S-异丙甲草胺(S-metolachlor)是手性农药对映体纯研究与应用成功的一例，许多国家包括我国已用S-异丙甲草胺取代外消旋异丙甲草胺的生产使用，其环境行为研究已受到关注^[1]. 镉作为毒性最强的重金属元素之一，已被证实能诱导植物组织产生活性氧^[2,3]，导致细胞膜过氧化，破坏细胞膜的完整性，破坏细胞器结构，降低叶绿体PSⅡ感光系统活性等^[4]. 随着工农业的发展，进入环境的污染物数量和种类明显增加，复合污染的研究正处于不断深入之中^[5]，但有机-无机复合污染中手性农药和重金属的复合污染机制研究较少.

叶绿素荧光与光合作用中各个反应过程紧密相关，任何逆境对光合作用各过程产生的影响都可通过体内叶绿素荧光诱导动力学变化反映出来^[6,7]. 因此，叶绿素荧光参数可作为逆境条件下植物抗逆反应的指标之一^[8]. 本文选择斜生栅藻为毒性指示生物，研究了S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对斜生栅藻叶绿素含量及叶绿素荧光特性的影响，从光合作用角度分析了手性农药与重金属复合污染对微藻的毒性及可能机制，以期为评估污染物生态风险提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 藻种及培养

斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中国科学院水生生物研究所，培养基采用水生4号(HB-4)人工培养液^[9]，恒温光照培养^[10]. 1.2 主要试剂 S-异丙甲草胺购自先正达(瑞士)公司，纯度为96%； 氯化镉(CdCl₂)购自国药集团化学试剂有限公司，为分析纯； 其他试剂、 药品均为分析纯. 水为二次亚沸蒸馏水. 1.3 实验方法

S-异丙甲草胺和Cd²⁺浓度分别为0、 0.02、 0.1、 0.2 mg ·L^-1，进行单独及联合作用正交试验，每组处理设3个平行. 处理96 h后取藻液进行叶绿素含量和叶绿素荧光测定.

叶绿素含量测定：采用丙酮浸提法^[11]，按照Mackinney公式计算叶绿素a(Chl a)和叶绿素b(Chl b)的含量^[12].

叶绿素荧光特性：藻液40 mL浓缩至1 mL，取200 μL至96孔酶标板中，用叶绿素荧光仪(德国WALZ公司IMAG-MAX/L)测定其各叶绿素荧光参数和荧光动力学方程. 将放有藻液的酶标板放置在暗处暗适应20 min后放入样品室，开启检测光，实时荧光F_t[μmol ·(m² ·s)^-1]相对稳定后得到最小荧光(F₀)，打开饱和脉冲，一个脉冲后得到最大荧光(F_m)，打开活化光3 min，F_t稳定后测得光适应后的最大荧光(F′_m). 快速光响应曲线测定：样本经暗适应后，逐渐开启光强度分别为0、 1、 36、 81、 146、 231、 336、 461、 611、 801 μmol ·(m² ·s)^-1的光化光，每个强度的光化光照射20 s后，分别取平均值绘出快速光响应曲线^[13,14].

根据以下公式计算相应叶绿素荧光参数：

可变荧光

PSⅡ最大量子产量

PSⅡ实际量子产量

光化学淬灭系数

非光化学淬灭系数

相对光合电子传递速率

实验数据使用Microsoft Excel 2010和Origin 8.1进行处理，用SPSS 15.0进行单因素方差分析(ANOVA)并用Duncan法进行显著性检验，结果以平均值±SD表示.

2 结果与讨论 2.1 S-异丙甲草胺与Cd²⁺对斜生栅藻叶绿素含量的影响

光合色素是在光合作用中参与吸收、 传递光能或原初光化学反应的色素，是植物进行光合作用的物质基础^[15]，Chl a或总叶绿素Chl (a+b)含量常被作为测定光合作用的指标. 本实验通过测定Chl a及含量来探讨S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对斜生栅藻光合作用的影响. 由表 1可知，处理组的Chl a和Chl (a+b)含量低于空白组，其含量与有毒物质的浓度呈负相关效应. 与空白组比较，0.02、 0.1、 0.2 mg ·L^-1 S-异丙甲草胺处理后Chl a含量减少了19.9%、 31.8%、 70.3%，Cd²⁺处理后使之分别减少了1.8%、 70.8%、 87.1%，表明低浓度S-异丙甲草胺对Chl a含量影响比Cd²⁺大，但高浓度下Cd²⁺的影响更大. S-异丙甲草胺与Cd²⁺联合作用整体呈协同作用，大于两者单独对斜生栅藻叶绿素含量的影响.

表 1(Table 1)

表 1 暴露96 h后斜生栅藻的叶绿素含量 /mg ·L-1Table 1 Chlorophyll content of S. obliquus after 96 h exposure/mg ·L-1 浓度 Chl a Chl (a+b) CK 0.559±0.188 f 1.400±0.473 e 0S+0.02Cd 0.549±0.139 ef 1.414±0.359 e 0S+0.1Cd 0.163±0.028 abc 0.440±0.075 abc 0S+0.2Cd 0.072±0.041 ab 0.198±0.111 ab 0.02S+0Cd 0.448±0.147 def 1.091±0.396 de 0.02S+0.02Cd 0.423±0.070 def 1.093±0.182 de 0.02S+0.1Cd 0.196±0.058 bc 0.524±0.153 bc 0.02S+0.2Cd 0.111±0.028 ab 0.301±0.080 ab 0.1S+0Cd 0.381±0.172 de 0.808±0.411 cd 0.1S+0.02Cd 0.319±0.070 cd 0.817±0.177 cd 0.1S+0.1Cd 0.132±0.050 ab 0.345±0.131 ab 0.1S+0.2Cd 0.045±0.011 ab 0.126±0.030 ab 0.2S+0Cd 0.166±0.072 abc 0.212±0.107 ab 0.2S+0.02Cd 0.363±0.069 d 0.812±0.164 cd 0.2S+0.1Cd 0.123±0.085 ab 0.300±0.220 ab 0.2S+0.2Cd 0.005±0.002 a 0.012±0.005 a

表 1 暴露96 h后斜生栅藻的叶绿素含量/mg ·L-1 Table 1 Chlorophyll content of S. obliquus after 96 h exposure/mg ·L-1

常用的叶绿素荧光参数F₀、 F_v/F_m和F_v/F₀等能够较清晰地反映藻类的生理情况. F₀是经过暗适应的光合机构全部 PSⅡ反应中心开启时发出的荧光强度^[16]. F_v/F_m为 PSⅡ反应中心的内荧光能转换效率，表征光合系统原初光能转换效率的高低^[17]. F_v/F₀代表PSⅡ的潜在活性^[18]. 由表 2可知，S-异丙甲草胺对斜生栅藻F₀、 F_v/F_m、 F_v/F₀值

的影响不显著(P<0.05)，而Cd²⁺对斜生栅藻F₀、 F_v/F_m、 F_v/F₀值的影响明显，随Cd²⁺浓度升高斜生栅藻F₀值显著增加，F_v/F_m、 F_v/F₀值显著减小. F₀的增加可能是由于PSⅡ反应中心出现可逆的失活或遭到不易逆转的破坏，也可能是由于类囊体膜受到损伤^[19]，F_v/F_m和F_v/F₀值降低，可用来鉴定PSⅡ反应中心遭受损伤的情况^[20]. 结果表明Cd²⁺处理的影响显著于S-异丙甲草胺的影响，Cd²⁺处理可能导致了斜生栅藻PSⅡ反应中心及类囊体膜受损. 当S-异丙甲草胺与Cd²⁺联合作用时，与Cd²⁺单独作用对斜生栅藻F₀、 F_v/F_m和F_v/F₀值的影响差异不大，说明两者联合作用导致的藻细胞叶绿体的破坏或PSⅡ系统的可逆失活主要是受Cd²⁺的影响.

表 2(Table 2)

表 2 暴露96 h后斜生栅藻的F0、 Fv/Fm、 Fv/F0Table 2 The F0,Fv/Fm,Fv/F0 of S. obliquus after 96 h exposure 浓度/mg ·L-1 F0 Fv/Fm Fv/F0 CK 0.192±0.005 b 0.667±0.006 hi 1.999±0.048 i 0S+0.02Cd 0.251±0.005 cde 0.629±0.016 g 1.696±0.114 g 0S+0.1Cd 0.275±0.014 f 0.546±0.028 c 1.207±0.135 c 0S+0.2Cd 0.310±0.015 gh 0.526±0.016 b 1.111±0.069 bc 0.02S+0Cd 0.203±0.017 b 0.666±0.004 hi 1.997±0.035 i 0.02S+0.02Cd 0.245±0.014 cd 0.600±0.017 ef 1.504±0.111 ef 0.02S+0.1Cd 0.263±0.009 def 0.592±0.008 def 1.451±0.050 def 0.02S+0.2Cd 0.354±0.005 i 0.520±0.002 b 1.085±0.009 b 0.1S+0Cd 0.199±0.012 b 0.672±0.004 i 2.054±0.042 ij 0.1S+0.02Cd 0.251±0.018 cde 0.605±0.021 f 1.536±0.129 f 0.1S+0.1Cd 0.268±0.010 ef 0.577±0.012 d 1.367±0.065 d 0.1S+0.2Cd 0.312±0.004 gh 0.510±0.007 b 1.043±0.026 b 0.2S+0Cd 0.196±0.012 b 0.647±0.004 gh 1.837±0.023 h 0.2S+0.02Cd 0.241±0.015 c 0.642±0.009 g 1.792±0.064 gh 0.2S+0.1Cd 0.268±0.009 ef 0.583±0.011 de 1.402±0.065 de 0.2S+0.2Cd 0.330±0.004 h 0.481±0.006 a 0.925±0.024 a

表 2 暴露96 h后斜生栅藻的F0、 Fv/Fm、 Fv/F0Table 2 The F0,Fv/Fm,Fv/F0 of S. obliquus after 96 h exposure

2.2.2 S-异丙甲草胺与Cd²⁺复合污染对快速光响应曲线变化的影响

实际量子产量[Y(Ⅱ)]表示作用光存在时 PS II的实际量子效率，该参数不仅与碳同化有关，也与光呼吸及依赖O₂电子流有关^[21]. 从图 1可以看出，暴露96h后，S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用均呈现随光强的增加斜生栅藻的Y(Ⅱ)逐渐降低的趋势，光强一定时，随有毒物质浓度升高Y(Ⅱ)减小，且Cd²⁺的影响要显著于S-异丙甲草胺的影响. 光强为231 μmol ·(m² ·s)^-1时，空白组Y(Ⅱ)的平均降幅为62.5%，Cd²⁺处理组随Cd²⁺浓度的升高平均降幅分别为68.0%、 82.5%和100%，S-异丙甲草胺处理组平均降幅分别为66.1%、 72.1%和79.6%. 光强一定时，Cd²⁺与S-异丙甲草胺联合作用，Y(Ⅱ)降幅均小于Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独作用时的降幅. 光强为231 μmol ·(m² ·s)^-1时，0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺单独处理组Y(Ⅱ)的降幅为82.5%，与S-异丙甲草胺联合作用下，随S-异丙甲草胺浓度的升高，Y(Ⅱ)的降幅分别为66.4%、 69.9%和63.9%.

图 1

Fig. 1

图 1 PSⅡ实际量子产量Y(Ⅱ)随光强的变化Fig. 1 Change of Y(Ⅱ) as a function of PAR

光化学淬灭系数(qP)表示总PSⅡ反应中心中开放的反应中心所占比例，即激发能被开放的反应中心捕获并转化为化学能而导致的荧光淬灭，反映光适应状态下PSⅡ进行光化学反应的能力，qP越大，PSⅡ的电子传递活性越大^[22]. 图 2表明，暴露96 h后，S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对qP的影响均呈现随光强的增加qP逐渐降低的趋势； 光强一定时，随有毒物质浓度的升高qP减小，且Cd²⁺作用的影响要显著于S-异丙甲草胺的作用. 光强为231 μmol ·(m² ·s)^-1时，空白组qP平均降幅为45.1%，Cd²⁺处理组随Cd²⁺浓度的升高平均降幅分别为59.5%、 78.2%和100%，S-异丙甲草胺处理组平均降幅分别为43.5%、53.6%和68.0%. 光强一定时，S-异丙甲草胺与Cd²⁺联合作用时，qP降幅小于S-异丙甲草胺或Cd²⁺单独处理组. 光强为231 μmol ·(m² ·s)^-1时，0.1 mg ·L^-1 Cd²⁺单独处理组的qP的降幅为78.2%，与S-异丙甲草胺联合作用下，随S-异丙甲草胺浓度的升高，qP的降幅分别为65.0%、 67.4%、 61.6%. S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对qP的影响趋势和其对Y(Ⅱ)的影响趋势一致.

图 2

Fig. 2

图 2 光化学淬灭系数qP随光强的变化Fig. 2 Change of photochemical quenching (qP) as a function of PAR

非光化学淬灭系数(NPQ)常用于衡量过剩激发能的耗散情况，反映的是天线色素吸收的光能不能用于电子传递而以热等形式耗散掉的光能部分，而热耗散是植物保护PSⅡ的重要机制^[16]. 图 3为S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用下对斜生栅藻NPQ的影响. 结果表明，暴露96 h后，S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对NPQ的影响均呈现随光强的增加NPQ逐渐增大的趋势； 光强一定时，随有毒物质浓度的升高NPQ减小. 光强为461 μmol ·(m² ·s)^-1时，Cd²⁺处理组随Cd²⁺浓度的升高NPQ分别是空白组的0.55倍、 0.31倍和0.15倍，使热耗散减少造成对PSⅡ系统的影响； S-异丙甲草胺处理组随浓度的升高分别是空白组的1.19倍、 1.29倍和0.45倍，在S-异丙甲草胺低浓度下有增加热耗散的作用. Cd²⁺对热耗散的影响要显著于S-异丙甲草胺的影响. 光强一定时，Cd²⁺与S-异丙甲草胺联合作用对NPQ的影响要小于Cd²⁺单独作用，光强为461 μmol ·(m² ·s)^-1时，0.2 mg ·L^-1Cd²⁺单独作用处理组的NPQ是空白组的0.15倍，而与S-异丙甲草胺联合作用时，随S-异丙甲草胺浓度的升高，NPQ分别是空白组的0.21倍、 0.33倍、 0.23倍.

图 3

Fig. 3

图 3 非光化学淬灭系数NPQ随光强的变化Fig. 3 Change of non-photochemical quenching (NPQ) as a function of PAR

相对光合电子传递速率(rETR)反映PSⅡ实际光强下的表观电子传递效率，用于度量光化学反应导致碳固定的电子传递情况^[23]. 从图 4可以看出，暴露96 h后，S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对斜生栅藻rETR的影响呈现随光强增加rETR先升高后降低的趋势； 光强一定时，rETR随有毒物质浓度的升高而减小，且Cd²⁺对rETR的影响要显著于S-异丙甲草胺的影响. 光强为231 μmol ·(m² ·s)^-1时，空白组rETR为27.6 μmol ·(m² ·s)^-1，Cd²⁺处理组随Cd²⁺浓度的升高rETR分别为23.4、 10.7、 0 μmol ·(m² ·s)^-1，S-异丙甲草胺处理组rETR分别为25.6、 20.9、 14.1 μmol ·(m² ·s)^-1. S-异丙甲草胺存在条件下，与不同浓度Cd²⁺联合作用对斜生栅藻rETR的影响要小于Cd²⁺单独作用的影响.

图 4

Fig. 4

图 4 相对光合电子传递速率rETR随光强的变化Fig. 4 Change of relative electron tranaport ratio (rETR) as a function of PAR

Y(Ⅱ)的整体降低，说明S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用阻止了斜生栅藻细胞同化力(NADPH，ATP)的形成，从而影响对碳的固定与同化^[24]. qP是PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，较低的qP反映PSⅡ中开放的反应中心比例和参与CO₂固定的电子减少^[25]. qP和rETR的整体降低表明S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用使斜生栅藻电子传递效率下降，电子由PSⅡ的氧化侧向PSⅡ反应中心的传递受阻，用于进行光合作用的电子减少，以热或其他形式耗散的光能增加. 而NPQ的整体降低表明S-异丙甲草胺与Cd²⁺胁迫对斜生栅藻正常生理功能造成严重伤害，PSⅡ受到了影响，对热能的耗散能力逐渐丧失. 光强一定时，叶绿素荧光参数随有毒物质浓度的升高而减小，且Cd²⁺单独作用的影响要显著于S-异丙甲草胺单独作用的影响，这与对叶绿素含量的影响结果一致. S-异丙甲草胺与Cd²⁺单独及联合作用对光合系统具有较强毒害作用. 3 结论

(1)Cd²⁺单独作用对斜生栅藻叶绿素含量的影响大于S-异丙甲草胺单独作用的影响，S-异丙甲草胺与Cd²⁺联合作用对叶绿素含量的影响整体呈协同作用.

(2)S-异丙甲草胺单独作用对斜生栅藻叶绿素荧光参数F₀、 F_v/F_m、 F_v/F₀、 Y(Ⅱ)、 qP、 NPQ和rETR影响不大，Cd²⁺单独作用对叶绿素荧光参数影响显著，Cd²⁺单独作用对叶绿素荧光参数的影响要大于S-异丙甲草胺单独作用的影响.

(3)Cd²⁺与S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻叶绿素荧光参数的影响随有毒物质浓度的升高而增加，对斜生栅藻正常生理功能造成严重伤害，PSⅡ受损，抑制光合作用的原初反应，阻碍光合电子传递的过程，对热能的耗散能力逐渐丧失.

(4)Cd²⁺与S-异丙甲草胺联合作用对叶绿素荧光参数的影响主要是受Cd²⁺的影响.