己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成雌激素，极微量就能对生物体造成严重伤害^[1]. 在人体医学上，DES曾被用于预防妊娠妇女自发性流产，但研究表明其能增高女性后代患阴道腺癌的几率^[2]; 在兽医上，DES也被用于诱导动物发情、 促进生长，但长期应用会损伤动物的肝脏^[3]. 在环境中DES不易于降解，并在水体和畜禽粪便等固体废物中富集，造成环境雌激素污染^[4]. 人类和动物通过消化道、 呼吸道、 皮肤接触等多种途径暴露雌激素，而其能在动物和人体脂肪组织中长期滞留，当体内蓄积的雌激素达到一定浓度时，其就会从脂肪组织中释放出来进入血液，对生物体造成不良影响^[5]. 近年来，如何去除水体和固体废物中DES备受关注.

光化学降解法是目前去除雌激素污染较有效的一种方法^[6]，但有关DES光降解的研究仍很少，仅Zhou等^[7]报道了DES在Fe³⁺-草酸体系中的降解情况. 近年来，利用微生物的降解作用来去除环境中雌激素的研究很受重视^{[8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]}. 筛选具有高效降解DES的功能微生物有望用于实现环境中DES的有效去除，但迄今国内外关于降解DES的功能菌株及其降解特性的报道甚少，仅Zhang等^[19]筛选到1株假单胞菌J51具有DES降解功能.

本研究从某污水处理站活性污泥中驯化、 分离得到1株能够以DES为唯一碳源和能源的沙雷氏菌菌株S，并研究该细菌降解DES的特性，以期为利用功能细菌降解环境中雌激素提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 实验材料

用于DES降解菌富集分离的活性污泥采自南京某污水处理站. DES购自上海阿拉丁试剂有限公司，纯度≥98%. 1.2 培养基组成

LB培养基(g ·L^-1)：蛋白胨 10.00，酵母粉 5.00，NaCl 10.00，自然pH值.

无机盐培养基(MS)(g ·L^-1)：(NH₄)₂SO₄ 1.50，K₂HPO₄ ·3H₂ O 1.91，KH₂PO₄ 0.50，NaCl 0.50，MgSO₄ ·7H₂ O 0.20，微量元素溶液2 mL，自然pH值. 其中微量元素溶液成分(g ·L^-1)：CoCl₂ ·6H₂ O 0.1，MnCl₂ ·4H₂ O 0.425，ZnCl₂ 0.05，NiCl₂ ·6H₂ O 0.01，CuSO₄ ·5H₂ O 0.015，Na₂MoO₄ ·2H₂ O 0.01，Na₂SeO₄ ·2H₂ O 0.01.

DES降解培养基：10 g ·L^-1的DES甲醇溶液过0.22 μm滤膜除菌，取一定量置于灭菌的三角瓶中，待甲醇挥发完全后加入灭菌的无机盐培养液，使DES的最终浓度达到实验设计浓度.

固体培养基加入2%的琼脂. 1.3 细菌分离筛选

将采集的污泥样本按10%(质量分数)的接种量加入到DES浓度为100 mg ·L^-1的降解培养基中，于30℃、 150 r ·min^-1振荡培养7 d后进行第一次转接，通过4次转接后收集第4次的富集液.

富集培养液经高效液相色谱测定有降解效果后，将菌液稀释并涂布于MS培养基平板表面(培养基表面预先用100 mg ·L^-1DES甲醇溶液涂布)，30℃恒温培养，待平板上长出菌落，用划线分离等分离方法，经过分离、 筛选、 纯化的反复过程，直至得到纯化的单一菌落. 再进行单菌的降解效果验证，对有明显降解效果的菌株进行鉴定、 并研究其对DES的降解特性. 1.4 菌株鉴定

对降解效率高的菌株进行形态观察、 生理生化试验、 16S rDNA序列同源性比对分析等，确定其分类学地位. 菌株的形态及生理生化特性测定参照文献^[20]进行. 16S rDNA克隆所用正向引物为16S-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 反向引物为16S-1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(上海英骏生物技术有限公司合成). PCR扩增产物经电泳检测后，送南京金斯瑞测序有限公司进行纯化测序. 测序结果使用GenBank进行Blast比对分析、 整理后，采用Clustalx 1.83和MEGA 4.0软件构建系统发育树. 1.5 DES降解实验

(1)DES降解效率的测定

在DES含量为50 mg ·L^-1的DES降解培养基中，按5%(体积分数)的接种量加入菌悬液(D600值为1.0)，30℃、 150 r ·min^-1振荡培养7 d，每天定时取样，测定培养基中残留DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长.

DES浓度测定采用定时整瓶提取培养基的方法^[21]. 向培养基中加入等体积色谱甲醇，超声混匀，高速离心后过0.22 μm滤膜，用高效液相色谱法测定DES浓度. 高效液相色谱(岛津LC-20AT)设定参数为：Inertsil ODS-SP-C₁₈反相色谱柱(150 mm× 4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈 ∶水=80 ∶20，流速1.000 mL ·min^-1，柱温40℃，紫外检测波长230 nm^[22].

(2)环境条件对DES降解效率的影响

培养条件与(1)相同，只改变相应环境条件进行DES降解实验.

温度的影响：分别在20、 25、 30、 37、 42℃条件下，摇床培养7 d后测定DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长.

初始pH值的影响：DES降解培养基初始pH值分别调至5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0，摇床培养7 d后测定DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长.

初始底物浓度的影响：DES浓度分别为20、 40、 60、 80、 100 mg ·L^-1，摇床培养7 d后测定DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长.

菌株接种量的影响：在DES降解培养基中分别按0%、 2%、 5%、 10%、 15%(体积比)的接种量接种，摇床培养7 d后测定DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长.

盐浓度的影响^[23]：在DES降解培养基中另添加NaCl，使盐添加的浓度分别为0、 5、 10、 15、 20 g ·L^-1. 摇床培养7 d后测定DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长.

通气量的影响^[24]：通过改变三角瓶中培养基的装液量来初步研究氧气供给对DES降解的影响. 100 mL三角瓶中DES降解培养基的装液量分别为10、 20、 30、 40、 50 mL，摇床培养7 d后，测定DES浓度，并对细菌进行平板计数测定其生长. 1.6 数据分析

实验所得数据用Microsoft office Excel 2003软件进行处理. DES残留率计算公式如下：

X= cX /c_CK ×100%

式中，X为残留率(%)，cX为接菌处理中DES浓度，cCK为未接菌处理中DES浓度.

2 结果与讨论 2.1 菌株鉴定 2.1.1 菌落形态及其生理生化特性

菌株S从南京某污水处理站活性污泥中分离获得. 其在含DES的MS固体培养基上生长较好，说明其对DES具有较强的抗性，可利用DES作为唯一碳源进行生长. 菌落为圆形，边缘整齐，呈红色，有光泽，菌体易挑起. 菌体呈短杆状，大小为(7.0~8.0) μm× (12.0~13.0) μm，无鞭毛，不运动. 试验确定菌株为革兰氏阴性细菌，图 1为菌株透射电镜照片，其生理生化特性见表 1.

图 1

Fig. 1

图 1 菌株S的透射电镜照片 Fig. 1 Transmission micrograph of strain S ×8000 Zoom-1 HC-1 80 kV

表 1(Table 1)

表 1 菌株S的生理生化特性 1) Table 1 Physiological characteristics of strain S 测定项目 结果 测定项目 结果 革兰氏染色 - M.R试验 + 葡萄糖发酵试验 + V.P试验 + 淀粉水解 + 吲哚试验 - 硝酸盐反应 + 明胶水解 + 苯丙氨酸脱氨酶 - 产H2S试验 - 柠檬酸盐利用 + 过氧化氢酶试验 + 1)+表示发酵糖类只产酸不产气及其它试验中呈阳性反应，-为阴性反应

表 1 菌株S的生理生化特性 1) Table 1 Physiological characteristics of strain S

16S rDNA序列测序结果表明，菌株S与Serratia marcescens的序列相似性达到99%，结合生理生化、 细菌形态，可确定菌株S为沙雷氏菌属(Serratia sp.). 菌株S的系统发育树见图 2.

图 2

Fig. 2

图 2 基于16S rDNA基因序列同源性的菌株S系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain S based on the 16S rDNA gene homology

菌株S以DES为唯一碳源的生长和DES降解曲线见图 3. 从中可知，在菌株培养的7 d内，随着培养天数的增加，DES的降解率逐渐增加. 培养至5 d时，菌体数量达到稳定值为7.77×10⁸ cfu ·mL^-1，之后菌体数量呈较稳定的趋势. 在前4 d内DES的降解速率较缓慢，培养4 d后，DES降解速率明显加快. 究其原因，可能是由于前期菌株生长不适应，导致降解较慢; 后期菌株快速生长直到稳定期，表现出对DES良好的降解效果. 这与Ren等^[25]筛选到的鞘氨醇杆菌属细菌JCR5生长和降解雌激素17α-乙炔基雌二醇的规律类似. 培养7 d后，空白对照组中DES的回收率为99.8%，菌株S处理组的降解率则为68.3%，而Zhang等^[19]筛选的菌株J51不能以DES为唯一碳源进行生长，对DES的降解率约为60%. 菌株S与J51相比较，表明菌株S能以DES为唯一碳源进行生长且对DES具有显著的降解能力.

图 3

Fig. 3

图 3 以DES为唯一碳源时菌株S生长及其对DES降解曲线 Fig. 3 Utilization of DES as the sole carbon source for growth and DES-degradation by strain S

由图 4可见，温度对菌株S生长和其对DES降解效率的影响趋势一致. 30℃时，细菌数量最多，为6.87×10⁸ cfu ·mL^-1，且DES降解率也较高，达67.6%. 30℃以下时，随着温度的上升，菌株生长增加，DES降解率升高. 30℃以上时，随着温度上升，菌株生长减少，DES降解率降低. 这很可能是由于温度对微生物的酶的合成与活性产生了一定的影响^[26]. 通常，在15~30℃之间，随着温度的升高，菌株中的酶活性增强，生化反应速度会加快，菌株生长及降解速率提高; 若温度继续升高，菌株中一些温度敏感物质会受到不可逆的破坏，进而其生物活性受到影响^[27]. 因此，选择30℃作为菌株S生长和降解DES的最适温度.

图 4

Fig. 4

图 4 温度对菌株S生长和DES降解的影响 Fig. 4 Effects of temperature on the growth and DES degradation of strain S

从图 5可以看出，随着pH的升高，DES残留率逐渐下降，而菌株S在pH为7.0左右时生长最好，为6.70×10⁸ cfu ·mL^-1. pH偏高或偏低都对其生长存在抑制作用. 对照组中DES的回收率随着pH升高也逐渐下降，结合DES的结构式可知，因其含有两个酚羟基，在不同的酸碱环境下DES会有不同的存在形式^[28]. 在碱性环境下，DES可能会发生如下反应：

pH为9.0时的残留率最低可能是化学和生物共同作用的结果. 故选择菌株S生长最好的中性环境pH 7.0作为其最适pH值，同时也能达到较好的降解效果.

图 5

Fig. 5

图 5 初始pH对菌株S生长和DES降解的影响 Fig. 5 Effects of initial pHs on the growth and DES degradation of strain S

由图 6可知，供试底物浓度(20~100 mg ·L^-1)范围内，DES浓度＞60 mg ·L^-1时，其对菌株S的生长情况表现出一定程度的抑制作用，说明高浓度的底物会对菌株产生一定的毒害作用^[29]，抑制了菌株S的生长. 底物浓度较低时(20~60 mg ·L^-1)，DES的降解效率均为63.0%左右. 故选择40~60 mg ·L^-1为菌株S生长和降解DES的最适底物浓度.

图 6

Fig. 6

图 6 初始底物浓度对菌株S生长和DES降解的影响 Fig. 6 Effects of initial concentrations on the growth and DES degradation of strain S

如图 7所示，当接种量较低时(2%~10%)，随着接种量的增加，细菌数量增大，且DES的降解率也随之升高; 而当接种量＞10%时，细菌生长减少，降解效率反而下降. 这可能是因为接种量少时，DES与菌体的接触不够充分，菌株未能充分发挥其降解作用; 而接种量过多则会导致菌株营养供应不足，使之生物量减少，从而导致降解率下降^[30]. 故选择接种量为5%即可避免投菌量过多造成浪费、 也可有较好的DES降解效果.

图 7

Fig. 7

图 7 接种量对菌株S生长和DES降解的影响 Fig. 7 Effects of inoculation quantity on the growth and DES degradation of strain S

由图 8可知，当添加的NaCl浓度为0 g ·L^-1时，菌株S生长最好，DES的降解效率最高、 为66.0%. 随着盐浓度升高，菌株S生长和其对DES降解能力都有所下降. 当盐添加浓度为20 g ·L^-1时，菌株S对DES的降解率仅为16.0%. 研究表明，低浓度的盐对微生物生长和DES降解具有促进的作用，但当盐浓度过高时就会引起微生物吸收水分困难，从而抑制其生长和对DES的降解^[31]. 了解菌株S的耐盐性对于菌株的实际应用有指导意义.

图 8

Fig. 8

图 8 盐含量对菌株S生长和DES降解的影响 Fig. 8 Effects of salinity on the growth and DES degradation of strain S

由图 9可见，各处理组随着三角瓶中培养基体积的增加，DES降解率降低. 当100 mL的三角锥瓶中培养基体积为10 mL时，菌株S对DES的降解效率最高，为70.3%; 当100 mL的三角锥瓶中培养基体积为50 mL时，菌株S对DES的降解效率降至最低值、 为41.9%. 随着装液量的增加，空气中的氧气向培养基扩散速率下降，故推测菌株S为好氧菌，当氧气供给不能满足菌株S生长需求时，微生物生长受到抑制，菌株S对DES的降解效率有所下降^[32]. 因此，菌株S为好氧菌，培养过程中通气量越高菌株生长越好.

图 9

Fig. 9

图 9 通气量对菌株S生长和DES降解的影响 Fig. 9 Effects of aeration conditions on the growth and DES degradation of strain S

(1)从南京某污水处理站活性污泥中分离获得1株能以DES为唯一碳源和能源生长的沙雷氏菌属(Serratia sp.)菌株S，其在实验室培养条件下能显著降解DES，7d的DES降解率为68.3%.

(2)对菌株降解特性研究结果表明，菌株S为好氧菌，具有较好的环境适应能力，适宜菌株生长和降解DES的环境条件为：30℃，底物浓度为40~60 mg ·L^-1，pH为7.0，接种量为5%，盐添加量0 g ·L^-1，装液量10 mL(100 mL三角瓶).