环境科学  2014, Vol. 35 Issue (8): 3192-3197   PDF    
引用本文
何强, 吴庆庆, 马红芳, 周真明, 苑宝玲. 藻细胞和高岭土的存在对病毒MS2存活的影响[J]. 环境科学, 2014, 35(8): 3192-3197.
HE Qiang, WU Qing-qing, MA Hong-fang, ZHOU Zhen-ming, YUAN Bao-ling. Effects of Algae and Kaolinite Particles on the Survival of Bacteriophage MS2[J]. Environmental Science, 2014, 35(8): 3192-3197.
藻细胞和高岭土的存在对病毒MS2存活的影响
何强1 , 吴庆庆1,2, 马红芳1, 周真明1, 苑宝玲1     
1. 华侨大学土木工程学院市政与环境工程研究所, 厦门 361021;
2. 福州大学土木工程学院, 福州 350108
收稿日期: 2014-1-10; 修订日期: 2014-03-22.
基金项目： 国家自然科学基金项目（51178117）；厦门市杰出青年科技人才创新计划项目（3502Z20126009）
作者简介：何强（1991~），男，硕士研究生，主要研究方向为水处理技术，E-mail：qianghe1991@163.com
通讯联系人,E-mail:blyuan@hqu.edu.cn
摘要：选用病毒MS2作为水中肠道病毒的指示病毒，高岭土和铜绿微囊藻分别作为无机颗粒物和有机颗粒物，研究颗粒物浓度、 pH值、 不同价态离子浓度、 天然有机物（NOM）等水质条件下，无机（高岭土）、 有机（铜绿微囊藻）颗粒物存在对病毒MS2存活的影响. 结果表明，无机颗粒物高岭土对病毒MS2的存活无明显影响，但当水体钙硬度（钙离子产生的硬度）较大时，病毒MS2的表观存活量增加1个对数；铜绿微囊藻的存在会导致病毒MS2的存活量降低1个对数左右，但当溶液的pH值大于4.0或铜绿微囊藻的浓度小于1.0×106cells·L-1时，藻类对病毒的生存无明显影响；当水体钙硬度较大时，藻反而会增加病毒MS2的存活对数. 因此在高浊水、 高藻水中，水的钙硬度增加会使水体中病毒生存能力变强，进而增加饮用水的安全风险.
关键词： 藻     高岭土     病毒     钙硬度     存活    
Effects of Algae and Kaolinite Particles on the Survival of Bacteriophage MS2
HE Qiang1, WU Qing-qing1,2, MA Hong-fang1, ZHOU Zhen-ming1, YUAN Bao-ling1     
1. Institute of Municipal and Environmental Engineering, College of Civil Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;
2. College of Civil Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China
Abstract: In this study, Bacteriophage MS2, Kaolinite and Microcystis aeruginosa were selected as model materials for human enteric viruses, inorganic and organic particles, respectively. The influence of the inorganic (Kaolinite) or organic (Microcystis aeruginosa) particles on the survival of MS2 at different conditions, such as particles concentration, pH, ion concentration and natural organic matter (NOM) were studied. The results showed that Kaolinite had no effect on the survival of phage MS2 except that apparent survival of MS2 increased 1 logarithm in higher hardness water. Microcystis aeruginosa addition reduced 1 logarithm of MS2 survival. However, when the pH value was greater than 4.0 or the concentration of Microcystis aeruginosa was less than 1.0×106cells·L-1, Microcystis aeruginosa addition had no influence on the survival of MS2. In higher hardness water, Microcystis aeruginosa protected MS2 viruses and then increased the survival of MS2. In drinking water, resource containing higher concentration of particles, the survival ability of virus would be enhanced with the increase of the hardness and then elevated the risks of drinking water safety.
Key words: algae     kaolinite     bacteriophage     Ca2+ hardness     survival    

由水环境污染或水系传播而引起的病毒感染仍是当今世界上危害范围最广的环境问题之一. 联合国环境和发展机构指出，全世界有超过8.8亿人缺少安全的饮用水. 如轮状病毒每年导致全世界1.4亿例腹泻，在发展中国家每年导致87万例死亡[1]. 人类排泄物的排放，再生水的使用以及污水管道和污水处理厂的污水泄漏都会使大量的病毒进入水体环境[2, 3, 4, 5]. 病毒进入水环境后将自行发生稀释、 凝结和沉淀，而吸附凝结和沉淀在悬浮颗粒上的病毒可能受到了保护，从而增加其存活时间[6, 7, 8]，影响后续消毒单元的灭活效果，增加了饮用水的安全风险. 因此研究悬浮颗粒物的种类对病毒在水体中迁移和归趋的影响，具有重要的工程意义.

水中常见颗粒物分为无机颗粒物和有机颗粒物. 高浊水中大量的无机颗粒物对病毒的生存会带来影响[9, 10, 11]. 如Lipson等[11]研究了高岭土和蒙脱石对呼肠孤病毒的吸附和解吸，研究表明病毒的吸附有助于保留感染性. 在加入高岭土和蒙脱土的病毒溶液中分别在18周和22周时还有检出，但是没有加蒙脱土和高岭土的病毒溶液在7.5周后就已经全部失活. 高藻水中大量存在的藻类，作为有机颗粒物也将影响到病毒的生存[12]. 郑耀通[13]研究表明小球藻与光合细菌的联合培养代谢模式能够极大地减少烟草花叶病毒(TMV)在水体中的存活时间，但是在没有异养细菌的小球藻纯培养生存环境中，小球藻就会对TMV起到保护作用，增加它在水体中的存活时间.

但是无机和有机颗粒物的存在对病毒生存的影响，是否还与水体pH、 离子浓度，有机物浓度等水质条件存在密切的关系，还鲜见国内外相关报道. 本文以高岭土模拟高浊水中的无机颗粒物，铜绿微囊藻模拟高藻水中的有机颗粒物，病毒MS2作为指示病毒，研究不同水质条件(不同颗粒物种类、 颗粒物浓度、 pH值、 不同价态离子浓度和天然有机物浓度)下颗粒物存在对病毒MS2生存的影响. 1 材料与方法 1.1 材料

病毒MS2(ATCC 15597-B1)和噬菌体宿主大肠埃希杆菌(ATCC 15597)均购自美国菌种保藏中心. 铜绿微囊藻(FACHB-905)购自中国科学院武汉水生所. 高岭土，腐殖酸(NOM)均购自美国Sigma-Aldrich公司. 铜绿微囊藻培养基采用BG11培养基. 药剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司. 病毒MS2培养基的配方按照美国菌种保藏中心提供的配方，由青岛海博定制.

1.2 方法 1.2.1 病毒MS2扩大培养、 提纯和计数

病毒的扩大培养和提纯方法采用Yuan等[14]使用的方法. 噬菌体计数采用双层平板法[15].

1.2.2 铜绿微囊藻藻液制备

将5 mL铜绿微囊藻母液接入BG11培养基，置于25℃光照培养箱中培养，5～10 d后即可进入对数期. 然后取30 mL离心分离10 min，超纯水洗涤3次后备用.

1.2.3 病毒MS2水力学直径测量

病毒MS2的水力学直径测量使用Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS 90,Malvern)，病毒MS2的浓度分别为1.0×1011 pfu ·mL-1，pH值为3～8，离子浓度分别为0、 10、 50、 100、 150、 200 mmol ·L-1，测试温度为25℃，稳定时间为2 min，重复测量3次.

1.2.4 颗粒物的浓度对病毒MS2生存的影响

向100 mL超纯水中加入不同质量浓度的高岭土(0、 10、 20、 50、 100 mg ·L-1)或铜绿微囊藻(0、 1.0×105、 1.0×106、 1.0×107、 1.0×108、 1.0×109 cells ·L-1)，再加入100 μL 浓度为1.0×1011pfu ·mL-1的病毒MS2溶液，置于25℃转速为200 r ·min-1的振荡培养箱中振荡24 h后取样，双层平板法测定噬菌体含量. 每个浓度做3组平行实验.

1.2.5 不同pH值条件下颗粒物对病毒MS2生存的影响

配制100 mg ·L-1的高岭土或1.0×108cells ·L-1的铜绿微囊藻溶液调节不同pH值(3、 4、 5、 6、 7、 8). 以不含颗粒物作空白，再加入1.0×1011 pfu ·mL-1的病毒MS2溶液100 μL，置于25℃转速为200 r ·min-1的振荡培养箱中振荡24 h后取样，在每个pH值条件下做3组平行实验，双层平板法测定病毒含量.

1.2.6 不同价态离子溶液中颗粒物对病毒MS2生存的影响

向100 mg ·L-1的高岭土或1.0×108 cells ·L-1的铜绿微囊藻溶液中加入不同浓度的NaCl或CaCl2(0、 50、 100、 150、 200 mmol ·L-1). 以不含颗粒物作空白，再加入1.0×1011 pfu ·mL-1的病毒MS2溶液100 μL，置于25℃转速为200 r ·min-1的振荡培养箱中振荡24 h后取样，每个离子浓度做3组平行实验，双层平板法测定病毒含量.

1.2.7 不同有机物浓度下颗粒物对病毒MS2生存的影响

向100 mg ·L-1的高岭土或1.0×108 cells ·L-1的铜绿微囊藻溶液中加入不同浓度的腐殖酸(0、 50、 100、 150、 200 mmol ·L-1). 以不含颗粒物作空白，再加入1.0×1011 pfu ·mL-1的病毒MS2溶液100 μL，置于25℃转速为200 r ·min-1的振荡培养箱中振荡24 h后取样，每个有机物浓度做3组平行实验，双层平板法测定病毒含量. 2 结果与讨论 2.1 颗粒物的浓度对病毒MS2生存的影响

图 1为不同颗粒物浓 度对病毒MS2的存活的影响. 从图 1(a)中可知，随着水中高岭土的浓度的增加，水中病毒MS2的存活量无明显变化，24 h后存活量都保持在7.5个对数左右. 这说明高岭土的存在不影响病毒MS2的存活. 从图 1(b)中可知，随着藻浓度的增加，病毒MS2的存活量逐渐降低，当藻浓度增加到1.0×108 cells ·L-1时，病毒MS2的存活量下降了1.5个对数左右，继续增加藻浓度，病毒MS2的存活量不再下降，趋于稳定. 这说明高浓度藻细胞的存在不利于病毒MS2的生存. 这可能是由于铜绿微囊藻在生长过程中产生了单态氧、 超氧化物、 羟基自由基、 过氧化氢等活性氧[16, 17, 18, 19]，活性氧可以使病毒的蛋白质衣壳的关键部位发生变性或者变形从而导致衣壳失去对遗传物质RNA的保护，RNA可能在病毒内部或者外部解离，病毒也会因此而失去活性[19].

图 1 不同颗粒物浓度下病毒MS2的存活 Fig. 1 Survival of MS2 at different concentrations of particles

为了验证这一推断，进一步研究了颗粒物存在时光照对病毒存活的影响，如图 2所示. 从中可知，在纯水和高岭土溶液中，有无光照对病毒的存活影响很小. 而当铜绿微囊藻存在时，光照会加速病毒MS2的失活，24 h后可以衰减至5.5个对数. 同样，即使在无光照的情况下，铜绿微囊藻的存在也会加速病毒MS2的失活，24 h后病毒MS2的存活量衰减到7.0个对数. 这就间接证明了藻类生长过程中产生了不利于病毒生存的活性物质. Kohn等[21]在研究太阳光对病毒MS2生存的影响时也得到了类似的结果.

图 2 光照对病毒MS2生存影响 Fig. 2 Light effect on virus MS2 survive
2.2 不同pH值条件下颗粒物对病毒MS2生存的影响

图 3为不 同pH值条件下两种颗粒物存在对病毒MS2存活的影响. 从中可知，在纯水溶液中，随着溶液pH的增大，溶液中病毒MS2的表观存活量从5.0个对数左右一直增加到7.5个对数. 这是因为在溶液中含有大量的H+，可以使病毒MS2的蛋白质衣壳直接变性，导致病毒MS2失活. 但是在pH=3.0时，两种颗粒物存在时病毒的存活量比纯水中高. 这主要是当pH接近病毒MS2的等电位点(3.7)时，病毒MS2会发生团聚，图 4为不同pH条件下病毒MS2的水力学直径分布，从中可知，病毒MS2团聚现象随着pH值的增大而减弱，且在pH=3.0时团聚最明显.

图 3 不同pH值下病毒MS2的生存量 Fig. 3 The pH effect on the survival of MS2

无机颗粒物-高岭土存在的溶液中，病毒MS2的存活量随着pH值的增大而增大并最终趋于稳定. 只有当pH=3.0时，病毒MS2的存活量略高于不含颗粒物的溶液，其它pH值条件下，高岭土的存在对病毒MS2的存活量无明显影响. 这主要是因为在低pH条件下，病毒MS2大量团聚[22]，而加入高岭土之后，由于颗粒物高岭土对病毒MS2的吸附[23]，起到分散病毒的作用，从而减少了团聚，最终导致病毒的表观存活量增加.

有机颗粒物-藻存在的溶液中，病毒MS2的含量随着pH值的增加而不断增加并最终趋于稳定. 当pH值从3.0增加到4.0时，病毒MS2的存活量从5.5个对数增加到6.5个对数左右，比纯水中病毒MS2的存活量略高. 继续增加pH到8.0，溶液中病毒的存活量仍保持在6.5个对数左右，但是低于相同pH条件下，纯水和添加高岭土的溶液中病毒MS2存活量. 这主要是因为藻类的生命活动产生过氧化氢等活性氧，不利于病毒的生存.

图 4 病毒MS2的水力学直径分布 Fig. 4 Hydrodynamic diameter of MS2 in water
2.3 不同价态离子溶液中颗粒物对病毒MS2生存的影响

图 5(a)是一价Na+浓度对病毒MS2存活的影响. 从中可知，一价Na+浓度对纯水和高岭土溶液中病毒MS2的存活没有影响，一直保持在7.5个对数左右. 有机颗粒物-藻存在的溶液中，随着一价Na+的加入，削弱了藻对病毒MS2存活的不利影响，使得病毒MS2的存活量从6.3个对数左右增加到7.3个对数，但是不随一价Na+浓度的增加而变化.

图 5(b)是二价Ca2+浓度对病毒MS2存活的影响. 从中可知，随着二价Ca2+浓度增大，超纯水溶液中MS2表观存活量从7.5个对数迅速减少到6.0个对数左右，并趋于稳定. 高岭土溶液中病毒MS2的存活量有略微的下降，从7.5个对数减少到7.3个对数左右. 铜绿微囊藻溶液中，随着溶液中二价Ca2+ 浓度的增大，病毒MS2的存活量增加了1个对数，可见在铜绿微囊藻溶液中增加二价Ca2+浓度有利于病毒MS2的生存.

图 5 不同离子浓度下病毒MS2的生存量 Fig. 5 Log survival amount of MS2 at different ionic strengths

这是因为盐离子浓度带来的渗透压可以破坏病毒衣壳的完整性，当病毒所处的环境中离子浓度改变时，会导致蛋白质变性进而使其失活. 由于实验的盐浓度与培养基中离子浓度接近(0.8%). 所以在纯水溶液中，一价Na+浓度增大对于病毒MS2的存活量无明显影响. 但当溶液中有二价Ca2+时，病毒MS2表面上的谷氨酸和天冬氨酸的羧基可以和Ca2+形成内层配位而络合[24,25]，因此钙离子的存在可以促进病毒MS2自身的聚集，这一点也可以从其水力学半径上得到证实(图 6). 由图 6知，对于添加NaCl而言，病毒MS2的水力学直径分布不会随着溶液中钠离子浓度的增大而发生明显变化; 而对于添加CaCl2而言，随着钙离子浓度的增大，病毒MS2的水力学直径分布逐渐向右移动，分布在100~1000 nm间的比例逐渐增大，这说明病毒MS2发生团聚的数目不断增加. 由于病毒自身的团聚就会使病毒的表观存活量降低.

图 6 病毒MS2在不同离子浓度的水中水力学直径分布 Fig. 6 Hydrodynamic diameter of MS2 at different ionic strengths

同时Kohn等[21]认为离子强度还可能影响增敏剂产生活性氧的效率和病毒对于光灭活作用的敏感性. 所以增加离子强度可以减小铜绿微囊藻对病毒MS2的不利影响，同时增加离子强度，病毒MS2也可能与颗粒物发生吸附[26,27]. 当病毒MS2吸附颗粒物上之后，颗粒物将会对病毒的生存起到一定的保护作用，从而导致藻类颗粒物的存在有利于病毒MS2的存活.

图 7 不同NOM下病毒MS2的生存量 Fig. 7 Log survival of MS2 at different concentrations of NOM
2.4 不同腐殖酸浓度下颗粒物对病毒MS2生存的影响

图 7是不同腐殖酸浓度下颗粒物对病毒MS2生存的影响. 从中可知，在超纯水和含有高岭土的溶液中，病毒MS2的存活量并不随有机物浓度的变化而变化，均保持在7.6个对数左右. 而在铜绿微囊藻或者铜绿微囊藻和高岭土同时存在的条件下，低浓度的NOM就会使溶液中病毒MS2的存活量都比超纯水中的低1个对数. 而随着溶液中NOM浓度的增大，两者溶液中病毒MS2的含量有增加但还是略低于超纯水中的病毒MS2的含量，这说明在高浓度的NOM溶液中，铜绿微囊藻或铜绿微囊藻和高岭土同时存在的两种溶液对病毒MS2生存影响较小. 这可能是因为加入NOM之后，可以消耗铜绿微囊藻产生的活性氧，更有利于病毒MS2的存活.

3 结论

(1)无机颗粒物高岭土浓度、 溶液pH值、 一价Na+浓度、 溶解性有机物浓度等单一水质条件的改变，都不会对病毒MS2的生存产生影响.

(2)在24 h内,当pH在5.0～8.0时,相对超纯水而言，1.0×108 cells ·L-1铜绿微囊藻的存在，不利于病毒MS2的生存，会使其表观存活量降低1个对数左右.

(3)高浊水中，pH值、 一价Na+、 溶解性有机物等水质条件的改变对病毒MS2的生存无影响; 但当二价Ca2+存在时，高岭土的存在会使病毒MS2的表观存活量增加1.5个对数.

(4)高藻水中，一价Na+和溶解性有机物的存在，会削弱藻对病毒存活的不利影响; 但当二价Ca2+存在时，藻会增加病毒MS2的存活对数.

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