水华蓝藻覆盖水面，腐烂消耗水体溶解氧，导致水体严重缺氧，产生恶臭; 蓝藻分泌藻毒素，对人体健康造成很大威胁，对水环境造成严重影响^[1,2]. 因此，有关蓝藻水华暴发的机制引起国内外学者的广泛重视^{[3, 4, 5, 6, 7]}. 蓝藻具有很强的上浮特性，可以通过改变在水体中的纵向位置以适应环境^{[8, 9, 10]}，当蓝藻聚集漂浮在江河湖泊的内陆水体上时，便会生成水华^[11]. 因此，研究蓝藻的浮力调节机制对了解蓝藻水华的暴发机制起着至关重要的作用^[12].

蓝藻之所以上浮是因为藻细胞内有气囊(gas vesicle)^[13]，这些气囊是由蛋白质壁组成的柱状气泡，两端锥形、 横断面为六边形^{[14. 15]}，气囊为蓝藻提供浮力，使蓝藻能长时间停留于水体表层光照区，获得生长繁殖的机会^{[16, 17, 18]}.

研究表明，蓝藻气囊能承受0.4~0.7 kPa的外部压力，当压力超过这一压力时，气囊将不可逆转地破裂^{[19, 20, 21]}，从而使蓝藻失去浮力而下沉. 因此，研究压力作用后气囊破裂、 蓝藻下沉规律，对控制蓝藻水华、 去除水源水中蓝藻，保障供水安全等方面有重要意义.

目前国内外有关气囊破裂及其对蓝藻上浮性能影响已经有了较多且深入的研究，但是对于不同压力作用下蓝藻气囊的破裂情况的研究还相对较少. 为此，笔者分别利用改进的Walsby气囊测定装置^{[22, 23, 24]}和透射电镜扫描法，研究了不同压力作用后蓝藻气囊破裂情况，以及压力作用后藻类活性和气囊恢复生长规律，以期对蓝藻水华的控制和蓝藻水处理提供一定的理论依据. 1 材料与方法 1.1 材料

从太湖梅梁湾取藻类和原水，将其放入实验室透明有机玻璃桶中，给予适当光照、 搅拌，自然培养，在一周内使用完毕. 经过镜检，藻类为铜绿微囊藻，太湖水pH为7.9~8.2. 1.2 实验装置 1.2.1 含藻水加压装置

含藻水加压实验装置如图 1所示，包括有机玻璃压力罐、 加压泵、 循环水箱. 自制有机玻璃压力罐容积为10 L耐压1.0 MPa，循环水箱容积为3 L，加压水泵为GY2A035F型不锈钢滑片泵，功率为80 W.

图 1

Fig. 1

图 1 含藻水加压装置示意 Fig. 1 Algae water pressure device

改进的Walsby气囊测定装置为压力毛细管法测定装置^[1,2]，由氮气加压装置、 显微镜、 压力毛细管、 压力套管等部分组成，如图 2所示. 其中毛细管上有刻度，容积2.0 mL，长度12.5 cm，刻度部分长10.0 cm，每个主刻度1.0 μL，每个次要刻度0.1 μL. 显微镜放大倍数400^[12].

图 2

Fig. 2

图 2 压力毛细管法气囊体积测定装置 Fig. 2 Capillary pressure device for measuring Gas vesiclesvolume

取含藻水充分混匀，将混匀的水样注满含藻水加压罐，开启加压泵，逐步调小回流阀，观察压力表读数，直到压力上升到指定压力，维持1 min，停止加压，放出压力罐中水样. 重复上述水样加压过程，分别制得0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7 MPa压力下的加压水样. 1.3.2 藻类气囊体积分数的图像分析方法 (1)藻细胞超薄切片透视电镜扫描 对加压后的含藻水进行低速离心，吸取2 mL高浓度藻液，送扬州大学分析测试中心进行生物处理，制作藻细胞超薄切片. 利用荷兰Philips公司生产的CM100型透射电镜对藻类超薄切片进行拍照，得到清晰的藻细胞切片照片(黑白).

(2)图像分析

自主编制图像分析软件，对藻细胞扫描照片进行分析，将图像分成黑白二色，其中白色部分为气囊，黑色部分为藻液. 由软件自动统计出白色部分所占的面积比例为X，如图 3所示. 由于藻细胞为球形，则气囊体积分数为Y=( X )³. 每种压力作用下选用15张照片进行分析，取平均值，得到不同压力下藻细胞中剩余气囊所占体积比例.

图 3

Fig. 3

图 3 藻细胞超薄切片照片 Fig. 3 Pictures of algal cell's ultrathin sections

藻类气囊体积分数的压力毛细管法委托中国环境科学研究院测定，采用与图像分析方法同一批藻类. 将含藻水注入压力毛细管中，用显微镜观察此时毛细管水面所在的刻度位置1[如图 2(b)]. 向毛细管中通入1.2 MPa的压缩氮气，维持一段时间，泄压，用显微镜观察此时毛细管水面刻度位置2[如图 2(c)]. 由于加压后藻细胞气囊破裂，破裂气囊气体运动到水面，使毛细管中水面右移. 根据加压前后毛细管水面位置的变化，计算出气囊的体积ΔV，即为压力管中所有藻细胞气囊的总体积^[12]. 将压力毛细管中藻细胞倒出，用显微镜计数藻细胞个数N. 则压力毛细管法测得的气囊体积分数为Z= 3ΔV 4Nπr³ ，式中r为藻细胞半径. 1.3.4 压力作用后藻类上浮及气囊恢复

(1)不同光照度下藻类上浮

将含藻水经0.7 MPa压力加压，测定初始叶绿素浓度Chl₀. 取加压水样250 mL分别注入7个烧杯中，用白布包裹烧杯，放入光照培养箱中，使各烧杯中的光照度分别为0、 500、 1000、 1500、 2000、 5000、 8000 lx. 模仿自然界白天黑夜比控制光照的开关，培养温度25℃. 在初始时刻，藻类均沉淀于杯底，培养24 h后，提取上清液200 mL，混匀测定叶绿素浓度Chl_t，计算藻类上浮比例F=Chl_t/Chl₀.

(2)不同培养时间后藻类上浮

采用与(1)相同的含藻水进行实验，将含藻水注入透光率相同的烧杯中，放置在光照培养箱中，分别培养16、 32、 40、 52、 64 h，提取上清液测定叶绿素浓度，分别计算藻类上浮比例. 该实验共进行3组，3组培养的光照度分别为1000、 2000、 8000 lx. 模仿自然界白天黑夜比控制光照的开关，培养温度25℃.

(3)压力作用后藻类气囊恢复

将经过0.7 MPa加压的含藻水样250 mL分别注入3个烧杯中，放入光照培养箱中，控制光照度1000 lx. 模仿自然界白天黑夜比控制光照的开关，培养温度25℃. 于8、 24、 48 h各取一个烧杯中上浮的藻类，进行超薄切片透射电镜扫描.

2 结果与讨论 2.1 压力作用后藻类气囊体积分数

藻细胞超薄切片扫描电镜如图 4所示，从中可见，原始藻类中存在蜂窝状白色气囊，黑色部分为藻液. 经0.3~0.5 MPa压力加压后部分气囊消失，气囊逐步减少; 经0.6~0.7 MPa压力加压后已看不到明显的气囊，破裂后的气囊气体溶解到细胞液中，或扩散渗透到细胞壁外. 对每种压力作用后的藻细胞超薄切片扫描图进行图像分析，得出残余气囊体积分数，15个细胞气囊体积分数的平均值见表 1. 随着压力的增大，藻类气囊逐渐破裂，细胞内气囊体积逐渐减少.

图 4

Fig. 4

图 4 不同压力作用后藻细胞内气囊形态比较 Fig. 4 Comparison of gas vesicles morphology after different pressures

表 1(Table 1)

表 1 不同压力作用下藻类残余气囊体积 Table 1 Remaining volume fraction of gas vesicles for different pressure 压力/MPa 图像分析法 压力毛细管 Y/Z 气囊体积分数Y/% 均方差 气囊体积分数Y/% 均方差 0.0 29.52 0.067 10.93 0.0067 2.7 0.3 5.73 0.026 1.14 0.0028 5.03 0.4 4.43 0.022 0.90 0.0012 5.38 0.5 2.71 0.022 0.27 0.0001 10.04 0.6 2.46 0.014 0.14 0.0002 17.57 0.7 2.19 0.010 0.04 0.0001 54.75

表 1 不同压力作用下藻类残余气囊体积 Table 1 Remaining volume fraction of gas vesicles for different pressure

利用藻细胞超薄切片电镜扫描图，统计计算出藻细胞平均直径d=4.12 μm，平均体积V=37.7 μm³. 从而可计算出压力毛细管法气囊体积分数Z， 结果如表 1. 两种方法测定结果比较两种方法测得的气囊体积分数比较如图 5所示. 从中可见，采用图像分析法得到的气囊体积分数比传统的压力毛细管法大得多，自然常压下图像分析法测得的气囊体积是压力毛细管法的2.7倍. 产生这种差别的原因可以结合图 6进行说明.

图 5

Fig. 5

图 5 藻类残余气囊体积分数随压力的变化 Fig. 5 Changes of the remaining volume fraction of gas vesicles as pressure

压力作用后气囊破裂，气体首先溶解到藻液中，其中一部分透过细胞壁进入到水体中，进入水体的气体一部分溶解于水中，另一部分上浮到水面. 图像分析法测得的是图 6(a)中气囊的体积，压力毛细管法测得的是图 6(d)中从水中上浮到水面的气体体积. 压力毛细管法认为，毛细管中水体与藻细胞中气体发生了位置交换，水进入了藻细胞，气囊到达了液面以上，因而毛细管液面发生了移动.

由此可见，上述两种方法从不同角度反映了藻类气囊体积分数，图像分析法测得的是藻细胞内固有的气囊体积，而毛细管法测得的是能释放到水体表面的气囊体积.

图 6

Fig. 6

图 6 压力作用后藻细胞气囊破裂与扩散转移 Fig. 6 Transfer and spread of gas in the gas vesicles of algae cells

(1)不同光照度下藻类上浮特性

加压藻在不同光照度下经过24 h培养，藻类都发生了不同程度的上浮，上浮比例如图 7所示. 从中可见，光照度为500 lx时，藻类上浮比例最大，增大或减小光照度均不利于藻类上浮. 沉淀藻类的再上浮受两方面因素控制，一是藻类气囊的重新组装而增加浮力，二是藻细胞光合作用合成淀粉类物质而增加重量. 当光照度较弱时，合成物质较少，重量轻，易上浮. 光照度较强时，合成物质多，重量大，同时渗透压增加，易导致气囊的破裂，因而上浮少. 因此，减小或增大光照度均不利于藻类的上浮，与经典的浮力调节机制是一致的^[25].

图 7

Fig. 7

图 7 藻类上浮比例随光照度的变化 Fig. 7 Changes of the algae floating rate as the luminous intensity

(2)不同培养时间后藻类上浮特性

加压藻在不同培养时间后上浮情况如图 8所示. 从趋势线看，培养8 h后藻类发生了上浮，在光照度1000 lx和2000 lx时，藻类上浮比例均随着时间的延长呈线性增加，1000 lx光照度下增加幅度大于2000 lx光照度，培养64 h后上浮比例达到71%. 而8000 lx光照度下，藻类基本没有上浮. 这一现象仍然是由于高光照度下光合作用合成大量淀粉物质，增大了藻类的重量，同时渗透压增加，易导致气囊的破裂，不能产生足够的浮力而造成的.

图 8

Fig. 8

图 8 藻类上浮比例随培养时间的变化 Fig. 8 Changes of the algae floating rate with time

(3)加压藻气囊恢复

对经过8~48 h培养的加压藻进行细胞切片，结果如图 9所示，在0.7 MPa压力作用下，藻细胞内部的气囊完全破裂，随着培养时间的延长，恢复气囊逐步增多. 经图像分析得到，培养8、 24、 48 h后藻细胞内气囊占加压前气囊总体积比例分别为31.02%、 45.68%、 81.05%，气囊的堆叠结构也得到恢复. 加压后蓝藻气囊的消失与再恢复现象可以做如下两种解释，一种是气囊的破裂与再生，传统观点认为，外压超过0.4~0.7 MPa后气囊就不可逆转地破裂，因而培养后产生的气囊是新生长的. 笔者认为还存在另一种可能，即气囊的泄气与充气过程，加压后由于外压压缩气囊，使气体透过蛋白质壁而进入藻液中，再透过细胞壁扩散到水中，气囊变得空瘪，气囊壁并未破裂，随着藻类光合作用的进行，不断放出氧气进入气囊内部，气囊又如充气的气球变得饱满.

图 9

Fig. 9

图 9 气囊随着时间再生情况 Fig. 9 Reformation of gas vesicles with time

(1)采用透射电镜图像分析法测得太湖蓝藻经0、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7 MPa加压后，藻细胞内的气囊体积占细胞体积的比例分别为29.52%、 5.73%、 4.43%、 2.71%、 2.46%、 2.19%. 传统的压力毛细管法测得的气囊体积比为10.93%、 1.14%、 0.90%、 0.27%、 0.14%、 0.04%. 两种测定方法表达了不同内涵的气囊体积，透射电镜图像分析法表达的是藻细胞内气囊总体积，压力毛细管法表达的是经1.2 MPa加压后，破裂气囊气体扩散分离到水面的体积.

(2)加压后失去浮力而下沉的蓝藻，经过8 h培养后会重新上浮，且时间越长上浮越多. 在500 lx光照度下最容易上浮，8000 lx光照度下基本不上浮.

(3)压力作用后藻细胞气囊随着时间逐渐再生，在培养8、 24、 48 h后，藻细胞再生气囊占加压前气囊总体积的比例分别为31.02%、 45.68%、 81.05%.