途径存在差异^[28,29]. 另外，不溶性电子受体之间(铁氧化物和电极)，参与微生物电子传递的关键酶可能相同或相似，但是每种酶的参与程度、 功能或重要性可能差异较大^[10]. 最近研究发现，革兰氏阳性嗜热菌Thermincola potens 的AQDS与不溶性Fe(Ⅲ)的电子传递途径基本相似^[30]. 本实验得到的结果更加证实了微生物不同电子受体之间的电子传递途径存在差异. 与模式菌比较发现，这种差异可能具有种属专一性. 3 结论

(1) 腐殖质/Fe(Ⅲ)还原特性：Fontibacter sp. SgZ-2具有还原腐殖质模式物(AQDS和AQS)、 腐殖酸(HA)和可溶性Fe(Ⅲ) (Fe-EDTA和柠檬酸铁)以及铁氧化物(水铁矿)的能力. 发酵性糖类(葡萄糖和蔗糖)是菌株SgZ-2还原腐殖质和Fe(Ⅲ)的最佳电子供体. 添加腐殖质物质可促进菌株对水铁矿的还原速率.

(2) 不同电子受体条件下电子传递链组分比较：氧气和Fe-EDTA可溶性电子受体条件下，Fontibacter sp. SgZ-2的电子传递链组分基本相似，包括脱氢酶、 醌泵和细胞色素b-c. AQS和水铁矿电子受体条件下，电子传递链组分只包含脱氢酶. 所以，可溶性和不溶性Fe(Ⅲ)之间的电子传递链组分存在差异，并且可溶性受体之间(氧气、 Fe-EDTA和AQS)的电子传递链组分也不同.