铜既是植物、 动物和人必需的微量元素，又是一种重金属. 过量的铜会对动植物及人体造成极大的伤害，使其生长发育受抑、 产生畸形，直至死亡^[1]. 随着工农业的发展、 铜矿的开采和冶炼^[2]、 含铜杀菌剂如波尔多液和含铜的污泥、 污水在农业生产中的长期频繁使用^[3]、 畜牧业生产中含铜废物的排放及农田使用^[4]、 生活含铜垃圾的排放^[5]等都引起并加重了土壤环境的铜污染，使铜污染成为土壤重金属污染的一个重要方面.

物理、 化学和生物修复是目前研究和应用最多的土壤修复技术^[6]，生物修复又包括微生物和植物修复等，其中植物修复成本低、 操作简便、 对环境扰动少，在土壤重金属污染治理方面具有极大的发展潜力和良好的应用前景^[7]. 植物根系在重金属胁迫下分泌某些低分子量有机酸和氨基酸等物质，它们能酸化根际土壤、 螯合重金属，改变重金属在土壤中的形态^[8]，影响各形态重金属的数量比例，并直接影响重金属的迁移、 转化以及对植物的毒性^{[9, 10, 11, 12]}.

已有研究表明，超积累植物在修复重金属污染土壤时其根系分泌大量的有机酸，主要包括草酸、 酒石酸、 柠檬酸、 苹果酸等^{[13, 14, 15]}. 柠檬酸是三元酸，而酒石酸和草酸是二元酸，它们与Cu的络合常数lgK值分别为13.2、 3.19和6.2^{[16, 17]}. 作为重金属元素的配基，它们与重金属离子络合，参与重金属的植物吸收、 运输、 积累等过程，降低重金属的毒性，进而促进其植物富集效果^{[11, 15, 18]}. 本研究通过探讨人为添加3种低分子量有机酸对土壤中重金属Cu形态的影响，分析了有机酸作为螯合诱导剂对重金属铜在土壤中的形态变化，以期为植物修复土壤重金属铜提供参考依据.

1 材料与方法 1.1 样品采集与处理

供试土壤采自湖北省武汉市狮子山0~20 cm表层，为石英砂岩坡积物发育的红壤. 其基本理化性质为：pH 4.38，有机质0.13%，速效磷7.37 mg ·kg^-1，速效钾152.6 mg ·kg^-1，全氮0.637 g ·kg^-1，总Cu含量35.1 mg ·kg^-1. 将采集好的土样均匀铺在洁净的纸盒中，捡出动植物残体以及碎石等杂物，然后置于无阳光直射且通风良好处自然风干. 风干后的土样磨细过20目尼龙筛，保存备用.

参照国家GB 15618-1995土壤环境质量标准并考虑我国部分重金属高污染区铜污染的现状^[5]，设计4个污染梯度，具体做法是：以喷淋方式向土样中添加外源Cu(CuSO₄形式)，得到含不同Cu浓度的土样，其含铜质量分数分别为0(不加Cu)、 100、 200、 400 mg ·kg^-1. 保持水分质量分数为20%，室温下老化9个月，作为Cu污染土壤. 培养后测定土壤中铜的总质量分数分别为：35.0、 134.9、 232.8、 433.6 mg ·kg^-1. 取风干后的土样，以溶液形式添加不同浓度的草酸、 柠檬酸和酒石酸，使有机酸浓度分别为0、 5、 10、 20 mmol ·kg^-1. 老化2周(方法同上)后风干磨细过100目筛备用. 以上各土样均设3次重复.

土壤基本理化性质按常规方法测定. Cu全量采用混合酸消化 (HCl-HNO₃-HClO₄)-火焰原子吸收分光光度法; Cu形态含量提取采用改进的BCR(European Communities Bureau of Reference)连续提取法^[19]，提取的土壤Cu形态分别为：弱酸提取态(可交换态和碳酸盐结合态)、 可还原态(铁锰氧化物结合态)、 可氧化态(有机物及硫化物结合态)、 残渣态^[20]，其相关操作见表 1. 待测液中Cu均用火焰原子吸收分光光度计测定.

表 1(Table 1)

表 1 土壤重金属Cu形态的BCR连续提取法 Table 1 BCRs sequential extraction procedures for soil Cu forms 步骤 形态 提取试剂 反应条件 Ⅰ 弱酸提取态 40 mL 0.11mol·L-1 HOAc (25±1)℃恒温连续振荡16 h Ⅱ 可还原态 40 mL 0.5 mol·L-1 NH2OH·HCl(HNO3) (25±1)℃恒温连续振荡16 h Ⅲ 可氧化态 ① 10 mL 30%H2O2 ① 室温下断续振荡1 h ② 6 mL 30%H2O2 ② (85±2)℃恒温断续振1 h ③ 50 mL 1.0 mol·L-1 NH4OAc [pH 2.0±0.1] ③ (25±1)℃连续振荡16 h Ⅴ 残渣态 HCl-HNO3-HClO4 消解完全

表 1 土壤重金属Cu形态的BCR连续提取法 Table 1 BCRs sequential extraction procedures for soil Cu forms

2 结果与分析 2.1 添加酒石酸对土壤中Cu化学形态的影响

由图 1可见，添加酒石酸对原土和污染土壤中Cu的形态变化有影响. 对原土(Cu0)，随着酒石酸浓度增加，培养后弱酸溶解态Cu的含量逐渐增加，由占总Cu 9.49%提高到占13.73%; 而可还原态Cu的含量由占总Cu 7.82%降低到5.89%. 残渣态Cu和可氧化态Cu的百分含量变化不大，没有明显差别.

图 1

Fig. 1

图 1 添加酒石酸对污染土壤中Cu化学形态的影响 Fig. 1 Effects of the tartaric acid added into Cu-contaminated soil on the copper chemical forms

添加外源Cu的污染土壤中，随着酒石酸添加量增加，弱酸溶解态Cu占总Cu的百分含量渐增，而可还原态Cu却呈现下降的趋势. 在Cu100中，弱酸溶解态Cu占总Cu的百分数由最初的27.31%增加到34.58%，增幅最大. 在Cu200中，可还原态Cu占总Cu 41.10%降低到31.88%，降幅最显著. 随着酒石酸添加浓度的增加，同一水平的铜污染土中残渣态和可氧化态Cu的百分含量没有明显变化.

原土中铜的形态主要是残渣态，其占全Cu比例超过60%，但是随着添加外源Cu的增多，Cu的形态主要为弱酸溶解态和可还原态^[21]. 由于残渣态Cu的绝对含量没有明显变化，所以随着添加Cu浓度的增加残渣态Cu占总Cu百分数逐渐下降. 郑雪玲等^[22]研究表明螯合剂能够从铁锰结合态中将金属离子解吸，进入土壤溶液而增加重金属浓度，促进重金属从根系向地上部转运.

柠檬酸的添加对土壤中Cu的化学形态变化如图 2所示. 可以看出，原土中随着柠檬酸添加浓度增加，弱酸溶解态Cu逐渐增加，由最初占总Cu的9.49%提高到18.00%，增加最明显; 而可还原态Cu却急剧减少，由最初占总Cu 7.82%减少到3.24%. 残渣态Cu所占的百分含量略有减少，而可氧化态有增加的趋势.

图 2

Fig. 2

图 2 添加柠檬酸对污染土壤中Cu化学形态的影响 Fig. 2 Effects of the citric acid added into Cu-contaminated soil on the copper chemical forms

在Cu污染土样中，随着柠檬酸添加浓度的增加，弱酸溶解态Cu占总Cu的百分数逐渐增加，而可还原态Cu占总Cu的百分数呈现逐渐下降的趋势. 在Cu200中，弱酸溶解态Cu占总Cu的百分数由不加柠檬酸时的42.75%增加到20 mmol ·kg^-1柠檬酸处理时的53.07%，增加幅度最大; 可还原态Cu占总Cu 41.10%减少到32.16%. 在Cu200和Cu400中，添加柠檬酸的浓度分别为10 mmol ·kg^-1和5 mmol ·kg^-1时，弱酸溶解态Cu占总Cu比分别达到51.33%和51.12%. 除了Cu 100中可氧化态Cu略有增加外，其他处理可氧化态Cu和残渣态Cu的变化均不明显. 林琦等^[23]研究也表明，添加柠檬酸会降低土壤对Pb、 Cd的吸附; 但草酸却增加土壤对Pb、 Cd的吸附，这说明柠檬酸更易活化土壤中的金属，使其成为有效态.

如图 3所示，添加草酸处理后，原土中还原态Cu的变化明显，呈急剧下降的趋势. 与未添加草酸相比，添加草酸20 mmol ·kg^-1时，可还原态Cu降低了57.15%; 弱酸溶解态Cu和可氧化态Cu都有所增加，其占总Cu的百分数分别增加到10.37%和21.37%，增加的比率较小. 残渣态Cu含量基本没有变化.

图 3

Fig. 3

图 3 添加草酸对污染土壤中Cu化学形态的影响 Fig. 3 Effects of the oxalic acid added into Cu-contaminated soil on the copper chemical forms

添加草酸培养后，污染土壤中铜的形态变化明显. 随着Cu浓度增加，弱酸溶解态Cu占总Cu的比例逐渐增加，而残渣态Cu却逐渐减少. 原因可能是，供试红壤的pH值较低，不利于弱酸溶解态Cu向其他形态的转化. 添加10 mmol ·kg^-1草酸培养后，Cu200和Cu400中弱酸溶解态Cu占总Cu分数分别增加到50.68%和52.12%，增加率最大，而可还原态Cu占总Cu分别减少了24.43%和11.20%，与添加20 mmol ·kg^-1草酸时效果无显著差别.

3 讨论

Cu在土壤中的形态变化受添加Cu浓度以及有机酸的种类、 浓度的影响. 未添加有机酸时，随着外源Cu浓度的增加，土壤Cu由以残渣态为主转变为以弱酸溶解态和可还原态为主. 供试红壤中游离铁含量为24.44 g ·kg^-1，有利于外源Cu结合成为可还原态; 但土壤pH值为4.38且有机质质量分数仅0.13%，所以外源Cu不易向可氧化态转化. 残渣态Cu的形成时间长，且一般存在于硅酸盐等矿物晶格中，化学性质稳定，不易受外界环境影响^[24]. 因此，在外源Cu浓度提高时会导致Cu100~Cu400土壤中残渣态Cu百分含量降低，而同一Cu浓度下的不同有机酸处理残渣态Cu的含量基本没有变化.

随着有机酸浓度的增加，弱酸溶解态Cu含量亦增加; 可还原态Cu的含量减少，可氧化态Cu和残渣态Cu的变化不明显. 3种有机酸呈现出相同的规律，其中添加柠檬酸处理的弱酸溶解态Cu增加最明显，在Cu400中，弱酸溶解态Cu占总Cu由47.21%增加到55.60%，增加率达17.77%; 添加酒石酸和草酸也使弱酸溶解态Cu增加，但效果弱于柠檬酸处理，在添加20 mmol ·kg^-1两种有机酸时，弱酸溶解态Cu增加率分别为15.63%和14.43%. 在添加有机酸为10 mmol ·kg^-1时，柠檬酸能活化土壤中Cu，使弱酸溶解态Cu含量占比超过50%，而添加浓度为20 mmol ·kg^-1草酸和酒石酸时弱酸溶解态Cu含量分数才超过50%. 添加有机酸的浓度增加，增加了土壤中H⁺的浓度，pH降低0.1~0.3个单位(数据未列出)，有利于矿物的溶解而释放重金属; 同时在低pH下，土壤表面电荷性质的影响及H⁺离子的代换作用占重要地位，随着H⁺浓度的增加，促进土壤中固相重金属的溶解，同时消耗土壤胶体和矿物表面阳离子吸附位点^[25]. 倪才英等^[26]在研究有机物释放重金属复合污染土壤中的Cu、 Pb时发现，柠檬酸的效果优于苹果酸、 酒石酸和草酸. 钱翌等^[27]研究有机酸对土壤中Pb形态影响结果也表明，添加苹果酸和柠檬酸均能降低铁锰氧化物结合态Pb的含量，同时大幅提高可交换态Pb含量，且活化效果为柠檬酸>苹果酸. 柠檬酸的效果最好，可能与它为三元羧酸，而草酸和酒石酸均为二元酸有关. 柠檬酸不但可以减弱金属离子的专性吸附，而且可以减弱其电性吸附^[28].

随着有机酸浓度的添加，铜的形态由可氧化态和可还原态逐渐向弱酸溶解态转化，增加了铜的生物有效性，3种有机酸表现出同样的规律. Cu弱酸溶解态是对生物有效的形态，可还原态(铁锰氧化物结合态)和可氧化态(有机结合态)相对于残渣态而言，属于较弱结合形态，具有较强的潜在生物有效性^[29]. 其中柠檬酸对铜向有效态的转化影响最显著，最多可使弱酸溶解态Cu质量分数达到55.59%，远高于草酸和酒石酸处理，同时大幅度降低了较弱结合态(可还原态和可氧化态)占全Cu的质量分数.

4 结论

向 Cu污染土壤中添加柠檬酸、 酒石酸、 草酸均能提高土壤中弱酸提取态 Cu的含量，从而有效活化土壤中的重金属 Cu. 对于投加外源 Cu的土壤，随柠檬酸添加浓度的升高，活化效果越好，20 mmol ·kg^-1时土壤中可交换态 Cu百分含量达到最大值; 随草酸、 酒石酸浓度升高，可交换态 Cu百分含量先上升后基本不变，当其浓度为 10 mmol ·kg^-1、 20 mmol ·kg^-1时达到最大值. 柠檬酸活化土壤重金属 Cu的效果整体优于其他两种有机酸的活化效果.