2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一种应用广泛的有机氯除草剂^[1]. 在生产使用过程中，由于2,4-D具有高水溶性与低挥发性，难以被生物降解或直接光解，因而容易随淋溶液迁移进入水体，造成水体污染，目前已有报道检测出水体中2,4-D的存在^[2,3]. 同时，2,4-D是一种内分泌干扰物，生物毒性较强^[4,5]，可在生物体内积累，在较高浓度下具有致畸性、 潜在基因毒性，会引起人体免疫力下降^[6]，损伤人体肾脏、 肝脏、 肌肉和脑组织，降低红细胞携氧能力^[7]，甚至诱发癌症^[8]，严重影响人类健康. 因此水体中2,4-D污染已成为目前亟需解决的水环境问题.

近年发展起来的零价铁还原脱氯技术为处理水中含氯有机物提供了新的解决途径^{[9, 10, 11, 12, 13]}. 双金属体系由于Fe表面覆盖的过渡金属催化层可诱导催化加氢，降低脱氯反应活化能^[14]，大大提高反应效率^[15]，成为该领域的研究热点^[16,17]. 然而，在实际应用中零价铁还原脱氯还存在一些问题，如对某些氯代物特别是氯代芳香族化合物反应活性低，降解不完全； 随着反应进行，铁表面易形成钝化层，导致零价铁反应活性降低^[18]； 纳米铁容易团聚^[19]. 而生物降解技术处理有机污染物廉价易行，发展前景良好^[20]. 但与一般芳香族化合物相比，氯代有机物因存在氯原子容易引起化合物分子结构特性改变，并对微生物有毒害作用，使得其可生化性大大降低，直接降解效果变差. 所以氯取代基的脱除成为其生物降解过程中的关键步骤.

至目前为止，水体中氯代有机物的处理多聚焦于还原脱氯或者生物处理，关于二者的联合作用研究甚少. 然而对于有毒氯代有机物来说，零价铁的催化还原预处理，一方面可以脱去氯代有机物中的有毒氯原子，改变其难生物降解的结构，提高可生化性； 另一方面，零价铁预处理后产生的Fe²⁺等可以为微生物新陈代谢提供一部分营养物质，为好氧处理创造了有利条件. 零价铁还原-生物氧化联合处理技术使得水体中氯代有机物的高效、 便捷、 低成本降解成为可能.

本实验采用Pd/Fe双金属对2,4-D催化还原脱氯后，利用活性污泥对2,4-D脱氯产物进行生物氧化,探讨活性污泥对脱氯产物生物氧化的降解效果，考察影响因素并揭示其规律，获得适宜的还原脱氯-生物氧化反应条件，以期为废水中含氯有机污染物处理技术的实际应用奠定基础.

1 材料与方法 1.1 主要实验试剂

实验采用Sigma-Aldrich公司的氯钯酸钾(K₂PdCl₆，含量99%)，Alfa Aesar公司的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D，C₈H₆Cl₂O₃，纯度98%)、 2-氯苯氧乙酸(2-CPA，C₈H₇ClO₃，纯度>98%)、 4-氯苯氧乙酸(4-CPA，C₈H₇ClO₃，纯度>98%)、 苯氧乙酸(PA，C₈H₈O₃，纯度98%). 高效液相色谱(HPLC)所用甲醇为色谱纯，购自Tedia Company Inc. 还原铁粉(Fe)等试剂均为分析纯. 实验用水均为通氮去离子水. 1.2 实验方法 1.2.1 Pd/Fe双金属的制备

称取一定量还原铁粉，转移至三口烧瓶后用0.1 mol ·L^-1的稀硫酸清洗两遍，以去除铁粉表面氧化物及油污. 经通氮去离子水清洗3遍后，加入适量已知浓度的K₂PdCl₆溶液充分混匀，制备得Pd/Fe双金属. 制备的Pd/Fe双金属无需储存，经通氮去离子水清洗后直接用于脱氯反应. 1.2.2 还原脱氯

实验方法参照文献^[21]. 将一定量2,4-D水溶液转移到装有新制备的Pd/Fe双金属的三口烧瓶中，恒温通氮气，依据选定时间取样. 将所取样品用0.22 μm微孔滤膜过滤后收集至样品瓶备用. 1.2.3 生物氧化

(1)污泥驯化 活性污泥为取自杭州某市政污水处理厂的干污泥. 培养初期，取适量活性污泥于烧杯中，加适量水、 少量淀粉及无机盐营养物质(磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、 氯化铵、 硝酸钠、 氯化镁、 氯化钙、 氯化铁、 氯化锌、 碘化钾、 硼酸、 氯化锰、 钼酸钠)，并利用增氧泵对其进行曝气. 每天静置2 h以上，每隔一天以新鲜培养液替换上清液. 初期培养后，逐步增加目标污染物(2,4-D记为1号、 2号，PA记为3号、 4号，各两个平行样)以替代外加碳源(如淀粉等)，使活性污泥逐步适应污染物环境，直至实现目标污染物完全替换为止.

(2)生物氧化条件实验

将2,4-D还原脱氯后的反应上清液不做任何处理，直接转移至已加入驯化活性污泥、 无机盐营养物质的锥形瓶，并置于恒温水浴摇床中振荡反应. 在基础条件2,4-D还原脱氯产物上清液100 mL，活性污泥量50 mL/200 mL，pH为7，温度30℃条件下，分别调节初始pH、 活性污泥量、 2,4-D脱氯产物即PA的初始浓度和反应温度，考察不同反应条件对活性污泥处理PA效果的影响. 反应结束后，取上清液，经0.22 μm孔径有机膜过滤后滴入样品瓶，进行高效液相色谱分析. 1.3 分析方法 1.3.1 高效液相色谱

2,4-D、 PA、 2-CPA、 4-CPA的浓度均由HPLC(Agilent Technologies 1100 Series)测定. 进样量为5 μL，流动相为甲醇/水＝60/40(体积比)，甲醇用磷酸调节pH至3左右，流速为1.0 mL ·min^-1，柱温箱温度为30℃，UV-Vis检测器波长为210 nm. 1.3.2 PCR扩增

在94℃预变性5 min，35个循环(94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s)，最终72℃延伸7 min，4℃保温10 min条件下，对细菌的16S rDNA V3 可变区进行PCR扩增. PCR扩增产物经1.0% Agarose胶检验后于-20℃保存备用. 1.3.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

将浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶滴加于处理过的耐高温硅化玻璃板，待胶完全凝固后，将胶板放入装有电泳缓冲液的装置中. 混匀6 μL上样缓冲液与30 μL PCR产物，用50 μL微量注射器加入上样孔. 在1×TAE缓冲液(40 mmol ·L^-1 Tris碱，20 mmol ·L^-1 冰醋酸，1 mmol ·L^-1 Na₂EDTA)，160 V电压，60℃恒温条件下，电泳4~5 h. 然后采用GoldviewnaⅡ型染料进行染色，染色液均匀覆盖在整个胶面，避光染色20 min，于凝胶成像系统采集图像进行分析. 2 结果与讨论 2.1 还原脱氯

图 1显示了在2,4-D初始浓度0.27 mmol ·L^-1 (60 mg ·L^-1)，铁浓度10 g ·L^-1，钯化率0.2%，温度30℃，转速200 r ·min^-1，初始pH为3的条件下Pd/Fe颗粒对2,4-D脱氯过程中，体系中各有机物浓度变化情况. 反应初期，2,4-D的浓度快速降低，在20 min内去除率达到89.9%，在180 min内能达到99.9%，溶液中基本检测不到2,4-D. 在整个脱氯过程中，2,4-D 主要先被还原为2-CPA，以及极少量甚至检测不到的4-CPA，然后再继续被还原为PA. 2-CPA作为一个中间产物出现，其浓度一直维持在较低水平，在反应5 min时达最大值0.026 mmol ·L^-1，而PA是能检测到的最终有机产物. 整个反应过程中碳的质量平衡维持在85%~91%，因此大约有9%~15%左右碳的质量损失. 一部分的有机物可能被Pd/Fe颗粒表面因金属氢氧化物沉淀形成的钝化层吸附或者覆盖. 而Pd/Fe颗粒表面的非反应活性位也可能吸附另一部分有机物^{[22, 23, 24, 25]}.

图 1

Fig. 1

图 1 Pd/Fe还原脱氯2,4-D过程 Fig. 1 Dechlorination process of 2,4-D by Pd/Fe

由上述可知，2,4-D还原脱氯产物中其主要成分为PA，2-CPA含量极少甚至检测不到. 故后期生物氧化实验主要考察活性污泥对PA的生物氧化. 本研究中生物降解所用2,4-D还原脱氯反应后液相物质均在铁浓度10 g ·L^-1，钯化率0.2%，温度30℃，转速200 r ·min^-1，初始pH为3条件下连续反应3 h后获得. 2.2 生物氧化 2.2.1 活性污泥驯化

以纯2,4-D，PA分别对同一批污泥做驯化，观察随驯化轮数及污染物投加浓度增加2,4-D和PA去除率变化情况. 从图 2中1号、 2号曲线可以看出，2,4-D直接生物降解的效果并不理想，污泥中2,4-D浓度降低缓慢，活性污泥无法在短时间内有效降解2,4-D. 相反，从每一轮驯化时投加的2,4-D浓度与实际测得的浓度对比发现，2,4-D在污泥中不断累积，驯化至后期，实际测得的浓度远远高于驯化时投加的2,4-D浓度. 图 3中，随着驯化的进行，活性污泥开始适应含有PA的污染环境(3号、 4号曲线)，对PA的去除率逐渐提高，而且进程逐渐加快. 最后能在2~3 d内彻底去除高达50 mg ·L^-1的PA，去除效果较好. 以上实验结果表明，PA的可生化性明显好于2,4-D，PA的直接生物降解比2,4-D更为有效.

图 2

Fig. 2

图 2 2,4-D驯化情况 Fig. 2 Sludge domestication by 2,4-D

图 3

Fig. 3

图 3 PA驯化情况 Fig. 3 Sludge domestication by PA

应用PCR-DGGE图谱分析活性污泥在不同污染物(2,4-D和PA)驯化过程中微生物菌群的多样性及稳定性. 16S rDNA PCR产物的DGGE分离结果见图 4和图 5. 其中泳道1~14分别代表第1、 4、 7、 10、 12、 14、 17、 20、 22、 24、 25、 26、 29、 32 d对2,4-D模拟液或PA反应液进行驯化的污泥样品DGGE图谱.

图 4中，条带a、 b、 c、 d、 e，随着2,4-D模拟液的加入，由于菌群不能适应污染物环境而逐渐消失. 驯化末期出现极少量新增条带，如f.

图 4

Fig. 4

图 4 2,4-D模拟液驯化活性污泥的DGGE图 Fig. 4 DGGE of sludge domestication by 2,4-D

图 5中可以看出，DGGE图谱的泳道包括8条较明显条带，有些条带的亮度随驯化过程的进行有所变化. 在驯化过程中，条带F、 H一直存在，未因驯化而发生显著改变； 原本存在的条带A、 E在泳道中的亮度逐渐减弱，直至最后完全消失； 新出现的条带B、 C在泳道中的亮度先增强后减弱至消失； 而条带D及新出现的G在泳道中的亮度则逐渐增强. 其原因可能是在污泥驯化过程中，菌种A、 E不能适应环境被淘汰，菌种B、 C是过渡菌种，而菌种D、 G在驯化过程中逐渐适应环境并成为了优势菌种. 从条带的数目及亮度还可以看出污泥内微生物种群丰富，菌群结构相对稳定.

图 5

Fig. 5

图 5 PA反应液驯化活性污泥的DGGE图 Fig. 5 DGGE of sludge domestication by PA

另根据DGGE图谱相似性分析，图 4中各泳道相似性大部分维持在60%以上，表明污泥在2,4-D模拟液驯化过程中，微生物群落结构稳定，无显著变化. 而图 5中各泳道的条带相似性较差，多在60%以下，这说明在实际的PA反应液驯化过程中，微生物种群结构发生了较为复杂的变化.

比较图 4和图 5，后者的DGGE图谱中条带的亮度发生了一定的变化，且有更多新条带出现. 其原因可能是2,4-D本身具有较强毒性，对微生物的生长有一定抑制作用，难以驯化出对其具有降解作用的特定菌种. 而经Pd/Fe颗粒还原脱氯后的产物——PA，生物毒性大大降低，对微生物生长的抑制作用减弱，使微生物在含有PA污染物的环境下较容易生存下来. 由此说明，2,4-D脱氯产物PA比2,4-D更容易被生物降解. 2.3 生物氧化处理影响因素研究 2.3.1 初始pH对还原脱氯产物降解效果的影响

由图 6可知，pH对PA的生物氧化有一定影响. 当pH为3时，12 h后PA的浓度由16.96 mg ·L^-1降为10 mg ·L^-1，之后随着反应时间的增加，其浓度变化不大. 当初始pH分别为5、 7和9时，48 h后PA浓度均可降到3 mg ·L^-1，去除率达85%左右. 观察各曲线，可发现PA在偏碱性环境中去除率略高于偏酸性环境. 可能是由于降解PA的微生物适应中性和微碱性环境，过低或过高的pH，都会降低微生物活性，使菌胶团黏性物质解体，活性污泥结构遭到破坏，从而导致处理效果下降. 除此之外，也可能由于在驯化过程中，活性污泥的pH一直保持在中性附近，微生物适应了这种pH环境，从而提高了中性附近的生物降解效果.

图 6

Fig. 6

图 6 初始pH对PA降解效果的影响 Fig. 6 Effects of initial pH on PA biodegradation

由图 7可得，活性污泥对PA的去除率随初始浓度的提高而提高. 当PA初始浓度为5.8 mg ·L^-1时，96 h后其浓度降为2.3 mg ·L^-1，去除率达58.8%. 当初始浓度为8.4和14.6 mg ·L^-1时，96 h后其浓度分别降至2.6 mg ·L^-1和3.4 mg ·L^-1，去除率为69.8%和76.9%. 观察各曲线发现，还原脱氯产物PA经生物降解到3.0 mg ·L^-1时，其降解速率大幅度减慢，而降解到2.5 mg ·L^-1后则很难进一步降解，反应过程基本停滞，和一般的污水生物处理显示相同的规律.

图 7

Fig. 7

图 7 初始PA浓度对其降解效果的影响 Fig. 7 Effects of pollutant initial concentration on PA biodegradation

当污泥量为25 mL时，PA去除缓慢，96 h后PA浓度降低为6.5 mg ·L^-1. 与25 mL污泥量相比，100 mL污泥量的处理效果相对较好. 当污泥量为50 mL和75 mL时，PA的去除速率显著提高，96 h后PA的浓度分别降至3.4 mg ·L^-1和4.2 mg ·L^-1. 通常污泥量越多代表降解目标污染物的有效菌数量越多，所催生出的可降解目标污染物的酶或酶系就越多，目标污染物的去除效果越好. 出现如图 8所示情况，主要原因可能是：25 mL污泥量还不足以有效去除该浓度的PA. 而100 mL污泥量，可能是由于溶解氧不足，好氧微生物得不到充足的氧，活性受到影响，新陈代谢减弱，造成处理效果下降.

图 8

Fig. 8

图 8 污泥量对PA降解效果的影响 Fig. 8 Effects of sludge solution on PA biodegradation

由图 9可看出，在25至35℃范围内，随温度的增加，活性污泥对PA的去除效率先升高后降低. 在反应96 h后，30℃条件下PA浓度降为3.35 mg ·L^-1 去除率为76.9%，而25℃和35℃时 PA浓度分别降为9.88mg ·L^-1和9.58 mg ·L^-1去除率仅为24.9%和34.3%. 温度是生物处理的重要影响因素，不同微生物的适宜生长温度不同. 由图 9可得，降解PA的微生物适宜生长温度为30℃. 在该温度下，微生物生长环境适宜，体内的各种酶活性高，有效促进了目标污染物的降解去除. 当温度超过适宜生长温度升至35℃甚至更高时，微生物的蛋白质迅速变性，酶系统因高温破坏失去活性，PA降解率下降. 而较低的温度会降低微生物代谢活力，使得微生物生长繁殖受到抑制，无法对PA进行有效降解.

图 9

Fig. 9

图 9 温度对PA降解效果的影响 Fig. 9 Effects of temperature on PA biodegradation

综合以上实验结果，对于含难生物降解有机氯化物2,4-D的废水，可在适宜条件下用Pd/Fe双金属进行还原脱氯预处理. 反应180 min，97.0%的2,4-D可被还原为生物毒性较低的PA. 随后将2,4-D还原脱氯产物上清液不做任何处理直接转入生物反应器(还原脱氯后pH为6.8)，采用经驯化的活性污泥对脱氯产物进行价廉易行的生物氧化处理. 在适宜条件下(pH=7、 污泥量50 mL/200 mL、 PA初始浓度14.6 mg ·L^-1，温度 30℃)，96 h后，反应液中84.3%的PA可被去除. 由此可见采用还原脱氯-生物联合降解能够将难处理有机氯化物以较为有效、 廉价的方法彻底降解，为该类污染物的处理提供了一条切实可行的途径.

3 结论

(1)Pd/Fe双金属可有效地还原2,4-D，其脱氯中间产物主要是2-CPA，最终产物为PA.

(2)DGGE研究表明，2,4-D还原脱氯后，其脱氯产物比2,4-D更容易被生物降解. 2,4-D本身具有较强的生物毒性，对微生物的生长有抑制作用，难以驯化出对其有降解作用的特定菌种. 而其脱氯产物——PA，生物毒性显著降低，对微生物的生长抑制作用减弱，使微生物较易在含有PA污染物的环境下生存下来.

(3)影响活性污泥对还原脱氯产物生物氧化的因素有：初始pH值、 活性污泥量、 脱氯产物初始浓度以及温度. 在本实验研究范围内，pH=7、 污泥量50 mL/200 mL、 30℃条件下初始浓度14.6 mg ·L^-1的PA可被有效去除. 96 h后，溶液中PA含量可降到3 mg ·L^-1以下，去除率达84.3%.