低成本减少水体氮素污染，是生物处理工艺面对的挑战. 传统生物脱氮工艺，存在供氧动力消耗大，需投加有机碳源，产生大量剩余污泥和温室气体(CO₂)等先天性不足，并且由于硝化菌和聚磷菌在污泥停留时间和碳源的需求上存在着竞争，使得氮、 磷的高效去除很难同时达标排放，且投资成本和运行费用高^{[1, 2]}. 半短程亚硝化与厌氧氨氧化联合脱氮工艺是20世纪90年代发展起来的一种新型高效脱氮工艺，与传统脱氮工艺相比，脱氮工艺反应途径较短，减少供氧量，不需要碱度和有机碳源的投加，大大节约了能源和运行成本^{[3, 4]}. 因此该工艺与其伴随的氨氧化菌与厌氧氨氧化菌的有关研究吸引了许多国内外学者的关注. 本文综述了该工艺特性并重点介绍了该工艺中的微生物特征,并对应用前景提出展望.

1 新型的脱氮工艺

要想将ANAMMOX工艺，应用于实际废水的生物脱氮，首先必须解决合适的基质来源问题. 这就需要建立ANAMMOX菌和其它微生物的协同作用系统，或者与其它工艺进行组合运行. 基于以上思路，目前已开发出的ANAMMOX生物脱氮工艺主要有：SHARON-ANAMMOX联合工艺^{[5, 6]}、 CANON工艺^{[7, 8]}等.

Single Reactor for High Ammonium Removal Over Nitrite-ANAMMOX，该工艺是荷兰Delft技术大学开

发的一种新型的脱氮工艺^[9]，该工艺反应式即：

该组合工艺首先用于处理鹿特丹 Dokhaven 污水处理厂的污泥消化上清液，SHARON采用10 L 的 CSTR 反应器，水力停留时间(HRT)为1 d，53％的氨氮转为 NO^-₂，无NO^-₃形成. ANAMMOX 采用 SBR 反应器，在氮负荷为1.2 kg ·(m³ ·d)^-1 时，超过80％的氨氮被转化为 N₂^[10]. Dapena-mora等^[11]试验表明，SHARON-ANAMMOX 可以用于处理高氨氮和高盐度的工业废水，氨氧化菌将氨氧化到亚硝酸盐阶段； 随后 ANAMMOX 菌将剩余的氨离子和生成的亚硝酸根离子转化成 N₂，从而实现自养脱氮. 系统平均氨氮去除率达68％. 与传统生物脱氮工艺相比，优点较多，具有较高的实用推广价值.

该工艺是指在生物膜或单个反应器内，通过控制较低DO浓度来实现短程硝化和ANAMMOX，从而达到脱氮的目的. CANON反应已在实验中得到验证^{[12, 13]}. 其主要进行好氧氨氧化作用[式(3)]和ANAMMOX作用[式(4)]，总反应过程[式(5)]可表示为：

CANON 工艺的主要优点：两个反应过程在一个反应器中同时进行，缩短了工艺流程； 硝化过程控制在亚硝化阶段，供氧量减少大约25%； 可以缩短 HRT，减少反应器的体积和占地面积.

CANON工艺的主要缺点：单级反应器所能达到的全程自养脱氮效率较亚硝化-ANAMMOX 组合工艺要低； 运行条件如温度、 氨表面负荷等对脱氮效果有较大影响，从而不易控制； 工艺运行的稳定性差^{[14, 15]}.

半短程亚硝化ANAMMOX 工艺包含两个生物过程,废水中约50%的氨氮首先在AOB的作用下，在好氧条件下被氧化为亚硝酸氮； 随后短程硝化器的出水(包含生成的亚硝酸氮和未反应完的氨氮)作为 ANAMMOX 反应器的进水,ANAMMOX菌在厌氧条件下,以亚硝酸氮为电子受体和氨氮作为直接电子供体反应生成氮气，达到废水中氨氮的全程自养脱氮^{[16, 17]}. 在半短程硝化- ANAMMOX 联合工艺过程中，脱氮作用的微生物包括氨氧化菌与ANAMMOX菌^{[18, 19]}.

半短程硝化-ANAMMOX工艺中需要将部分氨氮氧化为亚硝酸盐氮，然后此亚硝酸盐氮再氧化剩余部分的氨氮，实现脱氮 (图 1)^[20].

图 1

Fig. 1

图 1 传统硝化反硝化生物脱氮与短程硝化/厌氧氨氧化自养生物脱氮工艺比较Fig. 1 Comparison of nitrification/heterotrophic denitrification with the autotrophic nitritation/anammox process

该工艺只需消耗0.8 mol的氧气； 无需有机物作为碳源，直接利用二氧化碳为碳源； 该工艺是全程自养脱氮，因此污泥产生量低，减少污泥处置的费用. 该工艺可节省60％的供氧能耗； 由于无需外加碳源，也节省了外加碳源所增加的运行费用. 此外ANAMMOX 菌以二氧化碳为碳源，在代谢途径中没有N₂ O等中间产物，因此也减少了温室气体的排放.

这些新工艺都力求缩短“氮”的转化途径和过程，就是将亚硝酸盐氧化菌 (NOB) 从反应器中淘洗掉，同时将AOB有效保留在反应器中，从而实现把氨氮氧化为亚硝酸盐，而不再继续被氧化为硝酸盐. 要想实现NOB被淘洗，首先使反应器内AOB的增长率大于NOB的增率，通过适当的工艺运行条件将反应器内的NOB逐渐淘洗出去.

2 影响亚硝酸盐积累与菌群增长的因素 2.1 温度

祖波等^[21]研究发现温度为30℃时，氨氧化速率最大，25℃和35℃时依次降低，在温度大于15℃时，适于亚硝酸盐的积累，但只有当温度大于15℃时，亚硝酸盐积累才有竞争优势. 在低温条件下AOB的最小污泥龄大于NOB的最小污泥龄，而在高温条件下AOB的最小污泥龄明显小于NOB的最小污泥龄，因此在该条件下可通过调整污泥龄来达到淘洗掉NOB的目的，这也解释了夏天为何更容易出现亚硝酸盐积累的情况. SHARON 工艺利用这一特点，在温度30～35℃条件下，AOB的生长率明显快于NOB的生长率，水力停留时间 (HRT) 介于NOB和AOB的最小停留时间之间，而使AOB得到积累NOB被逐渐淘汰，以维持稳定的亚硝酸积累.

近来研究认为^[22]，在温度28~38℃下，NOB的最小倍增时间要小于AOB，是最佳的脱氮温度. 杨洋等^[23]在 pH值为8.2、 起始NH⁺₄-N和NO^-₂-N质量浓度均为200 mg ·L^-1、 污泥质量浓度(VSS)约为1.6 g ·L^-1的试验条件下，控制反应温度为30～35℃时,ANAOB反应速率最高，温度升至40℃时，反应活性明显下降，反应最适温度为30～35℃，在水温65℃的仍有ANAOB存在； 且在水温为52℃时ANAOB为 Candidatus Brocadia fulgida、 Candidatus Brocadia anammoxidans 及 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis^[24].

硝化反应是好氧过程，必须在有氧条件下才能进行. Perez 等^[25]研究发现氨氧化反应主要发生在前面两个曝气池，而亚硝酸盐氧化反应主要发生在最后面曝气池，认为AOB 对氧亲和力大于NOB对氧亲和力，因此造成此现象的发生. Kornaros 等^[26]认为由缺氧转入好氧环境时，AOB可以立即以最大生长速率增长，而NOB需要一定的恢复时间才可以达到其最大的生长速率. 当系统中DO的浓度低于0.5 mg ·L^-1 时，AOB的亚硝化速率没有明显受到抑制，主要因为AOB产率快速增长抵消了低DO对氨氧化速率降低的影响，而NOB的产率和氧化亚硝态氮的速率却没有因溶解氧的降低而提高，且受到明显抑制^{[27, 28]}. ANAMMOX是严格的厌氧反应，ANAOB对氧气很敏感，当DO>2 μmol ·L^-1，ANAOB的活性会完全被抑制，这种抑制是可逆的.

废水中的氨根据不同的 pH 值，分别以离子态和分子态的形式存在. 分子态游离氨 (FA) 对硝化作用有着明显的抑制作用，而NOB比AOB更易受到 FA 的抑制，因此 FA 会抑制亚硝酸盐氧化成硝酸盐^[29]. 研究发现当 FA 浓度为1.0~5.0 mg ·L^-1时，对硝化反应发生抑制作用，而对亚硝化反应不产生影响； 当 FA 浓度为24 mg ·L^-1 时，则硝化反应被完全抑制^{[30, 31]}. 因此，要保证氨氧化反应的正常进行，就要控制系统中 FA 的浓度介于亚硝酸盐氧化菌抑制浓度和氨氧化菌抑制浓度之间. pH 值对AOB和NOB也有明显的影响，研究发现AOB的最适宜的 pH 值为7.0~8.6，而NOB的 pH 值范围是7.7~8.1，pH在8.0附近时，NO^-₂-N的生成速率最大，而NO^-₃-N 的生成速率在pH 为7.0 附近为最大^{[32, 33]}. 利用AOB和NOB的最适 pH 值不同，控制混合液的 pH 值，从而得到亚硝态氮的积累. 研究发现当 pH 为 (7.5±0.22) 时,AOB浓度开始降低，当 pH 提高到9.3±0.24后，AOB浓度降低非常明显^{[34, 35]}.

由于氨氮的硝化速率比亚硝氮的氧化速率明显快，当温度高于15℃时，AOB的世代周期比NOB的短. 因此，可以通过控制系统的污泥龄而实现亚硝酸型硝化，使泥龄介于AOB和NOB的最小停留时间之间，使得系统中NOB逐渐被冲洗掉，AOB成为系统优势菌. 一般认为当供氧没有限制时，污泥龄是影响氨氧化菌增长的主要因素，控制污泥停留时间(SRT) 在10 d 左右，可以有效地促进氨氧化菌的增长.

3 氨氧化菌与厌氧氨氧化菌的研究 3.1 氨氧化菌的研究 3.1.1 氨氧化菌的分类及分布

AOB是一类能够在好氧条件下将氨氧化为亚硝酸盐的化能无机自养型细菌，广泛存在于自然环境中，所有的AOB、 NOB均属于变形菌纲 Proteobacteria 的β和γ亚纲. R 亚纲好氧氨氧化菌适合在海洋环境生长，主要是 Nitrosococci 属，该属由3 种亲缘关系密切的 Nitrosococcus 组成,Nitrosococcus oceanus、 Nitrosococcus halophilus^[36]. β亚纲的亚硝化细菌又可分为两个类群：亚硝化单胞菌群(Nitrosomonas) 和亚硝化螺菌群(Nitrosospira). β-Proteobacteria 亚纲至少可以分为7个Cluster,如图 2^{[37, 38]}.

图 2

Fig. 2

图 2 依据16S rRNA基因序列构建的氨氧化细菌的系统发育分类Fig. 2 Phylogenetic relationships according to AOB 16S rDNA gene

3.1.2 氨氧化菌的研究应用

AOB又名亚硝酸化菌，其氧饱和常数一般为0.2～0.4 mg ·L^-1； NOB又名硝酸化菌，其氧饱和常数为1.2～1.5 mg ·L^-1. 在污水处理中，低DO下亚硝酸氮大量积累的原因主要是由于亚硝酸化菌对 DO 的亲和力要比硝化菌强^[39].

Qin等^[40]发现在膜生物反应器处理污水工艺中，DO 浓度较高的生物膜外侧主要聚集着 Nitrosomonas europaea 和 Nitrosomonas oligotropha 的氨氧化细菌，少数为 Nitrosomonas communis，而 Nitrosospire-like却偶尔存在； 而在 DO 浓度低的内侧则只有 Nitrosomonas oligotropha 细菌的存在，Qin等也发现在溶解氧低氧区域有Nitrosomonas mobilis 和 Nitrosomonas europaea/eutropha 细菌的共存现象，并推测这可能是不同类型氨氧化细菌AOB的共生作用. 其中，Nitrosomonas mobilis 细菌对氧气有较高的亲和力，而 Nitrosomonas europaea/eutropha 相关细菌优先利用亚硝酸盐为电子受体进行氨氧化作用，在低 DO 时表现出厌氧氨氧化活性. Kuai 等^[41]和Lydmark等^[42]在对处理高氨氮废水的生物反应器中微生物多样性的研究中发现：低 DO 条件出现了氮损失，而主要的AOB是类 Nitrosomonas europaea.

目前发现的ANAOB有5个属，9个种，全部为自养菌 (图 3)^[43]，各种分别为待定黑海阶梯烷菌 (Candidatus Scalindua sorokinii)、 待定厌氧氨氧化布罗卡地菌 (Candidatus Brocadia anammoxidans)、 待定硫酸盐厌氧氨氧化球菌 (Candidatus Anammox ogobussulfate)^[44]、 待定荧光布罗卡地菌 (Candidatus Brocadia fulgida)、 待定丙酸厌氧氨氧化球菌 (Candidatus Anammox oglobus propionicus)、 待定韦格氏阶梯烷菌 (Candidatus Scalindua wagneri)、 待定布罗达氏阶梯烷菌 (Candidatus Scalindua brodae)、 待定亚洲杰特氏菌 (Candidatus Jettenia asiatica)、 待定斯图加特库氏菌 (Candidatus Kuenenia stuttgartiensis). 由于厌氧氨氧化同时需要亚硝酸和氨两种基质，在运行工艺中，当 DO 较低时，ANAOB可与好氧AOB共存，互惠互利. 好氧AOB产生的亚硝酸用作ANAOB的基质，而ANAOB消耗亚硝酸，可解除亚硝酸对好氧AOB的抑制^[45].

图 3

Fig. 3

图 3 依据16S rRNA基因序列构建的厌氧氨氧化细菌的系统发育分类Fig. 3 Phylogenetic relationships according to the 16S rDNA gene of ANAMMOX bacteria

3.2.2 厌氧氨氧化菌的代谢途径

根据同位素示踪及ANAOB基因组分析，其代谢机制为：第一步在亚硝酸盐氮氧化还原酶(NIR)的作用下，把NO^-₂还原为NO，同时吸收1个低能量电子； 然后在联氨水解酶的作用下，NO氧化NH⁺₄产生联氨N₂H₄，该过程吸收3个低能量的电子； 联氨再提供电子产生还原态的铁氧还原酶，同时释放出4个高能量电子. 这些电子用于能量转化和产生质子运动势(PMF). 经过电子传递后的电子失去了能量，将进入下一个联氨合成的循环[图 4(a)]. PMF可以激活位于厌氧氨氧化胞膜上的ATP酶产生ATP. 还原态的铁氧化还原酶可为CO₂固定的乙酰辅酶A途径提供电子. 在乙酰辅酶A途径中失去的电子由NO^-₂-N氧化为NO^-₃-N的氧化反应来补充. 此氧化反应中产生的电子为低能量的电子需要通过PMF驱动进行反向电子传递[图 4(b)]^{[46, 47]}.

图 4

Fig. 4

(a)利用亚硝酸盐氮作为电子受体的氨氧化代谢途径； (b)硝酸盐氮还原酶产生乙酰辅酶A循环中二氧化碳还原所需的铁氧还原酶图 4 厌氧氨氧化菌代谢及电子传递途径Fig. 4 Catabolism and reversed electron transport in the anammoxosome of anammox bacteria

Kartal 等^[48]以同位素示踪方法研究了 Candidatus “Kuenenia stuttgartiensis” 的异样代谢途径. 试验结果证明厌氧氨氧化菌 Candidatus “Kuenenia stuttgartiensis” 可以利用甲酸盐作为碳源，将¹⁵ NO^-₃还原为¹⁵ NO^-₂，进而再还原为¹⁵ NH⁺₄，随后利用¹⁵ NO^-₂氧化¹⁵ NH⁺₄生成¹⁵ N.

在厌氧菌方面，陈婷婷等发现发生厌氧氨氧化反应的前提条件是氨和亚硝酸盐同时存在，且没有氧存在，在湖泊底泥的好氧/缺氧界面上，氨和亚硝酸经常共存，是ANAOB的良好生境^[49]. 陈永等^[50]研究结果表明，当NO^-₂浓度大于84.4 mg ·L^-1 时，ANAOB对TN的去除率明显下降，因此厌氧氨氧化过程受到抑制. 周少奇^[51]研究发现ANAOB在淡水生态系统中分布广，近来也发现ANAOB在海洋的氮循环起着很重要的作用. 在自然界高盐生态系统中已发现的厌氧氨氧化种群属于Candidatus “Scalindua sorokinii”，其它种群发现在淡水系统中. Tsushima等^[52]则报道ANAOB对NO^-₂的适应质量浓度可达710 mg ·L^-1，这可能是由于反应器中富集了高浓度ANAOB的原因. Kartal等^[53]采用SBR反应器对淡水厌氧氨氧化菌株进行了高盐废水的逐步驯化试验. 试验表明淡水厌氧氨氧化菌株能逐渐适应高盐废水，并且盐质量浓度可以达到30 g ·L^-1. 此外,也有研究发现ANAOB可以用来处理高氨氮高生物毒性的垃圾渗滤液^{[54, 55]}. Lotti 等^[56]研究表明当亚硝态氮浓度为400 mg ·L^-1时，厌氧氨氧化活性降低50%，而且这种抑制可以迅速得到恢复，认为亚硝酸盐而非游离亚硝酸是真正的抑制剂.

4 氨氧化菌与厌氧氨氧化菌16S rDNA和功能基因引物比较 4.1 氨氧化菌16S rDNA和功能基因引物比较

废水处理中的AOB主要属于β-变形菌亚纲(β-AOB)，在研究废水处理中的AOB特性时，由于引物不同扩增的目的片段有很大差异引物，所以为了深入研究氨氧化菌的类型，比较了不同引物所扩增的菌群. 李霜等^[57]用 NitF/NitR扩增城市污水提取的DNA,结果与Nitrosomonas europaea 具有98.9％的相似性，Nitrosomonas nitrosa 具有99.3%的同源性. Kowalchuk等^[58]做变形梯度凝胶电泳(DGGE),用不同的正向引物 (CTO189 FA/B-GC,CTO189 FC-GC)，每一个引物前面加一个GC夹子(31个碱基). 正向引物分别为 CTO189 FA/B,CTO189 FC-GC. 相同的反向引物 CTO654 R，这些引物扩增出465 bp氨氧化细菌16S rDNA的片段. 经鉴定这些引物扩增结果为 Nitrosospira briensis、 Nitrosospira-like，Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas-like. 吴宇澄等^[59]试验证明以16S rDNA通用引物作为第一轮引物，以CTO作为第二轮引物的巢式 PCR 可以提高扩增的敏感性，特异性也较好. David 等^[60]用 Nspra-675 F/Nspra-746 R扩增 Nitrospira spp.. 为了分析污水处理系统中氨氧化细菌的种群组成，筛选合成了一对氨氧化细菌 amoA 基因特异结合的引物序列，Hang等^[61]用 amoA-1 F/amoA-2 R来扩增功能基因片段(491bp)，得到全部为目地片段，该引物特异性较好. 各引物的详细序列如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 氨氧化菌引物及特征Table 1 Primers and characteristics of AOB 引物名称 特异性 序列5′-3′ NitF Nitrosomonas europaea ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT NitR 与Nitrosomonas nitrosa GGACTACCAGGGTATCTAATCC CTO189fA/B-GC Nitrosospira briensis CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGG GGGGAGRAAAGCAGGGGATCG CTO654r Nitrosospira-like CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC CTO189fC-GC Nitrosomonas europaea Nitrosomonas-like CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGAGGAAAGTAGGGGATCG CTO654r CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC Nspra-675f Nitrospira spp. GCGGTGAA ATGCGTAGAKATCG Nspra-746r TCAGCGTCAGRWAYGTTC CAGAG amoA-1F 功能基因 GGGGTTTCTACTGGTGGT amoA-2R CCCCTCKGS AAAGCCTTCTTC

表 1 氨氧化菌引物及特征Table 1 Primers and characteristics of AOB

4.2 厌氧氨氧化菌16S rDNA和功能基因引物比较

目前采用传统的微生物分离培养方法还未分离纯化出厌氧氨氧化菌，但分子生物学方法在一定程度上可以克服这些局限性，成为当前研究厌氧氨氧化菌的重要手段^[62]，但不同引物得到效果不同. 几种不同的引物已经被用来测定不同环境中的不同的厌氧氨氧化菌. Schmid 等^[63]采用通用引物27 F/1492 R(表 2)进行 PCR 扩增，浮霉菌属出现较少，效果较差. 采用特异引物 Pla46 F/1037 R 对取自生物滤池中的厌氧氨氧化污泥样品进行分子生物学鉴定，并确定了其在细菌系统进化树中属于分支较深的浮霉细菌(Planctomycetes)命名为Cadidatus Brocadia anammoxidan. 采用 Pla46 F/1390 R 或630 R构建16S rDNA克隆文库，库中浮霉菌属明显增加^[64]. 因此特异性引物对16S rDNA的扩增是十分必要的，应用不同的引物可能得到不同的厌氧氨氧化菌的微生物^[65]. Schmid 等^[66]和Bae等^[67]用正向引物 Pla46 F,反向引物 Amx820 R扩增得到 Brocadia-like； 反向引物 Amx368 R 扩增得到所有已知的厌氧氨氧化菌. 并且用Pla46 F/Amx368 R 试验鉴定了10个不同的污水样品，得到了5种厌氧氨氧化菌的16S rDNA，研究证明这种引物的特异性较强. 通过以上研究说明，恰当的引物能很好把不同的厌氧氨氧化成功分离. 同时为了更好地了解厌氧氨氧化菌，人们对厌氧氨氧化菌的功能基因也进行可深入的研究，研究表明厌氧氨氧化菌中联氨氧化还原酶基因在脱氮反应工艺中起着重要作用^[68]. 各引物的详细序列如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 厌氧氨氧化菌引物及特征Table 2 Primers and characteristics of ANAMMOX 引物名称 特异性 序列5′-3′ 27f 细菌 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1492r TACGGYTACCTTGTTACGACTT Pla46 Candidatus “Brocadia” 和Candidatus “Kuenenia” GACTTGCATGCCTAATCC Amx820R AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC Pla46 浮霉菌门 GACTTGCATGCCTAATCC Amx 1390 GACGGGCGGTGTGTACAA Pla46 浮霉菌门 GACTTGCATGCCTAATCC 630R CAKAAAGGAGGTGATCC Pla46 所有厌氧氨氧化生物 CCTTTCGGGCATTGCGAA Amx368 Pla46 GACTTGCATGCCTAATCC Amx 1114 Scalindua-like 细菌 CCCGCTGGTAACTAAAAACAAG hzocl1F1 功能基因 TGYAAGACYTGYCAYTGG hzocl1R2 ACTCCAGATRTGCTGACC hzocl1F2 功能基因 TGYAAGACYTGYCAYTGGG hzocl1R2 ACTCCAGATRTGCTGACC

表 2 厌氧氨氧化菌引物及特征Table 2 Primers and characteristics of ANAMMOX

半短程亚硝化与厌氧氨氧化工艺是一种全新的生物脱氮工艺，与传统的生物脱氮工艺相比具有十分明显的优势，国外特别是荷兰 Delft 大学和 Schmid 等对其进行了较深入的研究，国内哈尔滨工业大学也开展了一定的研究，但在这些研究中该工艺多数是用于处理含有较高浓度氨氮的废水，如污泥消化后的上清液或填埋场的渗滤液. 因此迫切需要寻找和开发适合于低浓度废水的高效生物脱氮工艺，因此在国内进行低浓度下短程硝化与厌氧氨氧化联合脱氮工艺的研究具有极大的理论意义和应用前景.