近地层臭氧是目前最主要的大气污染物，它对世界上大多数植物和农业生产都有负作用^{[1, 2, 3, 4, 5]}. 近年来随着化石燃料的大量燃烧及汽车尾气的大量排放，致使臭氧前体物质氮氧化物和VOCs的排放量显著增加. IPCC(联合国政府间气候变化专门委员会)报道地表臭氧浓度在过去的几十年里以每年0.5%~2%的速度不断上升^[6,7]. 目前北半球近地层臭氧浓度夏季8 h的平均值已达到50 nL ·L^-1[8]. 我国近地层O₃浓度增加较快，夏季平均监测浓度已达到50～60 nL ·L^-1[9].

已有的研究显示：日益升高的臭氧浓度可对植物引起一系列负作用，如植物叶片出现可见或不可见的伤害症状，降低光合作用速率，影响碳分配，减少生物量积累，加速衰老，减少产量，改变籽粒品质等^{[10, 11, 12]}，但这种影响程度因物种或品种而异. 目前关于臭氧对植物影响的研究大多是通过开顶箱装置展开的，但气室的壁垒效应(如气室内温度比外界高、 湿度较低)使得研究结果具有很多不确定性，并不能真实反映作物实际生长情况. 然而，大田环境直接暴露更能反映出作物对O₃浓度升高的响应过程.

大量研究已证实矮菜豆(Phaseolus vulgaris L.)是臭氧敏感性作物^[13]. 通过基因杂交培育出来的不同品系同种属菜豆S156(臭氧敏感性)和R123(臭氧耐受性)拥有更加宽泛的臭氧响应范围. 在低浓度臭氧下，S156和R123型菜豆的品系表达并没有差异，但随着臭氧浓度的提升，敏感性品系S156对于臭氧愈加敏感，表现为S156型菜豆的豆荚个数和生物量会逐渐低于耐受性品系R123型菜豆^[14,15]. 研究表明，生物量或产量的S156/R123比值大小可准确反映了矮菜豆是否受到臭氧的影响，即比值接近1，表示臭氧对矮菜豆不影响，如果小于1，则表示臭氧影响了其生长，这种影响程度随着比值的变小而加重^{[16, 17, 18, 19, 20]}. 在此基础上，欧洲中部、 南部地区自2008年已经开始将矮菜豆作为地表臭氧污染的生物指示植物^{[21, 22, 23, 24, 25]}，而国内还没有开展这方面的研究. 因此，本研究以矮菜豆为例，比较分析了当前臭氧浓度下对不同基因型菜豆生长的影响，探讨北京和哈尔滨地区当前环境臭氧浓度下矮菜豆叶片损伤及产量差异，以期为评价当前环境空气污染对国内作物产量损失的区域性影响提供科学依据. 1 材料与方法 1.1 实验地点

鉴于人力、 物力、 实验可行性的基础上，实验选取3个地点同时进行，分别为北京市市区的中国科学院生态环境研究中心(生态中心)、 北京市郊昌平区马池口镇昌平种子基地(昌平)，哈尔滨市区的中国科学院东北地理与农业生态研究所(哈尔滨). 前两者地处中国中东部地区北京市(N39°4′~41°6′，E115°7′~117°4′)，大陆性季风气候，年降水量644 mm，年平均气温10～12℃，夏季平均气温24～26℃，年平均日照时数在2000～2800 h之间，全年无霜期180～200 d; 后者地处中国东北北部地区哈尔滨市(N44°04′，E125°42′)，属中温带大陆性季风气候，年平均降水量553.5 mm，年平均气温3～4℃，夏季平均气温19～23℃，年平均日照时数2500 h，全年无霜期在135～140 d. 1.2 实验作物

实验选用两种基因型矮菜豆(Phaseolus vulgaris L.)——分别为臭氧耐抗性(R123)和臭氧敏感性(S156)——它们是美国农业部农业研究所植物科学研究中心进行筛选培育，由Felicity Hays博士提供. 1.3 实验设计

选取籽粒饱满、 大小一致的种子，用10% H₂ O₂表面消毒后，再用蒸馏水冲洗干净. 种于容积为12~15 L的PVC花盆内，每盆在距盆内中心5 cm，深度3 cm处播种两粒，当植株生长稳定后间苗至1株. 生态中心、 昌平及哈尔滨实验分别开始于6月10日、 6月14日、 6月26日，结束于9月26、 9月28日、 9月10日，出苗率分别为100%、 100%、 99%.

实验采取室外直接暴露法. 实验地区由防护网遮拦，防止鸟儿、 兔子或其他小型哺乳动物啃食，每种基因型12盆重复处理. 实验期间每两天浇水一次，避免植物生长期间的水分胁迫，施肥水平与当地常规水平一致，实验初期施用N、 P、 K比例为17 ∶17 ∶17的缓释肥，病虫害防治等为大田常规管理.

实验期间臭氧浓度由热电公司Thermo 49i臭氧分析仪监测，温湿度数据由Campbell 公司CS215温湿度探头监测. 1.4 测定指标和计算方法

(1) 可见症状 对两种基因型菜豆出现的可见损伤进行记录. 具体标准参照文献^[26]. 鉴于实验期间人力、 物力的影响，无法完成三地每周臭氧评估数据的记录，故生长情况和可见损伤只考虑昌平和生态中心两地. 规定记录的第一天为间苗后的第一天，哈尔滨地区实验只进行收获后产量的测定.

(2) 产量 在任一基因型菜豆50%豆荚变干或变棕色时收获菜豆，尽量保证两种基因型菜豆同时收获. 收获时<2 cm菜豆豆荚不进行收获或计数，收获计数后的豆荚经风干至恒重后称量，获取豆荚和籽粒干重，两种基因型菜豆产量比值作为评价臭氧对菜豆影响的主要依据.

(3) 损伤比例计算 记录每株植物上叶片总数、 枯萎凋落叶片个数、 受损伤叶片数，并按单叶片损伤比例设置1%～5%、 5%～25%、 >25%这3个等级. 损伤比例=(每株植物受损伤的叶片百分比×受害叶片面积的平均百分比)/100，参照文献^[27]. 1.5 数据分析

运用EXCEL 2010进行数据整理，SPSS 18.0进行相关性和方差分析，运用Origin 8.0进行绘图.

2 结果 2.1 臭氧浓度

从表 1可以看出北京地区昌平和生态中心两地，整个生长季8 h平均臭氧浓度相近. 但臭氧累积浓度AOT40(小时臭氧浓度高于40 nL ·L^-1的差值的累积值)显示生态中心为22.7 μL ·L^-1 ·h，比昌平高44%. 哈尔滨地区8 h平均臭氧浓度和AOT40分别仅为29.2 nL ·L^-1和0.67 μL ·L^-1 ·h，明显低于北京地区. 因此，把哈尔滨地区作为本研究的臭氧背景值区域.

表 1(Table 1)

表 1 菜豆生长季期间不同地点的臭氧浓度 Table 1 Ozone concentration at different sites during growing season of snap bean 臭氧浓度 昌平 生态中心 哈尔滨 8 h平均浓度(9~17 h)/nL·L-1 54.6 55.8 29.2 整个生长季AOT40/μL·L-1·h 15.8 22.7 0.67

表 1 菜豆生长季期间不同地点的臭氧浓度 Table 1 Ozone concentration at different sites during growing season of snap bean

2.2 菜豆生长及可见损伤 2.2.1 生长

从图 1可以看出，在菜豆生长前期两种基因型菜豆生长状况并没有过多差异. 随着臭氧浓度的积累，S156型菜豆生长逐渐受到影响，主要表现在叶片逐渐出现锈斑并随着时间的延长叶片逐步发黄干枯掉落，而R123型菜豆则茁壮成长. 实验记录显示整个生长季中S156型菜豆叶片较小，叶片数量比R123型菜豆少15%左右. 同时S156型菜豆臭氧抵抗性明显低于R123型菜豆，在实验后期大多数S156型菜豆叶片都呈现枯萎症状，但R123型菜豆依然保持碧绿. 在R123型菜豆变黄成熟之前，大多数S156型菜豆的叶片已经完全脱落.

图 1

Fig. 1

图 1 菜豆生长状况 Fig. 1 Growth status of snap bean

由图 2可以看出，S156型菜豆的臭氧损伤比例明显大于R123型菜豆，整个生长季生态中心和昌平的S156型菜豆平均臭氧损伤比例分别高出R123型菜豆22%和25%. 从不同生育期的响应来看，菜豆臭氧损伤自开花期之后逐渐显露，其中S156型菜豆可见损伤明显，R123型菜豆损伤响应较少. 开花期至豆荚形成期菜豆臭氧损伤比例直线上升，尤其S156型菜豆臭氧损伤平均值为16%，而同一时期R123型菜豆平均损伤比例只有6%，这一阶段是菜豆叶片损伤加剧的阶段; 豆荚形成期到豆荚成熟阶段，臭氧损伤比例达到最大值，昌平和生态中心两地S156型菜豆与R123型菜豆损伤平均值之差分别为34%和47%，此阶段是菜豆臭氧损伤最严重的阶段; 在豆荚衰老期随着叶片的脱落，叶片的臭氧损伤比例呈现下降趋势，直至收获.

图 2

Fig. 2

图 2 矮菜豆生长期间臭氧损伤百分比 Fig. 2 Ozone injury percentage during the growing season of snap bean

从单株豆荚数来看[图 3(a)]，生态中心和昌平两地两种基因型单株菜豆的豆荚个数间的差异是显著的(P<0.001)，哈尔滨地区二者差异不显著(P=0.125). 生态中心和昌平两地S156型菜豆单株荚数是R123型的0.39和0.48倍，但哈尔滨地区二者比值为1.18. 从单株菜豆的豆荚总质量来看[图 3(b)]，昌平、 生态中心和哈尔滨地区的S156单株豆荚总质量仅为R123型的0.48、 0.24和0.73倍.

图 3

Fig. 3

图 3 单株豆荚个数及豆荚质量 Fig. 3 Number of pods and pods dry weight per plant a,b代表不同基因型差异显著(P<0.05)，下同

3个地点的数据均显示，S156型菜豆的籽粒产量显著低于R123型 [图 4(a)]，昌平、 生态中心和哈尔滨地区S156型菜豆产量与R123型产量比值分别为0.49、 0.22和0.73. 但两种基因型菜豆的单个籽粒重的差异依所在地区的不同而不同[图 4(b)]. 生态中心与哈尔滨两地S156型与R123型差异显著(P<0.001)，分别为R123型的31% 和16%. 但昌平地区S156型菜豆单粒重比R123型菜豆单粒重低15%，但未达到显著水平(P=0.28).

图 4

Fig. 4

图 4 单株产量及单粒重 Fig. 4 Seeds yield per plant and single seed weight

由表 2可知：自2005~2013年国外研究中活性炭过滤空气实验中的臭氧平均浓度都小于30 nL ·L^-1，室外暴露实验监测的臭氧平均浓度大都处在20~50 nL ·L^-1 之间，而本研究显示北京地区2013年菜豆生长期间臭氧平均浓度已达55 nL ·L^-1，明显高于国外大多数城市的平均水平. 国外臭氧平均浓度小于30 nL ·L^-1 的实验中豆荚个数和豆荚质量S156/R123比值基本都大于1，臭氧平均浓度在30~50 nL ·L^-1 之间的实验中豆荚个数和豆荚质量S156/R123最小比值分别为0.46和0.58，同比国内臭氧暴露实验中无论豆荚个数还是豆荚质量S156/R123比值都展现了比国外更低的数值，甚至生态中心的豆荚质量S156/R123比值都比国外臭氧熏蒸还低.

表 2(Table 2)

表 2 两种矮菜豆豆荚个数及豆荚产量比值研究清单 1) Table 2 A review of effects of ambient ozone on the pod number and pod weight per plant of snap bean 国家 地点 处理1) 臭氧平均浓度 /nL·L-1 豆荚个数 S156/R123 豆荚质量 S156/R123 文献 USA Carolina CF 23 0.99 — [16] AA 48 0.46 — USA Amherst CF 30 1.36 — [17] USA Carolina AA 45 0.48 — [18] UK Ascot AA 24 — 1.36 Belgium Tervuren AA 28 1.01 1.14 UK Bangor AA 31 1.2 0.97 Spain Valencia AA 49 0.7 0.58 [21, 22, 23, 24, 25] Japan Criepi AA 47 0.69 — Italy Pisa AA 38 — 1.07 Greece Crete AA 42 — 0.85 USA Carolina AA 43 — 0.74 [19] Italy Rome O3 59 — 0.38 [20] AA 40 0.9 0.63 哈尔滨 AA 29 1.18 0.73 中国 昌平 AA 55 0.47 0.48 本研究 生态中心 AA 56 0.39 0.24 1)CF为活性炭过滤空气; AA为室外环境空气; O3为臭氧熏蒸； “—”表示文章中没有相关数据

表 2 两种矮菜豆豆荚个数及豆荚产量比值研究清单 1) Table 2 A review of effects of ambient ozone on the pod number and pod weight per plant of snap bean

叶片是植物光合作用的重要器官，臭氧会引起植物叶片细胞死亡，加速衰老，导致叶片出现变色病、 坏死病等可见伤害症状^{[28, 29, 30]}. 本研究显示：当前国内环境臭氧浓度已经对敏感性作物菜豆产生了明显的危害. 生态中心和昌平两地S156型菜豆在当前国内环境臭氧浓度下都出现了严重臭氧损伤，R123型菜豆虽然也出现了臭氧损伤，但与S156型菜豆相比，R123型菜豆叶片损伤比例明显偏低，并且其出现臭氧损伤的时间晚于S156.

此外，臭氧对植物的损伤影响在植物生长的不同阶段是不同的. 从矮菜豆出苗至生殖生长期不同生长阶段，其对于室外臭氧的响应具有显著差异性. 与前人研究相同^{[31, 32]}，昌平和生态中心两地的实验都显示：臭氧损伤自开花期开始，开花期至结荚期损伤加剧，在豆荚成熟期臭氧损伤比例达到最大值. 随后在豆荚衰老期，臭氧损伤明显下降. 另外，生态中心和昌平两地不同基因型菜豆臭氧损伤曲线虽然都呈现相同趋势，但在豆荚形成时期，生态中心S156型菜豆及R123型菜豆臭氧损伤比例都高于昌平地区. 结合臭氧小时浓度的数据，发现生态中心因地处北京城区在夏天强烈阳光照射下汽车尾气排放的NOx和VOCs物质发生反应使这段时间高臭氧浓度(> 60 nL ·L^-1)的天数较多，致使生态中心菜豆叶片臭氧损伤比例达到最大，叶片遭受严重伤害. 3.2 当前环境臭氧浓度下不同基因型菜豆产量差异显著

臭氧引起植物叶片损伤之后，势必影响植物正常生长发育. 大量的研究显示，室外对照实验中生长的敏感性菜豆S156的豆荚个数和生物量明显低于耐受性菜豆R123. 本实验证实当前国内环境臭氧浓度已经对敏感性作物菜豆产生了明显的危害，且在昌平、 生态中心和哈尔滨三地的实验结果表明：不同基因型菜豆臭氧损伤情况及豆荚产量与当地环境臭氧浓度显著相关. 综合前人研究及ICP-Vegetation (2009～2013)报告^{[21, 22, 23, 24, 25]}(表 2)结果，室外环境臭氧浓度大于40 nL ·L^-1 就可造成菜豆减产. 生态中心和昌平高达55 nL ·L^-1 的环境臭氧浓度已经超过国外大多数地区臭氧环境浓度(<40 nL ·L^-1)，甚至接近国外许多实验中的臭氧熏蒸水平，而平均值为0.43和0.36的豆荚个数和豆荚质量的S156/R123比值，也是已有的臭氧暴露实验中的较低值，表明在此地区菜豆受臭氧损伤非常严重. 位于中国东北地区的哈尔滨市其30 nL ·L^-1 的环境臭氧浓度却与大多数国外研究中的过滤空气处理组(CF)相似. 相对于高臭氧浓度地区，哈尔滨地区臭氧浓度刚好处于植物受臭氧损伤的阈值之间(20～40 nL ·L^-1)，导致豆荚个数和豆荚质量的S156/R123比值接近于1.

当然，在欧洲不同气候条件及臭氧浓度下开展的菜豆田间暴露实验中，也有相关报道称豆荚产量的S156/R123与季节性臭氧浓度并没有明确的相关性^[34]. 尽管人们还无法准确解释臭氧敏感性的机制，但无论是叶片损伤还是生物量数据都显示在当前国内臭氧环境浓度下，敏感型菜豆产量在高臭氧浓度地区会大幅度降低. 4 结论

当前我国北方地区的环境臭氧浓度已经明显影响到了敏感性作物矮菜豆的生长，其臭氧伤害程度依据臭氧浓度、 菜豆品系及菜豆生长阶段的不同而有显著差别. 当然本文并没有考虑不同地区气候(温度、 蒸汽压、 湿度)对矮菜豆产量的影响，不同基因型菜豆豆荚产量的比值显得尤为重要. 未来的研究将进一步深化臭氧和气候因素相结合与不同基因型矮菜豆生长间的关系的同时，寻求中国本地的臭氧生物指示品种变得尤为必要.