在污水处理中微生物的内源呼吸是指活性细胞利用细胞内含物作为基质进行新陈代谢过程中的呼吸作用,通常发生在没有任何其他基质可利用时^[1]. 在饥饿状态下细胞不得不自身氧化、 分解自身组织以生成能量提供给细胞维持过程^[2]. 衡量内源呼吸的大小即内源呼吸速率，其定义为污泥在没有易降解物质时单位时间单位体积内的耗氧量^[3].

内源呼吸作为活性污泥的重要基础代谢指标，可有效地表征活性污泥的活性与生物量^[3]、 溶氧的有效利用率^[4]等重要工艺性能. 很多动力学参数和化学计量系数的测量也都基于内源呼吸^[1,5]. 但活性污泥的内源呼吸过程研究较少，对活性污泥何时进入内源呼吸没有明确参数表征. 虽曾有文献解析内源呼吸过程^{[2, 3, 6, 7, 8]}，但是没能明确指出内源呼吸中各阶段微生物种群的变化特征. 目前污水处理厂由于测量工具以及测量方法的局限性，无法对污泥的呼吸过程进行定性的分析，因此污水处理厂的运行管理中出现的微生物种群变化问题缺乏理论指导.

本研究在引入呼吸图谱和呼吸速率比例概念的基础上，探索了以去除BOD为代表的异养菌和以硝化菌为代表的自养菌两类典型细菌进入内源呼吸的时间以及各自的抗衰减能力. 通过结合内源呼吸过程特征以及活性污泥微生物变化对污泥的活性进行定性分析，以期为污水处理厂的实际运行管理提供理论基础. 1 材料与方法 1.1 实验材料

污泥来源于西安市某A²/O污水处理厂好氧池内的活性污泥. 活性污泥测定前先用无机无氮中性缓冲溶液清洗污泥，然后通过搅拌-静沉-去上清液，重复3次. 然后将洗好的污泥置于恒温好氧反应器内.

实验采用课题组开发的呼吸仪^[9]，由恒温水浴的反应器、 两个探头、 PLC和电脑组成. 其中荧光法溶解氧探头(瑞士Hamilton公司出产的HAMILTON Visiferm DO 120)，pH计(瑞士瑞士Hamilton公司出产的HAMILTON Polilyte Plus Arc 120)监测反应室中的溶解氧及pH变化，数据记录频率分别为6s、 10s一次，然后通过PLC把数据传输到电脑. 测试过程中用水浴维持反应器温度在25℃±0.5℃. 以0.05mol ·L^-1的HCl和NaOH调节pH使其保持稳定. 测得反应器DO在(7.2±0.1)mg ·L^-1，控制pH在7.7±0.1. 1.2 分析方法

实验方法采用呼吸计量法^[1,10]，通过呼吸仪监测液相中的氧平衡浓度，计算得到氧吸收速率. 呼吸速率由外源性呼吸和内源性呼吸两部分组成，其中外源性呼吸又包括自养菌呼吸和异养菌呼吸部分. 公式表示如下：

在实际测量过程中为了能够区分开自养菌呼吸和异养菌呼吸，可以用以下的实验来测得. 测量过程，先对约6 L污泥充分(恒温)曝气，每隔一定时间取泥300 mL置于恒温水浴的呼吸仪中，先在无基质条件下测定了OUR_en，然后加入50mg ·L^-1的氯化铵测定OUR_N(测量时间很短，在10 min)，最后加入300mg ·L^-1的乙酸钠(并加入适量的微量元素，保证基质充足)测定OUR_T(实验首先是基于假设6 h污泥就进入了内源呼吸，测了三者实验数据).

公式中，①无基质条件下OUR_en； ②只有氯化铵时的呼吸速率OUR_N=OUR_en+OUR_A； ③只有乙酸钠的呼吸速率OUR_C=OUR_en+OUR_H； ④加入氯化铵和乙酸钠的呼吸速率，即总的呼吸速率OUR_T=OUR_en+OUR_A+OUR_H.

传统测定内源呼吸的方法是通过投加硝化抑制剂ATU实现的，本研究是污泥的总内源呼吸过程，包括自养菌内源呼吸和异养菌内源呼吸. 通过投加不同的基质，来是实现不同菌种呼吸速率的分离. 文献^[6]中指出硝化抑制剂ATU对异养菌的可能有影响，ATU可能在抑制自养菌生长的同时也一定程度上对异养菌有影响^[11]. 自养菌即硝化细菌，包括氨氮氧化细菌(AOB)和亚硝氮氧化细菌(NOB)，ATU主要是抑制AOB的NH⁺₄氧化过程，而对于NOB的NO^-₂氧化过程的抑制作用需要投加NaClO₃或是叠氮化物^{[12, 13, 14]}. 因此通过投加不同基质，来实现不同菌种呼吸速率分离，该方法不仅操作简单，节省用药成本，而且缩短了测试时间，同时异养菌也不会受到抑制，实验结果更加真实、 可靠. 2 结果与讨论 2.1 内源呼吸过程中SOUR的变化

由于采用呼吸计量法与常规化学分析方法结合的手段对微生物过程测量技术的局限性，只能简单测得OUR_en和OUR_T以及常规水质等参数，这些数据只能粗略得到微生物整体进入内源呼吸的情况，而无法表征不同类型微生物进入内源呼吸过程的呼吸能力. 在基质充足的前提条件下，生物量的增加会引起OUR增加^[5,15]，而生物量衰减则会导致OUR的减小. 其他条件一定时，内源呼吸速率与污泥浓度的变化趋势一致,即比内源呼吸速率与污泥浓度无关^[3,16]. 同理，总呼吸速率、 自养菌呼吸速率和异养菌呼吸速率也和VSS相关，所以文中使用SOUR比呼吸速率，以消除VSS的影响.

在曝气过程中SOUR_T后期出现了两个平台期，当污泥平台时(污泥早已进入内源呼吸期)，这样就会误使人们以为这是污泥进入内源呼吸的标志，从而导致实验数据准确性不高. 如图 1所示，可以看出SOUR_T由上升转为下降的转折点，SOUR_H和SOUR_A同时出现转折，是异养菌和自养菌真正的进入了内源呼吸的点. 文献中给出的活性污泥完全进入内源呼吸期的时间各有不同，1 h(呼吸计量法)^[17]到5 d^[6]不等. 同样的通过SOUR_en曲线，该曲线基数较小且较稳定，受外界影响较小，测量精度要求高，分析的难度大.

图 1

Fig. 1

图 1 内源呼吸过程的比呼吸速率 Fig. 1 Specific respiration rate in the endogenous respiration process

SOUR_T由SOUR_H、 SOUR_A和SOUR_en三部分组成. 由这四部分曲线组成的图形，本研究将其定义为呼吸图谱. 从呼吸图谱中看出，SOUR_en整体水平较低，变化幅度小. 图 1中0~10 h，SOUR_T逐渐上升，表明生物量在增加，说明污泥中还存在一部分可被利用的基质，包括胞外物质EPS^[18]、 被絮体吸附的物质以及胞内存储物PHB^[19,20]等. 10 h，是SOUR_T由上升转为下降的转折点，SOUR_H和SOUR_A同时出现转折，表明异养菌和自养菌同时进入内源呼吸. 不同的污泥组成、 污泥内EPS、 F/M^[10]等不同，造成进入内源呼吸时间不同，所以实验开始提出假设，污泥6 h进入了内源呼吸，证明假设不成立，实际污泥进入内源呼吸的时间是10 h. 基于不同污泥进入内源呼吸时间不同，采用本研究介绍的测定方法，可以确定具体的时间.

从图 1中可以看出，异养菌和自养菌在内源呼吸过程中明显分为两部分，一部分是不可恢复部分，即图 1中的下降段，其在基质充足的条件下不能恢复活性，可能是微生物衰减死亡了； 另一部分在基质充足条件下可快速恢复活性，并且能发挥其功能的部分，即图 1中的平稳段，是可快速恢复部分. 可快速恢复部分能够在基质缺乏/饥饿条件下，处于休眠保护状态，一旦基质充足，能够快速恢复活性，维持微生物的正常生命活动. 图 1中平稳段，将其定义为微生物的休眠期.

10~18 h，SOUR_T曲线下降，其中SOUR_H以较快的速率下降，下降了最高值的24.49%，说明异养菌中不可恢复部分占总量的24.49%，而剩余75.51%都是可快速恢复部分. 同理，自养菌呼吸速率SOUR_A以较慢的速率下降，下降了最高值的62.22%，说明自养菌中不可恢复部分占总量的62.22%，而只有37.78%是可快速恢复部分. 72h之后，SOUR_H和SOUR_A均稳定，异养菌和自养菌进入了休眠期. 最高值时，SOUR_H是SOUR_A的1.11倍，而休眠期时两者比例是的2.02倍. 对应该系统污泥的异养菌和自养菌的浓度占MLVSS的比例分别为28.87%和2.72%.

18~48 h的SOUR_A曲线下降比例占SOUR_A(18h时刻)的20%，下降幅度较大，所以SOUR_A趋势线是下降的趋势. 18~48 h，根据公式，SOUR_T是OUR_en，OUR_A和OUR_H三者之和，OUR_en基本稳定，OUR_A下降，OUR_H略有上升(波动变化)，自养菌部分衰减，异养菌利用自养菌衰减死亡的作为基质，从而使SOUR_T基本维持不变. 从18~48 h，SOUR_T曲线下降的比例占SOUR_T(18 h时刻)的5%，变化幅度很小，近似是稳定的趋势. 同时从48~72 h，SOUR_T曲线下降的比例占SOUR_T(48 h时刻)的27%，下降比例明显，此处48 h可能是一个潜在的转折点，若将18~72 h整体看作是一段下降段，则忽略了这一点的变化，同时趋势线明显偏离了48 h的数据点. 此转折点的具体含义还需要进一步的实验验证. 因此本文将18~72 h细分为两个阶段.

通过呼吸图谱中的异养菌和自养菌的呼吸速率曲线变化，可以分析得出异养菌和自养菌进入内源呼吸时间相同，但异养菌可快速恢复部分比自养菌可快速恢复部分大得多(75.51%和37.78%，约两倍)，休眠期时异养菌微生物是自养菌微生物的两倍，充分说明异养菌和自养菌抗饥饿能力不同. 当饥饿环境变为基质充足条件，异养菌中可迅速恢复活性部分的比例高，则说明异养菌微生物抗冲击负荷能力高. 相反，自养菌微生物抗冲击负荷能力差，较敏感. 长期基质缺乏，只有约三分之一的自养菌存活，对应到实际污水处理厂，如果自养菌大量流失，那么出水水质难以保证达标处理. 这也同文献^[21]中的结论相一致. 主要原因是，异养菌与自养菌在细胞代谢、 维持过程方面是不同的^[2]，在异养菌细胞内有提供能量的胞内聚合物. 在外源基质不足的条件下，异养菌转而利用胞外物质EPS、 胞内存储物PHB等，很快地进入了内源呼吸阶段，因此能够平稳的保持较长时间. 文献^[7,22]中也指出异养菌细胞能够更好地适应衰减的环境，也可能是异养菌细胞能够进行隐形生长，补偿了衰减过程中活性细胞的死亡. 2.2 内源呼吸过程中各呼吸速率比例的变化 如果将总呼吸速率看作是1，异养菌呼吸速率、 自养菌呼吸速率和内源呼吸速率同时除以总呼吸速率，得到各自的呼吸速率比例，我们将此定义为呼吸速率比例. 该参数可表征各呼吸速率占总呼吸速率的比例大小，从而了解呼吸过程中各呼吸速率的耗氧量的相对大小.

表 1(Table 1)

表 1 不同污泥的呼吸比例 /% Table 1 Respiration proportion of different sludges/% 不同污泥来源比例 某污水厂A2/O好氧池 某污水厂Orbal氧化沟 实验室A2/O好氧池 实验室SBR1 实验室SBR2 SOURen/SOURT 11.72 25.13 5.22 9.05 6.23 SOURA/SOURT 41.15 33.90 19.13 9.83 5.16 SOURH/SOURT 47.13 41.14 75.65 81.12 88.61

表 1 不同污泥的呼吸比例 /% Table 1 Respiration proportion of different sludges/%

不同污泥由于微生物组成不同、 活性等不同，使得呼吸速率比不同. 从表 1中可以看出，污水厂污泥的内源呼吸速率的比例较高，实验室的较低； 污水厂的异养菌呼吸比例较低，而实验室的很高，高于75%. 还可以看出SOUR_en/SOUR_T的范围在5%~15%； SOUR_A/SOUR_T的范围在5%~45%，范围较宽； 而SOUR_H/SOUR_T的范围在40%~90%. 异养菌是活性污泥的主要组成，对应的异养菌呼吸速率较大，从而异养菌呼吸速率比也越大. 污水厂的异养菌浓度占MLVSS的比例在15%～60%^[15,23,24]，实验室的异养菌浓度占MLVSS的比例在60%~80%^{[25, 26, 27]}. 呼吸计量法测定了该污泥的异养菌和自养菌的浓度占MLVSS的比例分别为28.87%和2.72%. 其中污水厂异养菌比例较低，也有一部分原因是在运输过程和实验室的检测过程，污泥的活性可能进一步的降低. 其中异养菌比例主要与污泥龄(SRT)和进水水质有关，污泥龄越长，比例越低； 进水中不可生物降解有机物含量高，比例也越低^[23,28]. 而自养菌的浓度占MLVSS的比例在1%~10%^[5,29]，这也同本实验室测得的数据一致^[30]. 本实验室同时测了污水厂和实验室培养的活性污泥，其中污水厂自养菌的浓度较低，实验室比例较高. 同时表中也可以看出实际污水处理厂的内源呼吸比例要比实验室污泥的大.

其中异养菌和自养菌浓度占MLVSS的比例计算如下：

图 2

Fig. 2

图 2 呼吸速率比例随曝气时间的变化 Fig. 2 Variation of respiration rate proportion with the aeration time

图 2中表示内源呼吸过程中各呼吸速率比例的沿时变化，在开始曝气的0~18 h阶段，异养菌呼吸比例和自养菌呼吸比例均较高，分别占总呼吸比例的47.12%和41.15%. 由于曝气起初反应器内残留着一些基质且在好氧条件下，异养菌和自养菌利用水中残留的基质用于生长，两者同步上升，其比例基本不变. 随着曝气时间的进一步加长，残留的基质基本被消耗殆尽，18 h之后，异养菌呼吸比例上升，由43.11%上升到56.52%，上升了13.41%； 自养菌呼吸速率的比例开始下降，比例由44.95%下降至27.98%，下降了16.97%； 内源呼吸比例相比其他两者，基本维持不变. 产生这一变化的原因是，虽然异养菌呼吸速率维持不变，但由于内源呼吸比例不变和自养菌呼吸比例下降，而使得异养菌呼吸比例的上升，呼吸比例发生了变化.

通过呼吸速率比例变化的分析，得出活性污泥系统中氧气消耗的主体是SOUR_H，异养菌消耗的氧气的比例占总呼吸比例的50%以上，异养菌是活性污泥的主体也是降解有机物的主体，同时消耗氧气也较多的. 而自养菌呼吸比例(该污泥的硝化效果较好)占总呼吸比例的30%~40%，而内源呼吸比例只占总呼吸的10%~15%. 当微生物种群发生变化，则会引起呼吸速率的变化，从而引起呼吸速率比例的变化.

图 3

Fig. 3

图 3 比内源呼吸速率及内源呼吸速率比例 Fig. 3 Specific endogenous respiration rate and proportion of endogenous respiration rate time

从内源呼吸过程的SOUR_en的变化趋势来看，只能看出一部分的信息而不能全面反映污泥中各微生物变化特征. 随着微生物的内源呼吸氧化分解等作用，活性的细胞逐渐减少，从而SOUR_en的逐渐下降. 下降过程也会有突然的上升，文献^[6]中给出以SOUR_en的突然上升作为短暂适应期的判据. 同时结合SOUR_en/SOUR_T内源呼吸速率比例的上升还可以判断是否污泥的恶化.

结合表 1和图 3，长期基质缺乏会使SOUR_en/SOUR_T由11%上到15%. 表明当污泥在环境不利的情况，比如毒性物质浓度增大，内源呼吸比例会较高^[31]. 内源呼吸比例较高，表明用于微生物自生基础代谢的溶氧消耗比例较高，因此，在去除相同外部污染物的条件下，所需要的溶解氧较高，从而导致运行成本上升，因此可用内源呼吸比例指示活性污泥的健康状态，就污水处理功效而言，该值越低，活性污泥健康状态越好. 研究发现，实际污水处理厂的内源呼吸比例要比实验室污泥的大，而污泥的活性明显比污水厂高，说明污水厂污泥的活性较差. 因此，可用内源呼吸速率比例来表征污泥的活性.

3 结论

(1)基于本研究的呼吸图谱的方法可以有效判定异养菌和自养菌进入内源呼吸的时间. 通过呼吸图谱中的异养菌和自养菌的呼吸速率曲线分析得出，虽然异养菌微生物和自养菌微生物进入内源呼吸时间相同，但两类菌的抗饥饿能力不同. 异养菌微生物的可快速恢复部分比自养菌高. 当饥饿环境变为基质充足条件，异养菌微生物中可迅速恢复活性部分的比例高，异养菌微生物抗冲击负荷能力高，自养菌微生物则相反. 从内源呼吸的角度证实了，自养菌较为脆弱. 原因是异养菌与自养菌的细胞代谢、 维持过程不同，在异养菌细胞内有提供能量的胞外聚合物EPS等. 因此在污水处理厂实际运行管理中，如果长时间的基质缺乏，极易导致自养菌的大量流失或者污泥菌种比例失调进而引起出水水质不达标.

(2)建立了采用内源呼吸比例定量描述活性污泥的健康状态的指标，即内源呼吸速率比例的增大，反映出污泥活性会变差. 活性污泥的活性变化引起呼吸速率的变化，进而引起了内源呼吸速率比例的变化. 用该方法来分析污水厂运行中污泥生物量的变化情况，比用呼吸计量法测量自养菌和异养菌浓度的方法更加地快捷.