多氯联苯(PCBs)是首批被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》的12种持久性有机污染物之一. 虽然PCBs的生产和使用已于1979年被禁止，但是由于其半衰期在40年左右，具有显著环境持久性，并且PCBs的半挥发性也使其随大气干湿沉降在世界范围内迁移并最终沉积到地表. 因此，在全球污染性和非污染性土壤中普遍检出PCBs的存在^[1]. 研究者对我国浙南台州PCBs污染区水稻土中的检测发现，水稻土中PCBs总量为260~930 ng ·g^-1[2]，长江三角洲苏南地区水稻田土中PCBs含量达1636.8 ng ·g^-1[3]，贵州红枫湖周边水稻土中的PCBs总量为8.9~55.9 ng ·g^-1，以PCB28和PCB52为代表的低氯代PCBs占总量的89%^[4]. PCBs具有明显的“三致”效应^[5]和较强的脂溶性，能够沿着食物链在生物体中富集积累，对生物体构成危害. 环境中残留PCBs对其污染区域的人群健康存在严重的潜在风险. 因此，PCBs污染环境的修复问题已经成为国内外研究的热点之一.

目前，PCBs污染修复的主要方法有物理化学方法^[6]和生物修复方法^[7]. 其中，生物修复方法具有效果持久、 成本低、 不会造成二次污染等优势，已成为PCBs污染修复的主流方法和发展趋势. 1973年Ahmed等^[8]首次报道两株无色杆菌Achvornobacter能够降解PCBs，随后不断有PCBs降解功能细菌和真菌等见诸报道^{[9, 10, 11, 12]}. 在此基础上，研究者进一步探索降解功能微生物高效降解PCBs等氯代芳香污染物的方法^[13]. 其中，有较多研究报道了添加电子供体能够有效促进降解包括PCBs在内的有机氯代污染物^{[14, 15, 16]}. Fava等^[17]发现以碳酸氢钠和硫化钠作为电子供体，能够有效促进威尼斯湖沉积物中的微生物对商业PCBs混标Aroclor 1242和1254的降解.

维生素B₁₂属于B族维生素，是一类含钴化合物^[18]. Croft等^[19]对326种藻类的研究发现外加维生素B₁₂对171种藻的生长和代谢有促进作用. 另一方面，Assaf-Anid等^[20]报道维生素B₁₂能够促进PCBs同系物及六氯苯的生物脱氯作用. 由此，本研究探讨维生素B12能否促进脱氯功能藻种降解PCBs. 前期研究发现，分离自PCBs污染水稻土的脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2能够有效降解PCBs，其对PCB28的7 d降解效率为64.7%. 本研究以环境中典型的PCB28为目标污染物，通过向无氯培养体系添加外源物质维生素B₁₂，研究维生素B₁₂对脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28的降解影响和降解过程的基因表达，以期为开发脱氯功能蓝藻高效降解PCBs的新技术和探明功能藻种降解PCBs的分子机制提供重要科学依据. 1 材料与方法 1.1 供试蓝藻

前期研究中，从浙南PCBs污染水稻土中分离筛选获得1株念珠藻Nostoc PD-2，该藻种可脱氯降解PCBs. 对传统的BG11培养基配方^[21]进行修正，采用无氯BG11培养基对藻种Nostoc PD-2进行培养，BG11无氯培养基组成见表 1. 念珠藻PD-2的常规培养条件为：温度 (25±2)℃，光照度998 lx，光暗比为12 h ∶12 h，置于光照培养箱中培养.

表 1(Table 1)

表 1 BG11无氯培养基组成成分 Table 1 Compositions of BG11 chlorine-free medium 组成物质 浓度/g·L-1 组成物质 浓度/g·L-1 MgSO4·7H2O 0.075 NaNO3 1.5 Citric acid 0.006 Ferric ammonia citrate 0.006 Na-EDTA 0.001 Na2CO3 0.02 K2HPO4·3H2O 0.04

表 1 BG11无氯培养基组成成分 Table 1 Compositions of BG11 chlorine-free medium

2,4,4′-trichlorobiphenyl(PCB28)购自百灵威公司，为色谱纯; TRIzol Reagent和RNase-Free DNase I(Qiagen)、 1st-Strand cDNA Synthesis Kit，Power SYBR Master Mix(Invitrogen)均购自杭州浩基公司; 维生素B₁₂、 高氯酸、 氯化钾、 无水乙醇、 硫酸铁铵等常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯. 1.3 引物

根据GenBank登录序列，用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件设计定量PCR的引物，预期扩增长度和溶解温度，见表 2. 引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成.

表 2(Table 2)

表 2 本研究中RT-PCR引物序列和条件 Table 2 Real-time PCR primers and conditions in this study 基因名称 基因序列号 引物序列(5′3′) 扩增长度/bp 溶解温度/℃ Ana dioxygenase gene1) — GCCCCAAATCAGAAACTACCA CCATCACCGGGAAATAACCAA 89 63 Ana iron-sulfurS gene NC_007413 TTAAATGCCCTTGCCACGGTTCTC AGCGTGACTCAAAGCCAGAGACTT 89 62 Ana 16S(内参) EU599109 GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA CGTCCCTCAGTGTCAGTTGC 84 63 1)双加氧酶基因的引物根据文献[22]进行设计

表 2 本研究中RT-PCR引物序列和条件 Table 2 Real-time PCR primers and conditions in this study

选用指数生长期的脱氯功能藻种(680 nm波长下藻液吸光度为0.38)，吸取20 mL蓝藻无氯培养物至50 mL洁净的锥形瓶中. 向锥形瓶中加入100 mg ·L^-1的PCB28-甲醇工作液400 μL，使降解反应体系中的PCB28终浓度为2 mg ·L^-1. 设置不添加PCB28的空白对照组. 向上述空白对照组外的实验组中添加VB₁₂，调整反应体系中的VB₁₂终浓度分别至10、 100和1000 μg ·L^-1，设置不添加VB₁₂的实验组，并对不同情形均设置3个平行样. 置于25℃，998 lx，光暗比12 h ∶12 h的光照培养箱中静置培养7 d，待测. 1.4.2 维生素B₁₂影响功能藻种降解PCB28动力学过程的暴露方法

选用指数生长期的脱氯功能藻种(680nm波长下藻液吸光度为0.38)，吸取20 mL蓝藻无氯培养物至50 mL洁净的锥形瓶中. 向锥形瓶中加入100 mg ·L^-1的PCB28-甲醇工作液400 μL，使降解反应体系中的PCB28终浓度为2 mg ·L^-1. 设置不添加PCB28的空白对照组. 向上述空白对照组外的实验组中添加VB₁₂，调整反应体系中的VB₁₂终浓度分别至10 μg ·L^-1和100 μg ·L^-1. 分别于0.5、 1、 1.5、 3、 4.5、 6 d进行取样检测. 每个VB₁₂浓度下的每个取样点均设置3个平行样. 降解反应体系置于25℃，998 lx，光暗比12 h ∶12 h的光照培养箱中静置培养. 1.4.3 脱氯效果的分析方法

取5 mL上清液测定氯离子含量. 吸取上清液补充去离子水至10 mL，再依次加入2 mL的硫酸铁铵溶液(60 g ·L^-1)、 1 mL的硫氰酸汞-乙醇溶液(4.0 g ·L^-1)，混匀，室温下显色20 min后于波长460 nm处测量吸光度. 将测定的吸光度值代入氯化物标准曲线，可算得降解反应体系中的氯离子含量. 氯离子含量与PCB28质量的换算公式如式(1)所示.

m_(PCB28)= 257.5m_(Cl)/106.5 (1)

式中，m(PCB28)为脱氯功能藻种所降解的PCB28的质量(μg); m(Cl)为PCB28分子脱下的氯离子的质量(μg); 106.5为一个PCB28分子中氯的相对原子量; 257.5为一个PCB28分子的相对分子质量. 脱氯功能念珠藻Nostoc PD-2降解PCB28的过程用一级反应动力学方程描述，半衰期计算公式如下：

c_t=c₀e^-kt (2)

t_1/2= ln2/k (3)

式中，c_t为t时刻培养基中多氯联苯的残留浓度(mg ·L^-1); c0为多氯联苯的初始浓度(mg ·L^-1); k为降解速率常数(d^-1); t为降解时间(d); t1/2为多氯联苯降解50%所需要的时间(d). 1.4.4 维生素B₁₂对PCB28降解过程基因表达影响的分析方法

采用TRIzol法抽提10 μg ·L^-1和100 μg ·L^-1的VB₁₂添加后PCB28暴露不同天数后的藻种PD-2^[19]细胞中的总RNA. 用液氮充分研磨藻样，取50~80 mg粉末加入1 mL TRIzol，剧烈振荡，然后加入0.2 mL 氯仿; 盖上离心管盖子，剧烈地振荡15 s，室温放置5 min. 室温下，12000 r ·min^-1离心10 min; 转移不多于80.0% 上层水相至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，冰上放置10 min，4℃，12000 r ·min^-1 离心15 min，弃去上清; 加入1 mL预冷的75%乙醇，上下混匀，4℃，12000 r ·min^-1 离心5 min，弃去上清，空气干燥; 加入30~50 μL RNase-Free Water，充分溶解后，加入DNase I进行消化，去除基因组DNA污染，分光光度计测定含量和纯度. 按照一步法cDNA合成试剂盒操作步骤合成cDNA. 取逆转录反应产物1 μL作为模板，扩增目的基因片段和内参16S rRNA. PCR反应条件为：95℃预变性5 min; 95℃变性10 s，40个循环; 62℃退火25 s. 扩增产物在1% (质量浓度)琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中分析.每个样品重复3次，各个基因的相对表达水平计算公式如下式所示：

基因相对表达量=2^{(C_t内参基因-C_t目的基因) (4)}

式中，C内参基因_t为内参基因的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数; C目的基因_t为目的基因的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数. 1.5 数据分析

采用OriginPro 8.0 分析软件进行统计. 组间差异用One-way ANOVA分析，P<0.05被认为有显著性差异，P<0.01被认为有极显著性差异. 相关性用SPSS 19.0分析，R>0.8被认为是相关性显著，R<0.8则被认为相关性不显著.

2 结果与分析 2.1 不同浓度维生素B₁₂对Nostoc PD-2降解PCB28效率的影响

图 1表示在培养基中添加维生素B₁₂后藻种Nostoc PD-2对PCB28的7 d降解效应. 从中可知，与未添加VB₁₂组相比，加入维生素B₁₂后PCBs的脱氯百分比明显增加. 随着维生素B₁₂浓度的增加，PCB28的降解百分比由64.7%增大到79.6%.

图 1

Fig. 1

图 1 维生素B12对脱氯功能藻种Nostoc PD-2降解PCB28的影响 Fig. 1 Effects of vitamin B12 on PCB28 degradation by dechlorination functional Nostoc PD-2

图 2显示了脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28降解动力学过程的影响. 从中可知，添加浓度为100 μg ·L^-1的维生素B₁₂明显比所加浓度为10 μg ·L^-1 的降解效果好，且随着暴露时间的增加，PCB28的降解效率均显著增加，7 d后PCB28的降解百分比分别为66.8%、 75.3%.

图 2

Fig. 2

图 2 维生素B12对PCB28降解动力学过程的影响 Fig. 2 Effects of vitamin B12 on PCB28-degradation kinetics

不同浓度维生素B₁₂存在条件下脱氯功能藻种Nostoc PD-2降解PCB28反应过程可用一级反应动力学方程描述. 对于浓度分别为10 μg ·L^-1和100 μg ·L^-1的维生素B₁₂的两个降解组，其降解反应动力学方程分别为：c=1.8795×e^-0.t (R2=0.9605)和 c=1.7457×e^-0.2254t (R2=0.9148). 根据两者的降解动力学曲线计算可得，维生素B₁₂浓度为10 μg ·L^-1 和100 μg ·L^-1 条件下念珠藻Nostoc PD-2对PCB28的降解半衰期分别为5.53 d和3.08 d. 2.3 维生素B₁₂对细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因表达的影响

图 3显示了脱氯功能藻种Nostoc PD-2细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因相对表达量随时间的变化情况. 从中可知，添加浓度为100 μg ·L^-1 的维生素B₁₂明显比所加浓度为10 μg ·L^-1 时更能促进细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因的表达，且随着暴露时间的增加，细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因相对表达量均显著增加，7 d后细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因相对表达量分别为初始量的12.9、 31.2倍.

图 3

Fig. 3

图 3 维生素B12对细胞色素b6f复合体铁硫蛋白基因表达水平的影响 Fig. 3 Effects of vitamin B12 on cytochrome b6f complex Fe-S protein gene expression

图 4显示了脱氯功能藻种Nostoc PD-2双加氧酶基因相对表达量随时间的变化情况. 从中可知，添加浓度为100 μg ·L^-1 的维生素B₁₂明显比所加浓度为10 μg ·L^-1时更能促进双加氧酶基因的表达，且随着暴露时间的增加，双加氧酶基因相对表达量均显著增加，7 d后双加氧酶基因相对表达量分别为初始量的11.8、 15.3倍.

图 4

Fig. 4

图 4 维生素B12对双加氧酶基因表达水平的影响 Fig. 4 Effects of vitamin B12 on dioxygenase gene expression

不同浓度VB₁₂添加后，铁硫蛋白基因，双加氧酶基因表达水平和脱氯功能藻种对PCB28的降解百分比之间的相关性见表 3. 从中可明显看出，两种浓度VB₁₂存在条件下，铁硫蛋白基因相对表达量和PCB28降解效果之间的相关性均高于双加氧酶基因和PCB28降解之间的相关性.

表 3(Table 3)

表 3 VB12添加后基因表达水平与PCB28降解百分比的相关性 Table 3 Correlation between gene expression level and PCB28 degradation rate VB12浓度/μg·L-1 铁硫蛋白基因相对表达量 双加氧酶基因相对表达量 R1(n=18) R2(n=18) 10 0.882 0.849 100 0.965 0.941

表 3 VB12添加后基因表达水平与PCB28降解百分比的相关性 Table 3 Correlation between gene expression level and PCB28 degradation rate

脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28的降解效果明显. 表 4列出了本研究中脱氯功能藻种对PCB28的降解效果和其他PCBs降解微生物对PCB28的降解效果对比信息. 表 4文献中所用的PCBs为各PCBs单标的混合物(即PCBs混标)，PCB28在PCBs混标中所占的比例很低. 如文献^[26]中PCB28在PCBs商业混标Aroclor 1221中的质量分数仅为0.61%，故而该研究中实际所降解的PCB28的量比脱氯功能藻种所降解的PCB28的量少. 由此可知，本研究中所用的脱氯功能蓝藻对PCB28的降解效果优于其他PCBs降解功能微生物. 此外，与土壤中土著PCBs降解微生物群落^{[24, 25]}相比，Nostoc PD-2对PCB28的降解具有降解半衰期短、 降解效率高等特点. 在此基础上，笔者添加维生素B₁₂能够明显促进脱氯功能藻种PD-2对PCB28的降解作用(图 1). 添加不同浓度(10、 100和1000 μg ·L^-1)的维生素B₁₂条件下暴露7d，脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28的降解百分比，分别提高11.0%、 19.7%和21.9%. 向PCB28降解反应体系添加VB₁₂可进一步促进功能藻种PD-2对PCB28的降解作用. 因此，笔者认为脱氯功能藻种Nostoc PD-2有望作为先锋物种应用于PCBs污染水稻土的原位生物修复，而添加VB₁₂则可能成为促脱氯功能藻种降解PCBs的新技术，这对于降低PCBs的生态风险具有重要现实意义.

表 4(Table 4)

表 4 不同PCBs降解微生物对PCB28降解效果的比较 Table 4 Comparison of degradation rate of PCB28 by different PCB-degraders 降解功能微生物 PCBs含量 PCB28降解百分比/% 降解时间/d 文献 Nostoc PD-2 2 mg·L-1 64.7 7 本研究 土壤细菌群落 60 mg·L-1 53.0 28 [23] PCBs污染区土著微生物 187.8 μg·L-1 14.0 14 [24] Stenotrophomonas sp. JSG1 5 μmol·L-1 50.3 7 [25] Hydrogenophaga taeniospiralis IA3-A 10 mg·L-1 58.0 2 [26] Pseudomonas fluorescens strains F113L∷1180 5 μmol·L-1 0 —1) [27] 1)文献中未给出相关数据

表 4 不同PCBs降解微生物对PCB28降解效果的比较 Table 4 Comparison of degradation rate of PCB28 by different PCB-degraders

为进一步探究VB₁₂促脱氯功能藻种PD-2降解PCB28的机制，笔者对降解过程中功能藻种细胞内的细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因和双加氧酶基因表达情况进行了分析. 结果显示，添加VB₁₂，上述两种基因的表达量均有明显上调，并且呈现时间-效应关系. 研究发现，维生素B₁₂能够作为电子传递介质促进环境中残留PCBs的降解^[28]. Molde等^[29]在对PCBs同类物和六氯苯的降解研究时也得到了类似的实验结果. 此外，有研究者发现VB₁₂是一类微生物促生长因子，它能够作为辅酶或酶的辅基影响微生物的生长、 代谢、 繁殖和活力^[30]. 因此，笔者认为添加VB₁₂后，脱氯功能藻种PD-2对PCB28降解反应所需的电子供应量得到了充足保证. 另外，VB₁₂可能还起到了维持PCB28胁迫下的脱氯功能藻种细胞的正常生长和生命活动，这为功能藻种实现对PCB28的降解提供了必要条件.

VB₁₂作为电子传递介质投加至脱氯功能藻种降解PCB28的体系中，势必会影响藻细胞内执行电子传递功能蛋白和基因. 细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白位于蓝藻的类囊体膜上，在光合作用电子传输链过程中占据重要位置^[31]. 有实验表明细胞色素b₆f复合体会调节LHCII的磷酸化氧化还原状态^[32,33]. 另外，蓝藻的类囊体直接悬浮于细胞质中，这就使得外加的电子传递介质能够和细胞色素b₆f 复合体铁硫蛋白一起，既参与光合作用的电子传递，又参与呼吸作用的电子传递^{[34, 35]}. 本研究中，维生素B₁₂作为一种常见的电子传递介质添加到念珠藻Nostoc PD-2的无氯培养体系中，很可能参与到藻胆体蛋白磷酸化调节机制中，从而促进功能藻种的光合作用，提高产能效率，促进PCB28脱氯降解反应的正向进行. 图 3中，两个浓度下细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因相对表达量一直在呈倍数增长，其中10 μg ·L^-1 维生素B₁₂条件下PCB28暴露7 d后的细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因表达与对照组相比上调了11.8倍，100 μg ·L^-1 维生素B₁₂条件下PCBs暴露7 d后上调了15.7倍. 由该实验结果，笔者推测添加VB₁₂的条件下，脱氯功能藻种上调表达铁硫蛋白基因，进而促进铁硫蛋白的表达，一方面使得藻细胞产能提高，另一方面，使得藻细胞中的PCBs降解反应和光合呼吸作用的电子传递加速发生. 从而实现对PCB28的高效快速降解.

此外，有研究报道是降功能微生物所表达的双加氧酶，也能够使微生物实现对PCBs的降解^[36,37]. 本研究中，添加不同浓度的VB₁₂时，脱氯功能藻种细胞内双加氧酶的基因相对表达量一直在呈现出明显的增长趋势(图 4). 其中10 μg ·L^-1 维生素B₁₂条件下PCB28暴露7 d后的双加氧酶基因表达与对照组相比分别上调了12.9倍，100 μg ·L^-1 维生素B₁₂条件下PCB28暴露7 d后上调至对照组中该基因表达量的31.2倍，上调倍数是10 μg ·L^-1 维生素B₁₂条件下的2.4倍. 从表 3的相关系数分析结果可明显看出，功能藻种PD-2降解PCB28的效果与双加氧酶基因的表达呈现显著相关性. 因此，笔者推测双加氧酶基因很可能与细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白共同参与了脱氯功能藻种PD-2降解PCB28的过程，其在降解过程中扮演的具体角色有待进一步研究.

综上所述，笔者对VB₁₂添加时，脱氯功能藻种PD-2对PCB28降解的机制进行了假设，结果见图 5. 笔者认为VB₁₂存在下，脱氯功能藻种的细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因发生上调表达，其所编码的细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白表达量上升，使得功能藻种的光合作用得到增强，进而为PCB28的降解这一耗能过程提供更多的能量. 此外，VB₁₂还可为PCB28发生降解的氧化还原反应提供大量电子，促进反应正向进行. 双加氧酶基因的上调则可能引起双加氧酶的表达量增加，从而起到辅助PCB28降解的作用.

图 5

Fig. 5

图 5 VB12促进脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2降解PCB28的假定过程 Fig. 5 Putative PCB28-degradation process facilitated by VB12 0< m≤3，0<n≤3

(1) 添加不同浓度电子供体维生素B₁₂能够有效促进脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2降解多氯联苯，10、 100和1000 μg ·L^-1这3个维生素B₁₂浓度下暴露7 d，脱氯功能藻种Nostoc PD-2对PCB28的降解百分比，分别提高11.0%、 19.7%和21.9%.

(2) 动力学结果显示添加电子供体维生素B₁₂能够有效促进脱氯功能蓝藻Nostoc PD-2降解多氯联苯，对于起始浓度均为2 mg ·L^-1多氯联苯，9 d后降解率最高为71.1%和83.8%. 其降解反应符合一级动力学过程，其降解半衰期分别为5.53 d和3.08 d.

(3) 添加不同浓度的维生素B₁₂能够有效促进脱氯功能藻种Nostoc PD-2中细胞色素b₆f复合体铁硫蛋白基因和双加氧酶基因的表达，并且铁硫蛋白基因的表达量与PCB28降解的相关性更高，该基因可能是VB₁₂存在时，脱氯功能藻种的降解关键基因.