2014, Vol. 35
氯酚类化合物(chlorophenols，CPs)是一种中等强度的化学毒物，能够引起蛋白质变性，使细胞中毒或死亡[1]，其中2,4-二氯酚(2,4-dichlorophenol，2,4-DCP)、 2,4,6-三氯酚(2,4,6-trichlorophenol，2,4,6-TCP)和五氯酚(pentachlorophenol，PCP)已被美国和欧盟列为优先监测的有机污染物[2,3]，对水生生物的生长、 繁殖等方面具有重要影响，其大量使用已对人类健康构成严重威胁[4,5]. 此外，作为我国水域重要的污染物，3种氯酚在食物链高营养级水平如杜氏盐藻[6]、 大型溞[7]、 河蚬[8]等的单一及联合毒性已有许多报道.
嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)作为一种淡水中常见的单细胞真核原生动物，不仅生长周期短，而且对许多毒物的响应比其他高等生物更为敏感、 直接，是理想的生物毒性试验对象[9]，其胞核结构功能复杂程度与多细胞动物相似，与其它真核微生物模式生物相比(如真菌)，四膜虫和人类具有较高程度的功能保守性[10,11]. 已有研究表明，部分重金属[12,13] 和有机农药[14]对四膜虫具有急性毒性，其中黄卫红等[15]研究得出2,4-DCP和2,4,6-TCP对四膜虫急性毒性48 h EC50分别为1849 μg ·L-1和916 μg ·L-1，但目前尚无环境因子，如硬度与氯酚对四膜虫的复合毒性研究.
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophotrsis,SCGE)，又名彗星实验(comet assay)，是测定单个细胞DNA链断裂的新电泳技术[16,17]，近年来开始利用彗星实验研究毒物对四膜虫DNA的损伤，如Lah等[18]测定了酚类、 甲醛、 H2O2对四膜虫DNA不同程度的损伤，有研究认为部分含氮杂环化合物及重金属Cd2+能引起四膜虫核DNA 损伤而表现出毒性作用[19,20]. 目前有关氯酚类化合物对四膜虫的遗传毒性未见报道.
本研究以噬热四膜虫作为受试生物，通过急性毒性和彗星实验，探讨了3种氯酚的急性毒性及遗传毒性效应，同时研究了水体硬度对3种氯酚生物毒性的影响，以期为我国氯酚化合物的生态风险评价提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 实验材料嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)由南京大学环境学院重点实验室提供. 四膜虫培养基为胰蛋白胨15 g，酵母粉5 g，葡萄糖1 g，超纯水1000 mL，自然pH下121℃灭菌20 min，冷却备用. 实验时分装于250 mL锥形瓶中各100 mL，以4%接种量接种，接种密度为每毫升1～2×104个细胞，28℃静置培养约48 h至对数生长期后用于实验.
1.2 受试化合物2,4-DCP、 2,4,6-TCP和PCP购自Acros Organics和Sigma-Aldrich公司，纯度均为98%，分别用二甲基亚砜(DMSO，纯度≥99%，南京化学试剂有限公司)配制成母液置4℃冰箱避光保存，实验时稀释成所需浓度. 低熔点琼脂糖(LMA)、 正常熔点琼脂糖(NMA)购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA). 其余试剂均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司.
1.3 实验方法 1.3.1 单一氯酚的急性毒性取四膜虫培养液9 mL装至25 mL 比色管中，根据预实验结果加入1 mL 稀释好的不同浓度受试化合物，按等差间距设置7个以上浓度梯度，使培养体系中2,4-DCP和2,4,6-TCP的最终浓度为0.10~2.80 mg ·L-1，PCP 的最终浓度为0.05~2.50 mg ·L-1. 同时加最大浓度组DMSO 设为阴性对照，每个浓度3个平行，分别于24、 48、 72 和96 h进行细胞计数，实验重复3次.
1.3.2 不同硬度下氯酚的急性毒性用CaCl2溶液调节培养基硬度使之分别为50、 150、 250、 350和450 mg ·L-1(以CaCO3计)，实验步骤同上，分别于24和48 h计数，用经验概率单位-浓度对数法计算EC50.
1.3.3 彗星实验3500 r ·min-1离心四膜虫培养液20 min，弃上清，将沉淀重悬浮为原培养液体积的1/10. 取细胞悬液分装于1.5 mL离心管，依次加入3种氯酚，使2,4-DCP和2,4,6-TCP的最终浓度为1.20、 2.40和3.60 mg ·L-1，PCP的最终浓度为0.08、 0.17和0.25 mg ·L-1，同时设阴性对照.
常温下染毒30 min后进行彗星实验，每个处理3片凝胶. 常规方法制片后将载片浸入新配制的细胞裂解液(2.5 mol ·L-1 NaCl，100 mol ·L-1 Na2-EDTA，10 mol ·L-1 Tris，1% TritonX-100和10% DMSO，pH 10)，4℃下避光裂解1.5 h. 碱性电泳液(pH 13)静止解旋20 min后，于15 V，180 mA下电泳20 min. 电泳完毕后中性缓冲液(0.4 mol ·L-1 Tris)中和，以溴化乙锭染色，荧光显微镜(BX41，Olympus)下观察并获取图像.
1.4 数据处理Origin 8.5软件进行ANOVA统计分析，将实验组与对照组进行显著性t检验，以P＜0.05作为显著性依据. 彗星图像采用CASP软件分析，选取尾动量(TM)和Olive尾矩(OTM)为评价参数，每张载片至少分析50个细胞.
2 结果与分析 2.1 单一氯酚毒性试验染毒24 h后，2,4-DCP、 2,4,6-TCP和PCP分别在1.40、 1.40和0.70 mg ·L-1浓度下显示明显毒性，表现为细胞增长能力明显下降，出现团缩和死亡，并随浓度增大和时间推移该趋势增强，至96h四膜虫生长繁殖完全被抑制. 由表 1可见，随3种氯酚浓度增大，四膜虫生长抑制率增加，同时随着染毒时间增加，EC50值呈下降趋势，即3种氯酚的毒性作用逐渐增强. 2,4-DCP、 2,4,6-TCP和PCP的48 h EC50值分别为3.54、 2.83和0.45 mg ·L-1，提示PCP对四膜虫的毒性作用最强.
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表 1 3种氯酚对噬热四膜虫的EC50 值 Table 1 Acute toxicity of three chlorophenols to T. thermophila |
不同硬度下3种氯酚对噬热四膜虫的急性毒性结果如表 2所示. 从中可见，随染毒时间增加，3种氯酚EC50值基本呈下降趋势，表明在同一硬度下，随染毒时间增加，毒性作用逐渐增强，相同硬度下3种氯酚毒性大小依次为PCP>2,4,6-TCP>2,4-DCP. 染毒时间相同时，随硬度增大EC50值基本呈现先增大后降低的趋势，但变化不显著. 不同硬度下2,4-DCP、 2,4,6-TCP和PCP的EC50值分别在同一数量级上，可推断硬度对其毒性作用影响不大.
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表 2 不同硬度下3种氯酚对噬热四膜虫的EC50值 Table 2 Effects of hardness on the toxicity of three chlorophenols to T. thermophila |
经CASP统计后，四膜虫在不同浓度2,4-DCP处理下的DNA损伤程度如图 1所示. 从中可见，随2,4-DCP浓度升高，TM和OTM均增加，提示DNA损伤加重. 与对照相比，1.20 mg ·L-1浓度组无显著性差异(P＞0.05)，2.40 mg ·L-1和4.80 mg ·L-1浓度组TM分别增加884.50%和1029.05%，OTM分别增加281.90%和377.14%，呈明显剂量-效应关系.
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图 1 不同浓度2,4-二氯酚对四膜虫的DNA损伤 Fig. 1 Induction of DNA damage in T. thermophila following exposure to different concentrations of 2,4-DCP *表示P<0.05，下同 |
不同浓度2,4,6-TCP处理下四膜虫DNA损伤见图 2，与对照组相比，1.20 mg ·L-1组TM和OTM均无显著性差异(P＞0.05)，浓度升高至2.40 mg ·L-1时TM增加358.97%，OTM增加273.87%，与对照组相比差异显著(P＜0.05). 浓度继续升高至3.60 mg ·L-1时，TM值与对照相比差异不显著(P＞0.05)，OTM值增加84.68%，低于2.40 mg ·L-1组.
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图 2 不同浓度2,4,6-三氯酚对四膜虫的DNA损伤 Fig. 2 Induction of DNA damage in T. thermophila following exposure to different concentrations of 2,4,6-TCP |
由图 3可知，PCP趋势表现与2,4,6-TCP相同，即与对照相比低浓度差异不显著，当浓度升高至0.17 mg ·L-1时TM和OTM分别增加2934.48%和1958.83%，差异极显著(P＜0.05)，表明核DNA 受到严重损伤. 当浓度继续升高达到0.25 mg ·L-1时，TM和OTM均下降，其中TM与对照相比无显著性差异(P＞0.05)，OTM相比对照增加694.12%，四膜虫表现出对PCP损伤的高度敏感性.
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图 3 不同浓度五氯酚对四膜虫的DNA损伤 Fig. 3 Induction of DNA damage in T. thermophila following exposure to different concentrations of PCP |
氯酚类化合物通常包括一个羟基和不同数目的氯原子取代苯环上的氢原子，其分子中氯取代基的数目直接影响其正辛醇/水分配系数(Kow)和溶解度(Sw)等特征参数[21]. 氯酚的分子结构如氯化程度及氯原子和羟基基团的位置对其毒性都有较大影响[22]. 李静等[23]研究显示氯酚对金鱼的毒性随其氯化程度的增加而增加; 张亚辉等[7]的实验表明，3种氯酚对大型溞的毒性表现为PCP>2,4,6-TCP>2,4-DCP，但是也有研究[24]表明氯酚类污染物对小球藻、 大型溞、 鲤鱼和罗非鱼等水生生物的毒性与氯酚苯环上的氯原子取代数无直接关系，只有一氯代酚的毒性明显低于其他多氯代酚的毒性. 本实验以48 h EC50为毒性大小评判标准，得出3种氯酚的毒性大小顺序为 PCP>2,4,6-TCP>2,4-DCP，其中2,4-DCP和2,4,6-TCP的EC50值十分接近，与文献[25]的研究结果相同. 实验结果表明随氯原子数目的增加，毒性增强[26]，这是由于酚类化合物为弱亲电试剂，能与机体内的亲核成分如酶、 DNA等发生亲电作用而破坏机体的正常新陈代谢过程，若苯环上有强吸电子基团(如氯原子)，会使—OH上的电子密度下降，亲电性增强，从而增大毒性，且苯环上取代基的数目越多，酚的毒性越大[27].
水生态系统的环境因子，如pH、 光照、 温度、 浊度等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、 化学和生物过程，从而可能导致不同的生态效应[28]. 实验表明四膜虫生长最适pH为6.8～7.2，小于6.5或者大于7.8时都不利于四膜虫的正常生长繁殖，本研究在pH 6.8~7.2的范围内，只选取能够表征硬度的Ca2+来考察3种CPs对四膜虫的毒性效应. 一般认为，水体硬度通过形成不溶性碳酸盐或为碳酸钙吸收影响重金属的毒性，即溶液中Ca2+、 Mg2+ 等离子浓度的增加能降低重金属的毒性，因此被认为具有保护功能[29]. 现有研究多集中于硬度对重金属毒性的影响，如Kim等[30]研究了铜和酚类化合物的联合毒性，得出了它们之间的络合作用降低了铜和酚类化合物的毒性. 另外有研究表明，在不同水硬度条件下，铜的毒性随水硬度的增加而降低，且半数致死浓度的对数与水硬度对数之间呈线性关系[31]. 对氯酚等有机物污染物而言，其在水体中的生物毒性会受到多个因素的影响[32]，作为重要的环境因子，硬度的变化会改变溶液的离子强度，从而影响毒物在生物体内的吸收和分布，进而影响其毒性[33]，但因CPs 的毒性主要由其分子态贡献[34]，因此代表水体硬度的Ca2+对3种CPs 的毒性影响较小，这也在本实验中得到证明.
3种氯酚化合物均能引起四膜虫的损伤而表现出毒性. 结果显示对2,4-DCP而言低浓度下细胞出现拖尾，与对照相比差异不显著，随受试物浓度增大，尾长增加，表现出明显的剂量-效应关系; 而2,4,6-TCP和PCP在实验最高浓度下TM和OTM与对照相比相对来说较低，实验中观察到该组细胞核数量较少，杂质碎片较多，文献[18, 35, 36]也出现类似现象，这可能是在高浓度受试物作用下，DNA损伤严重，经过实验裂解、 解旋、 电泳等过程后，大部分受损DNA都断裂成小片段而散失到裂解液或电解液中，导致镜检时能够观察到的核数量较少，且残留多为损伤不大的DNA. 另外谷康定等[37]认为四膜虫对毒物损伤的剂量反应表现在较窄范围也是可能的原因. 3种氯酚对四膜虫的遗传毒性结果再次表明其对四膜虫的毒性大小为PCP>2,4,6-TCP>2,4-DCP.
CPs引起细胞DNA损伤的原因可能是CPs在细胞色素的作用下转化为对应的氯代氢醌类化合物，当氢醌类化合物转化为自由基时，会对细胞DNA产生损伤，如Vatsis等[38]发现对氯苯酚在细胞色素P450 2E1的作用下会转化为对苯二酚; Hoffman等[39]则证明四氯氢醌在转化为自由基的过程中引起DAN损伤. 也有研究认为CPs能够影响机体的抗氧化防御系统[40]，促进自由基的产生和细胞组分的氧化状态，引起DNA氧化损伤，如Bukowska[41]通过研究发现，2,4-DCP能够引起机体消耗谷胱甘肽以及超氧化物歧化酶，导致活性氧的增加并引起氧化损伤; 此外Giri等[42]提出很多化合物本身带电，可与大分子化合物如DNA结合，从而对其产生损伤，这可能也是造成细胞DNA损伤的原因之一.
4 结论(1)3种氯酚对四膜虫的毒性大小为PCP>2,4,6-TCP>2,4-DCP，表明随着氯原子数目的增加，毒性增强.
(2)随着Ca2+浓度的增大，3种氯酚对四膜虫的急性毒性表现为先降低后增加的趋势，但因氯酚的毒性主要由其分子态贡献，水体硬度的Ca2+对3种CPs 的毒性影响较小.
(3)3种氯酚均能引起四膜虫DNA严重损伤，提示可用彗星实验检测3种氯酚对四膜虫的遗传毒性.
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