2014, Vol. 35
空气不仅是生物赖以生存的先决条件,也是微生物进行传播的介质. 大气污染物主要包括有机污染物、 无机污染物以及大气微生物. 大气微生物多依附在尘埃等气溶胶粒子上而构成微生物气溶胶[1],主要来源于自然界的水体、 土壤、 动植物以及人类的工农业等活动[2]. 微生物是城市生态系统中重要的生物组成部分,大气中广泛分布的细菌、 真菌等微生物不仅具有极其重要的生态功能,同时微生物状况也是城市生态系统综合因素的集中表现,是评价城市大气质量的重要指标之一[3].
大气微生物主要是一些非病原性的腐生菌,然而,大气中仍存在一部分会造成环境污染以及人类和动植物疾病的病原性微生物[4,5],这也是近些年研究的一个热点问题. 另外,大气微生物与自然生态平衡及许多生命现象直接相关,在自然界的物质循环以及元素的地球化学循环中起着非常重要的作用[6],由于受限于大气生物气溶胶的采样检测方法,至今尚未能较全面地了解大气微生物的群落组成与变化规律,而大部分悬浮于大气中的气溶胶粒子可通过成云和降水过程而被清除,因此研究大气降水中微生物群落结构的组成与多样性变化,为进一步揭示室外大气微生物的群落结构与变化规律,及时监测与评价大气生物气溶胶的环境风险奠定科学基础.
此外,气溶胶作为影响气候变化的一种重要因子,在IPCC第3次评估报告中被着重指出：“气溶胶-云-气候的作用关系是我们当前尚未弄清的重要问题之一”. 已有的研究表明:细菌、 真菌、 病毒以及藻类等生物气溶胶粒子可作为云凝结核(CCN)和冰核(IN),参与大气云物理和化学过程从而影响大气降水的分布、 大气化学以及微生物的地球化学循环过程[7,8,9,10]. 大气生物气溶胶作为气溶胶的重要组成成分,不仅能对气候产生辐射强迫效应,而且其成核效应对气候变化的影响也越来越被重视[11]. 大气云中的异质核化过程是影响大气降水形成的关键因素之一,而已经被发现的冰核细菌(可以在-10℃以上较温暖的温度条件下催化液滴产生冰核的细菌[12])如Pseudomonas syringae,是被公认的冰核活性最强的菌种[13],研究发现它可在-2℃冻结[14].
已有国内外学者利用可培养的方法获得了大气微生物气溶胶中细菌的群落结构组成与多样性[15,16]. 然而,大气中可培养细菌的量仅占总量的1%左右,对大气细菌等微生物多样性的了解十分有限[17]. 近年,分子生物学技术在研究环境样品微生物的多样性及群落结构中,已发展成为一种成熟且有效的方法[6,18,19,20]. 本研究是基于16S rRNA克隆文库法,通过群落多样性分析与系统发育分析,对上海城市生态环境下2012年5~9月降水中细菌的群落结构组成及多样性进行研究,旨在分析不同时期上海市大气降水中细菌群落的结构组成和多样性的变化特征.
1 材料与方法 1.1 采样点大气降水样品于2012年5、 6、 7、 8、 9月均采集于上海市中国科学院植物生理生态研究所实验楼3楼顶(31°11′N,121°27′E,距离地面高度约15 m)此地位于上海市徐汇区,附近为科研楼以及居民生活小区.
1.2 样品 1.2.1 样品采集2012年5~9月采集的样品,分别标记为SH5、 SH6、 SH7、 SH8、 SH9,为保证每次实验所需的雨水量,同时使用多个3 L玻璃烧杯收集雨水,杯口加置能够增加接水面积的不锈钢漏斗. 每月多次收集雨水,每次收集时间不超过24 h,所接雨水尽快移至4℃冰箱保存直至累积接雨量到1.5 L左右开始过滤.
除在7、 8月的雨季是24 h内降水过程的雨水累积样品,其他月份的雨水样品通常是每月中多天次降水的累积样品. 以上实验器材等用品使用前均经过严格的高压蒸汽灭菌处理.
1.2.2 样品处理使用真空抽滤泵(津腾公司)与硝化纤维素滤膜(孔径0.22 μm,直径47 mm,美国Millipore公司生产)进行雨水过滤,过滤雨水量为1 L. 过滤之后的膜置于-20℃保存,雨水原液、 滤液各取100 mL于4℃保存.
1.3 样品的处理 1.3.1 DNA提取在超净台中,分别把每个滤膜剪成碎片,各自装入2 mL的离心管中,使用FastDNA SPIN 试剂盒(MP Biomedicals公司,美国),按照操作说明提取DNA. 提取的DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳(TBE缓冲液)检测,然后置于-20℃保藏.
1.3.2 PCR扩增以上述提取的总DNA作为扩增模板. 采用细菌16S rRNA基因片段上的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′)和1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[21]对降水样品进行PCR扩增(PCR仪为美国Bio-Rad公司生产). 50 μL的反应体系: 200 μmol ·L-1 dNTP(Takara),0.2 μmol ·L-1引物 (Invitrogen),10×buffer(Takara),2.5U Taq DNA 聚合酶 (Takara),8%BSA(美国). 反应程序：95℃预变性5min; 95℃变性1 min; 55℃退火1 min; 72℃延伸1.5 min,35个循环; 72℃延伸10 min.
1.3.3 克隆与测序PCR产物使用GeneJET PCR试剂盒 (Fermentas,美国)按照操作说明进行纯化,然后克隆; PCR纯化产物与pGEM T-Easy Vector (Promega,美国) 在T4连接酶及缓冲液的作用下连接,4℃静置16 h; 连接体系按照操作说明转化到感受态大肠杆菌DH-5α(Takara)中,LB培养液中摇菌培养1.5 h,然后把菌液涂布到含有100 μg ·mL-1氨苄青霉素的LB平板上; 筛选白色菌落采用M13f (5′-GTTTTCCCAGTCAC GAC-3′)和M13r(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)引物做菌落PCR,然后随机挑选出100个左右的阳性菌落,交由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序.
1.4 系统发育分析 1.4.1 系统发育多样性分析利用Mallard软件(http://www. bioinformatics-toolkit. org/Mallard) 对测序所获得的16S rRNA序列片段进行嵌合体检测,去除嵌合体. 利用Mothur软件(http://www. mother. org/wiki/OTU-based_approaches) 按照不小于97%的相似性划分成一个OTU (Operational Taxonomic Units)的原则,对样品序列进行OTU划分. 利用RDP在线分类程序对处理好的16S rRNA序列片段进行初步的系统分类. 把处理之后有效的16S rRNA序列片段提交到GenBank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/),获取序列号. 最后,使用 Mothur生成稀有度曲线以及群落系统发育树.
1.4.2 群落多样性指数分析群落多样性指数 (Shannons diversity indices,H),物种丰度 (species richness,Chao1),稀有度曲线(rarefaction curves)与覆盖率(coverage)分别采用不同的程序(http://www. mothur. org/wiki/Shannon; http://www. mothur. org/wiki/Chao; http://www. mothur. org/wiki/Rarefaction. sin; http://www. mothur. org/wiki/Coverage)分析.
2 结果与分析 2.1 16S rRNA序列多样性指数分析对分别来自于上海5个月大气降水中不同细菌样品的克隆文库,共392个克隆序列进行16S rRNA基因序列分析：SH5(82个克隆),SH6(67个克隆),SH7(62个克隆),SH8 (82个克隆),SH9(99个克隆). 按照序列相似性大于或者等于97%划分为同一个OTU的标准进行群落多样性分析,共有110个OTUs (表 1).
 | 表 1 降水中细菌16S rRNA基因文库生物多样性指数与物种丰度评估 1) Table 1 Biodiversity indices and richness estimators among the bacterial 16S rRNA gene |
多样性分析指标主要包括：物种丰度,多样性指数,稀有度曲线,群落系统发育树以及覆盖率. 从5个不同样品划分的OTUs以及物种丰度指数(Chao 1)来看,环境样品中细菌具有很高的多样性. 覆盖率(56%~96%)表明样品测序结果已包含了环境样品中主要的细菌优势种群,这同基于物种丰度计算出来的稀有度曲线是一致的(图 1).
 | 图 1 克隆文库中基于OTUs的稀有度曲线 Fig. 1 Rarefaction curves of observed OTUs richness in the clone libraries |
另外,不同月份降水中的细菌群落多样性存在一定的差异. 群落多样性指数(Shannons index of diversity,H)以及物种丰度指数(Chao 1)表明,2012年从5~9月降水中的细菌群落多样性没有表现出来一定规律性的变化趋势,其中夏季6月样品(SH6)的细菌群落结构组成及多样性明显要高于其他样品,其次是秋季8月样品(SH8),其它各月份样品的群落结构组成以及多样性差别不明显. 细菌群落聚类树(图 2)分析结果表明,具有较高相似性的样品SH5、 SH6、 SH7、 SH8聚类在同一分支; 样品SH9单独聚类在不同分支.
 | 图 2 聚类分析不同降水中细菌群落的相似性 Fig. 2 Cluster analysis of the bacteria community from different precipitation |
在各样品细菌群落结构的比例组成中,变形菌门(革兰氏阴性,G-)是优势菌群,在SH5、 SH6、 SH7、 SH8、 SH9中各占比例分别为94.1%、 32.5%、 92.3%、 69.6%、 91.7%. 主要包括α变形菌纲,β变形菌纲,γ变形菌纲及部分未分类的变形菌纲; 不同时期样品中变形菌纲(α-,β-,γ-)的比例各不相同,5个样品中均含有α和γ变形菌纲. 此外,降水样品中还含有拟杆菌门(Bacteroidetes)、 放线菌门(Actinobacteria)、 异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、 蓝藻门(Cyano bacteria)、 酸杆菌门(Acidobacteria)、 厚壁菌门(Firmicutes) 共7个主要门类的细菌及未定菌(TM7). 目分类水平上的细菌群落结构组成如表 2所示,所有样品中共出现14类目类细菌(包括未分类菌目),其中SH5、 SH6、 SH7、 SH8、 SH9分别含有5类、 13类、 4类、 5类、 5类,样品内部各自的优势菌目分别为伯克氏菌目(Burkholderiales)、 放线菌目(Actinomycetales)、 假单胞菌目(Pseudomonadales)、 伯克氏菌目(Burkholderiales)、 假单胞菌目(Pseudomonadales). 其中,几乎在所有样品中均出现的优势菌群主要有α变形菌纲中的鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、 β变形菌纲中的伯克氏菌目(Burkholderiales)以及主要由潜在病原菌组成的γ变形菌纲中的假单胞菌目(Pseudomonadales). 细化到科分类水平的细菌群落结构组成如图 3所示,其中几乎在每个大气降水样品中均出现的优势菌有噬纤维菌科(Cytophagaceae)、 鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、 草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、 莫拉氏菌科(Moraxellaceae). 其它科分类菌是球菌科(Planococcaceae)、 芽孢杆菌科(Bacillaceae)、 酸杆菌科(Acidobacteria)、 异常球菌科(Deinococcaceae)、 鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)、 蓝藻菌(Cyanobacteria)、 甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、 红螺菌科(Rhodospirillaceae)、 生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、 丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、 产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、 伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、 微杆菌科(Microbacteriaceae)、 红色杆菌科(Rubrobacteraceae)、 微球菌科(Micrococcaceae),包含了具有强冰核活性细菌的假单胞菌科(Pseudomonadaceae)及未分类的细菌.
| 表 2 各样品中细菌目分类的组成分布 1)/% Table 2 Taxonomic distribution of bacterial order for each sample/% |
 | 图 3 细菌群落结构科分类比例组成 Fig. 3 Family proportion of bacterial community structure |
现有的研究多是通过可培养的方法展现了大气生物气溶胶的多样性[18,21],具有一定的局限性[22]. 本研究是利用分子生物学的方法,按照不同的季节(月份)划分,研究分析大气降水中细菌的群落结构组成与多样性变化特征.
3.1 细菌群落结构组成细菌多样性分析结果表明,革兰氏阴性菌(G-)明显要多于革兰氏阳性菌(G+),这与国内外学者在不同环境中的研究结果一致,而利用可培养的方法所获得细菌G+均多于G-[15,16],而通过非培养的方法所获得的细菌则G-多于G+[22,23,24],这也符合G-细菌可生活在低气温,甚至嗜冷环境中[15]以及对辐射有抗性[25]的结论.
上海市城市生态环境下大气降水中的细菌群落具有很高的多样性与丰富的群落结构组成,研究发现了7个主要门类的细菌：变形菌门、 拟杆菌门、 放线菌门、 异常球菌-栖热菌门、 蓝藻门、 酸杆菌门、 厚壁菌门及未定菌,其中,变形菌门属于优势菌群,β变形菌纲和γ变形菌纲属于优势菌亚群,这与国内外研究结果相一致[20,26],以上研究表明,含动植物致病菌较多的变形菌门类微生物可以较长时间存留于大气环境中. Fang等[16] 通过可培养的方法检测北京市大气中的细菌[27],结果仅包括变形菌门、 厚壁菌门及放线菌门这3类,表明可培养方法用于了解环境样品细菌的多样性,其灵敏度要低于分子生物学手段. 另外,降水样品中尚存在一定量的未知菌(TM7,2.5%),进一步表明即使通过分子生物学技术,大气降水中仍有一部分细菌未被人们所发现或认知.
在目分类水平上鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、 伯克氏菌目(Burkholderiales)、 假单胞菌目(Pseudomonadales)几乎出现在每个样品中. 鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)常生活在根际、 土壤等地表环境中,地表是大气微生物气溶胶的一个重要源,降水样品中存在丰富的鞘脂单胞菌,而且不同月份中的比例相差很大,该结果可能是由于受到不同程度人类活动或者自然活动造成的,同时也表明大气中微生物的群落结构组成易受外界活动的干扰. 伯克氏菌目中的伯克氏菌是动植物及人类的重要病原菌,而且由于伯克氏菌类对抗生素的抗药性及高运动性等特性,该菌有时会被认为是针对家畜及人类生物战的潜在媒介. 假单胞菌目中的假单胞菌是寄生在植物上潜在的病原菌,大气中普遍存在该类细菌,说明植被区域是大气微生物来源的稳健类型之一[28]. 科分类水平上的优势菌类为噬纤维菌科(Cytophagaceae)、 鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、 草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)及莫拉氏菌科(Moraxellaceae). 其中,噬纤维菌科隶属于严格厌氧的拟杆菌门,其大多数能够降解生物大分子,在物质转化方面起着重要作用,同时与纤维品以及奶肉蔬菜等食品的腐烂有关.
3.2 细菌群落结构组成及多样性的季节性变化聚类树聚类在同一个分枝上的样品相似性较高,因此样品SH5、 SH6、 SH7、 SH8、 SH9之间聚类分析结果(图 2)表明:同一季节内降水中微生物的群落结构相似性较高. 2012年夏季样品为SH5、 SH6、 SH7; 2012年秋季样品为SH8、 SH9.
其中SH5、 SH6、 SH7、 SH8聚类在同一大的分枝上表明：①同一季节内的微生物群落结构相似性较高(SH5、 SH6、 SH7夏季样品); ②处于夏秋交替时期,季节气候变化不很明显的秋季样品SH8群落结构相似性更接近于夏季样品. 样品SH9单独聚类在不同的分枝上. 聚类结果表明:降水样品中细菌的群落结构组成与季节性气候性条件差异相关,微生物群落结构组成及多样性会因环境等因素的变动产生很大的差异,大气温度、 相对湿度、 风速以及光照等均是影响大气微生物群落结构变化的主要因素[29,30]. 秋季样品SH9与夏季样品SH5、 SH6、 SH7聚类在完全不同的分枝上,群落结构相似性较差,表明,差异性显著的季节性气候条件对大气群落结构变化起到显著作用,气候因素能直接影响细菌的群落结构组成与多样性[14].
分子生物学分析结果表明,上海城市生态环境下各月份细菌的物种丰度及群落多样性存在差异性. 整体而言,按照季节性划分5个月的样品,细菌群落多样性与物种丰度并没有呈现出一定的趋势性,仅是夏季样品中SH6的物种丰度及群落多样性指数值最高,秋季样品SH8次之,而其余样品几乎一样(见表 2),这与同步研究的北京大气降水样品结果不同,其细菌群落多样性指数与物种丰度值的变化趋势为冬季>秋季>夏季. 不同的结果可能是由于上海隶属沿海城市且属于亚热带季风性气候等各种原因造成的. 样品SH6的物种丰度及群落多样性指数值在所研究的各月份样品中处于最高,表明沿海地区6月的大气温度、 相对湿度、 风速及光照等条件是比较适宜大气细菌生存的; 同时,由于气候条件适宜,人类室外活动增加,在一定程度上或许增加了大气细菌等微生物的浓度及多样性,人类活动能够持续地造成室外微生物空气污染,例如城市活动能够形成城市“细菌岛屿效应”,导致城市中大气细菌浓度增加[31]. 大气微生物通常是靠吸附在尘埃粒子表面而悬浮在大气中,降水过程能够明显冲刷和净化大气中的细菌等微生物气溶胶[32,33]. 而样品SH7、 SH8的采集工作分别是在2012年7、 8月,由于6月的雨水充沛,湿沉降作用明显,直接造成样品SH7、 SH8的群落多样性及物种丰度值较低.
夏季降水中共发现了包括未定菌在内的7个门类的细菌,秋季降水中发现了4个门类的细菌. 夏季大气降水中细菌的群落多样性明显要高于秋季,尤其是样品SH6包括了7个门类的细菌. 因此,季节性的气候差异对大气降水中细菌群落结构组成及多样性影响显著. Maron等[34]研究表明,大气中细菌群落结构的季节性变化主要是由气候及大气的变化所触发的. 气候在改变细菌群落结构组成与多样性的同时,具有冰核活性的细菌对云与降水的形成也具有实质性的影响,因此大气微生物至少可能会在区域性地带影响大气水循环与气候[9,10,35]. 本研究经比对分析发现样品中含有假单胞菌属细菌,而冰核活性(INA)很强的丁香假单胞菌种[21,36]就属于该属类,一定程度上或许可以推测,大气降水中存在具有冰核活性的细菌而且能够在云与降水中起到作用[37],这也是笔者接下来的工作重点,利用分子生物学方法来研究大气降水中的冰核活性菌的存在与否.
4 结论
(1)上海市大气降水中的细菌群落具有很高的多样性,共发现了7个门类的细菌,革兰氏阴性菌比例大于革兰氏阳性菌,其中优势菌群是变形菌门,β变形菌纲和γ变形菌纲属于优势菌亚群. 此外,大气降水中还有一定量未被认知的细菌.
(2) 上海市大气降水中的细菌群落结构组成及多样性,不同季节、 不同月份均有所差异. 整体而言,上海市大气降水中的细菌多样性具有季节性变化,夏季大气降水中细菌的群落结构多样性最为显著.
(3) 上海市大气降水中细菌群落的聚类分析结果表明,同一季节内大气降水的细菌群落结构相似性较高; 处于夏秋季节性交替的细菌群落相似性更接近于夏季; 季节性气候差异性越明显的细菌群落,其相似性越低.
(4)上海市大气降水中存在一定量的动植物致病菌. 尤其是夏季6月样品,其细菌群落结构组成及多样性均是所研究样品的最高值,因此降水冲刷至地表和水域中的各类病源菌群会相应地增多,因而可能会导致城市中各类用水系统的生物污染事件发生几率加大而危及公共卫生安全,相应的管理职能部门及市民在此期间应该增强防范意识并做好相应的防护工作.
致谢： 感谢上海生科院植物生理生态研究所龚继明研究员及课题组成员在样品采集过程中所给予的帮助与支持.
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