2. 武汉大学资源环境学院, 武汉 430079
2. College of Resources and Environmental Sciences, Wuhan University, Wuhan 430079, China
镉(Cd)被列为首位土壤重金属污染物[1, 2]. 广泛应用于电镀工业、 化工业、 电子业和核工业等领域[3]. 其“三废”的排放,以及污泥污灌、 城市垃圾等使得土壤Cd污染日趋加重[4]. 我国Cd污染耕地达1133万hm2,郊区菜园土壤、 蔬菜Cd污染的问题在我国大中城市均存在[5]. 作物根系吸收的Cd易向可食部位迁移,而后通过食物链进入人体内富集,危害人类健康[6]. 由于Cd 污染具有隐蔽性、 潜伏性、 长期性和不可逆性,土壤Cd 污染的治理和修复一直是国内外土壤学、 环境科学等领域研究的难点和热点[7]. 传统的治理方法如淋滤法、 客土法、 吸附固定法等物理方法以及络合浸提法等化学方法,投资昂贵,需用复杂设备条件或打乱土层结构,且可能带来二次污染[8, 9]. 自从1983年美国科学家Chaney等首次提出运用植物去除土壤中重金属污染物的设想(即植物修复)以来,人们逐渐将重金属污染治理的研究重点转向了植物修复技术[9]. 但重金属富集植物,尤其是超积累植物生长速度较慢,生物量较小,因此,修复速度较慢. 此外,植物修复的效果还受到土壤类型、 温度、 湿度、 营养等环境条件的制约. 土壤污染的微生物修复是利用对有毒重金属离子有抗性的微生物来改变和转化金属离子形态. 近几年,重金属污染土壤的植物-微生物联合修复作为一种强化植物修复技术逐渐成为国内外研究的热点.
黑麦草(Lolium multiflorum L.)为一年生或多年生草本植物,是禾本科中产量较高的一种牧草. 有研究报道,黑麦草对土壤重金属具有较强的富集作用,同时建植速度快、 分蘖力强,能够迅速覆盖地面,可作为土壤重金属修复植物[10]. 丛枝菌根是植物根系与丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌形成的一种共生体,广泛存在于包括重金属污染土壤的各种生境中,且可以影响宿主植物对重金属的吸收、 积累、 转移[11]. 有报道显示AM真菌侵染能够降低植株地上部重金属浓度[12, 13],从而提高植物对重金属元素毒害的抗性. 但由于菌根真菌是物质从土壤进入植物体内的重要通道之一,因此,也有报道显示,AM真菌促进某些植物的根对Cu、 Zn、 Cd的吸收.
Cd具有较高的生物有效性,易在蔬菜中积累[14]. 蔬菜吸收积累重金属Cd的能力不仅在种间差异显著,而且在品种间也表现出显著性差异[15, 16, 17]. 番茄是人们喜食的一种茄果类蔬菜. 有研究表明番茄对Cd耐性和吸收富集存在基因型差异[18]. 这为筛选低Cd积累番茄品种提供了依据. 目前,有关植物-微生物对Cd污染土壤的蔬菜吸Cd影响的报道较少. 土壤接种菌根真菌促进黑麦草等重金属超级累植物或重金属富集植物体内重金属元素浓度的效应能否同时表现在降低蔬菜重金属吸收量方面?为此,本研究选取了重庆地区2个主栽番茄品种,采用盆栽试验模拟Cd污染的土壤条件,分析黑麦草-丛枝菌根真菌对不同番茄品种生长、 生理特性、 Cd的积累及化学形态的影响,以期为蔬菜Cd污染的合理防治提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 供试材料
供试植物为番茄(Lycopersicon esculintum Mill.)和黑麦草(Lolium multiflorum L.). 番茄品种为德福mm-8和洛贝琪,由重庆市农林科学院提供. 供试丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza)真菌分别为摩西球囊霉、 幼套球囊霉、 根内球囊霉,由北京市农林科学院营养与资源研究所提供. 供试土壤采自重庆市九龙坡区含谷蔬菜基地. 土壤全N和有机质分别为2.618和36.54 g ·kg-1,有效N、 有效P和速效K分别为104.0、 13.1和101.3 mg ·kg-1,pH为6.03,CEC为19.2 cmol ·kg-1,土壤Cd<0.005 mg ·kg-1.
1.2 试验方法盆栽试验于2013-02-27~2013-06-26在西南大学资源环境学院玻璃温室内进行. 试验供设置4个处理,分别为“Cd”(对照)、 “Cd+黑麦草”(在番茄幼苗移栽15 d后在其周围播黑麦草种子,40粒 ·钵-1)、 “Cd+丛枝菌根”(3种菌根各15 g共45 g)、 “Cd+黑麦草+丛枝菌根”. 模拟土壤Cd污染的浓度为20 mg ·kg-1. 将5 kg过5 mm筛的风干土装入塑料盆内(直径× 高=25 cm× 17 cm),加入20 mg ·kg-1的CdCl2溶液并混匀,平衡2~3周后,进行番茄幼苗移栽,每钵1株. 底肥P、 K分别为100和150 mg ·kg-1,以NH4H2PO4和KCl的形式加入,N为180 mg ·kg-1,以NH4H2PO4和尿素的形式加入. 试验所用的药品、 肥料均采用分析纯. 每个处理设置4次重复,每个处理4盆,随机排列. 培养期间土壤水分含量保持为田间最大持水量的60%. 浇水前用土壤水分速测仪测定土壤的含水率,3次测量取平均值,然后计算所需的补水量,采用去离子水按所需水量补水. 从2013年5月27日开始采摘番茄红果,每次采摘均记录产量,于6月26日全部收获. 植株在105℃下杀青15 min,在60℃下烘干至恒重.
1.3 测定方法土壤基本理化性质采用常规方法测定[19]. 土样经HCl-HNO3-HClO4消解后,用原子吸收分光光度计(Perkin Elmer SIMMA 6000,Norwalk,USA)测定土壤Cd含量. 番茄叶和根过氧化氢酶(CAT)活性采用高锰酸钾滴定法测定[20]; 过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[21]; 超过氧化物岐化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定[21]; 丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[21]. 将烘干植株样品在研钵中研碎,经HNO3-HClO4法消煮,用原子吸收分光光度计(Perkin Elmer SIMMA 6000,Norwalk,USA)测定不同部位Cd含量,镉的检测限为0.005 mg ·kg-1.
番茄果实中各Cd形态分级采用连续浸取法浸取Cd[22]. 在2013年6月26日番茄全部收获后,选取完全成熟果实,采用四分法取样并切碎. 准确称取4.000 g果实鲜样,置于烧杯中,加入37.5 mL提取剂,使样品保持浸透状态,并在30℃恒温箱中放置过夜(约17~18 h),次日回收提取液,再加入同体积的同样提取液,浸取2 h后再回收提取液,重复2次,即在24 h内提取4次. 将4次提取液(共150 mL)混合,经电热板蒸至近干后,加入适量HNO3-HClO4混合酸(4 ∶1,体积比)消煮澄清后用10% 盐酸定容到50 mL的容量瓶中,然后用原子吸收分光光度计(Perkin Elmer SIMMA 6000,Norwalk,USA)测定Cd的含量,镉的检测限为0.005 mg ·kg-1. 提取剂及提取顺序为80% 乙醇(FE,提取硝酸盐、 氯化物为主的无机盐以及氨基酸盐)、 去离子水(FW,提取水溶性有机酸盐、 重金属一代铁酸盐)、 1 mol ·L-1氯化钠溶液(FNaCl,提取果胶盐,与蛋白质结合态或呈吸着态的重金属)、 2%醋酸(FHAc,难溶性重金属铁酸盐,包括二代铁酸盐)、 0.6 mol ·L-1盐酸(FHCl,提取草酸盐).
本研究所列结果为3次重复的测定值,数据采用SPSS 18.0统计软件进行方差分析和多重比较.
2 结果与分析 2.1 生物量
从表 1可知,番茄果实、 茎及总干重在各处理间和2个品种间的差异达到了显著水平. 与对照相比较,在重金属Cd污染(20 mg ·kg-1)下,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”显著提高了2个番茄品种的果实、 根、 茎、 叶及总干重,增幅分别为17.6%~91.4%和64.2%~76.8%、 10.9%~84.2%和4.2%~65.1%、 13.7%~72.3%和4.3%~57.0%、 32.9%~42.4%和4.4%~40.0%、 25.3%~236.3%和17.9%~150.3%. 2个番茄品种果实、 根、 茎、 叶及总干重均以“Cd+丛枝菌根”处理最高. 比较供试的2个番茄品种的果实干重及植株总干重,各处理均为“洛贝琪”>“德福mm-8”.
![]() | 表 1 不同处理对番茄生长的影响 Table 1 Effects of different treatments on the growth of tomato |
丙二醛(MDA)作为生物在逆境条件下膜脂过氧化的终产物,其含量可以指示植物体内脂类过氧化作用的程度,逆境胁迫下植物的抗性通常与其体内MDA含量呈负相关[23]. 由图 1可见,与Cd处理(对照)比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”均降低了2个品种番茄叶片及根部的MDA含量,其中,降幅最大的是“Cd+黑麦草+丛枝菌根”处理,分别减少了 20.8%、 22.0% 和 22.2%、 24.4%; 其次是“Cd+黑麦草”处理,分别减少了 17.1%、 17.4% 和 17.4%、 21.6%; “Cd+丛枝菌根”处理,较对照分别减少了 2.6%、 11.8% 和 9.8%、 10.6%. 番茄叶的MDA含量在2个品种之间差异不显著,各处理以“洛贝琪”根的MDA含量略低于“德福mm-8”.
![]() | 图 1 不同处理对番茄叶和根MDA含量的影响 Fig. 1 Influence of different treatments on contents of MDA in leaf and roots of tomato 图中小写字母为同一品种不同处理之间差异显著达0.05%的显著水平(P<0.05),下同 |
生物代谢产生的自由基对生物膜有伤害作用,而植物体内的CAT、 SOD、 POD 抗氧化酶对逆境诱导产生的活性氧清除相关,逆境中它们将组成植物体内活性氧清除剂系统,有效清除植物体内的自由基和过氧化物[10]. 由图 2~图 4可见,与对照相比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理的叶片和根部CAT、 SOD、 POD活性都有所下降,其中最为明显的是处理“Cd+黑麦草+丛枝菌根”,其次是处理“Cd+黑麦草”,最后是处理“Cd+丛枝菌根”. 番茄叶和根部CAT、 根SOD在2个品种之间差异不显著,但番茄叶片SOD、 叶和根的POD活性在2个品种间差异性显著,且各处理均为“洛贝琪”叶和根的SOD和POD含量明显高于“德福mm-8”.
![]() | 图 2 不同处理对番茄叶和根CAT活性的影响 Fig. 2 Influence of different treatments on activities of CAT in leaf and roots of tomato |
![]() | 图 3 不同处理对番茄叶和根SOD活性的影响 Fig. 3 Influence of different treatments on activities of SOD in leaf and roots of tomato |
![]() | 图 4 不同处理对番茄叶和根POD活性的影响 Fig. 4 Influence of different treatments on activities of POD in leaf and roots of tomato |
由表 2可知,番茄果实中Cd的总提取量及各形态Cd含量在2个品种间、 不同处理间差异达到显著水平(除FHAc外). 番茄果实中各形态Cd含量大小顺序为FNaCl>FR>FW>FE> FHCl>FHAc. 其中,番茄果实FNaCl含量为1.435 mg ·kg-1和1.288 mg ·kg-1,平均为1.362 mg ·kg-1,所占Cd提取总量的比例为52.9% 和51.6%,平均为52.3%; 其次是活性偏低的FR含量为0.426 mg ·kg-1和0.452 mg ·kg-1,平均含量为0.439 mg ·kg-1,占Cd提取总量的比例为15.7% 和18.1%,平均为16.9%(表 2). 活性较高的FW和FE含量为各形态Cd最小或次低. 其中,FW的含量分别为0.349 mg ·kg-1和0.316 mg ·kg-1,平均为0.333 mg ·kg-1,占Cd提取总量的比例为12.9%和12.7%,平均为12.8%; FE的含量分别为0.082 mg ·kg-1和0.065mg ·kg-1,平均为0.074mg ·kg-1,占Cd提取总量的比例分别为3.0%和2.6%,平均为2.8%(表 2). 与对照相比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理减少了番茄果实中FE、 FW、 FNaCl、 FHAc、 FHCl和FR 各形态Cd含量和Cd总提取量,降幅分别为31.0%~75.2%、 19.7%~59.1%、 3.1%~48.2%、 20.0%~65.0%、 40.7%~100.0%、 15.2%~50.0%和19.4%~52.4%. 除“德福mm-8”的FHAc和FR外,各处理以“Cd+黑麦草+丛枝菌根”的番茄果实各种Cd形态降幅最大,其次是“Cd+丛枝菌根”. 比较2个番茄品种果实的Cd总提取量,各处理以“德福mm-8”>“洛贝琪”.
![]() | 表 2 不同处理对番茄果实Cd形态含量的影响 1)/mg ·kg-1 Table 2 Effects of different treatments on chemical forms of Cd in tomato/mg ·kg-1 |
由表 3可见,番茄各部位Cd含量和积累量在2个品种间和不同处理间的差异均达到显著水平. 番茄各部位Cd含量的大小顺序为叶>根>茎>果实. 与对照相比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理使番茄果实、 叶、 茎和根中的Cd含量不同程度降低,Cd含量降低幅度分别为17.5%~47.1%和28.4%~50.2%、 18.5%~36.7%和9.4%~31.7%、 15.2%~48.0%和13.5%~67.5%、 27.0%~51.9%和20.6%~46.9%. 番茄叶、 茎、 根和果实Cd含量均“Cd+黑麦草+丛枝菌根”处理降幅最大,其次是“Cd+丛枝菌根”处理. 2个番茄品种根Cd含量以“洛贝琪”>“德福mm-8”,果实Cd含量以“德福mm-8”>“洛贝琪”.
![]() | 表 3 不同处理对番茄果实Cd积累的影响 Table 3 Effects of different treatments on accumulation of Cd in tomato |
番茄植株各部位Cd积累量的大小顺序为叶>茎>果实>根. 其中,叶、 茎积累量分别为植株Cd总积累量的57.1%和33.4%,果实Cd积累量仅为植株Cd总积累量的5.2%. 与对照相比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理降低了茎Cd积累量和植株Cd全量,降幅分别为4.7%~48.2%和23.3%~62.1%、 4.0%~39.5%和7.6%~41.4%. “Cd+黑麦草+丛枝菌根”处理减少了2个品种果实Cd的积累量,降幅分别为42.9%和43.7%. “Cd+黑麦草”处理降低了“德福mm-8”果实Cd积累量(16.7%),但增加了“洛贝琪”果实Cd积累量(37.0%); “Cd+丛枝菌根”处理减少了“洛贝琪”果实Cd积累量(10.9%),但增加了“德福mm-8”果实Cd积累量(0.8%). 综合考虑Cd含量和积累量,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”降低番茄果实Cd积累量及植株全Cd含量的作用大小以“Cd+黑麦草+丛枝菌根”>“Cd+丛枝菌根”>“Cd+黑麦草”. 除“Cd+黑麦草”处理外,2个品种果实Cd积累量及植株全Cd含量“德福mm-8”>“洛贝琪”. 3 讨论
本试验条件下,在Cd污染土壤上(20 mg ·kg-1),“Cd+黑麦草或丛枝菌根”的其余处理显著提高了2个番茄品种的果实、 根、 茎、 叶及总干重. 说明黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复均能缓解Cd对番茄生长的抑制. 2个番茄品种果实、 根、 茎、 叶及总干重均以“Cd+丛枝菌根”处理最高,尤其是2个品种番茄的根的干重明显高于其他处理. 该结果与前人[12, 13]报道相似. 原因可能是因为在Cd污染土壤接种枝菌根后,使得土壤内微生物种类增多或增加了土壤中微生物的活性,进而使土壤环境更加适宜番茄的生长. 同时,接种菌根菌强化了菌根对植物根系的感染能力,形成互惠互利的共生体[24],反而抑制了Cd对番茄生长的毒害效应. 该试验还发现2个番茄品种各处理以“洛贝琪”果实干重及植株总干重显著大于“德福mm-8”. 说明2个番茄品种由于基因型不同对Cd污染的耐性存在显著性差异,这与张薇等[25]和赵首萍等[26]的研究是一致的.
细胞膜作为植物调节和控制细胞内外物质运输和交换的重要结构,其透性是评价植物对污染物反应的常用指标之一[4, 16, 27]. MDA是膜脂过氧化的重要产物,可与蛋白质、 核酸、 氨基酸等活性物质交联,形成不溶性的化合物(脂褐素)沉积,干扰细胞的正常生命活动[4, 28]. 植物细胞膜系统是植物细胞和外界环境进行物质交换和信息交流的界面和屏障,其稳定性是细胞进行正常生理功能的基础[4, 16, 27]. 本试验中,在Cd污染土壤上(20 mg ·kg-1),与Cd处理(对照)比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”均降低了2个番茄品种叶片及根部的MDA含量,说明黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复都具有缓解由于Cd胁迫对番茄造成的危害. 该结果与肖家欣等[29]报道丛枝菌根中的根内球囊酶和幼套球囊酶会降低作物中MDA的含量相似. 而“Cd+黑麦草或丛枝菌根”降低番茄叶片及根部的MDA含量与番茄产量的增加是相呼应的.
重金属污染会导致植物体内产生大量活性氧自由基,引起蛋白质和核酸等生物活性物质变性、 膜质过氧化,由超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化氢酶(CAT) 等组成的抗氧化系统能够清除氧自由基,可使细胞免受由重金属引起的氧化胁迫伤害[7, 10, 30]. 在本试验中,与对照相比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理的叶片和根部CAT、 SOD、 POD活性都有所下降,其中最为明显的是处理“Cd+黑麦草+丛枝菌根”,其次是处理“Cd+黑麦草”. 表明黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复能降低植物体内活性氧自由基,从而导致清除自由基酶含量下降以期恢复正常活性水平[4]. 番茄叶片SOD、 叶和根的POD活性在2个品种间差异性显著,且各处理均以“洛贝琪”根和叶的SOD和POD含量明显高于“德福mm-8”. 该结果与张薇等[25]的研究不同基因型的番茄叶片的CAT、 SOD、 POD酶对镉胁迫的敏感程度有所差异相似. 本试验中叶、 根的抗氧化酶活性变化与2个番茄品种的产量变化也表现出一致性.
本试验发现,Cd在番茄果实中主要以FNaCl存在,平均为1.362 mg ·kg-1,所占Cd提取总量的比例为52.3%(表 2). 与早前报道重金属在植物体内的化学形态一般以氯化钠态为主的结果一致[16]. 这主要是因为Cd 对蛋白质或其它有机化合物中巯基有很强的亲和力,因此在作物体内,Cd 常与蛋白质相结合[4]. 活性较高的FW和FE平均含量之和为0.407 mg ·kg-1,占Cd提取总量的比例仅为15.6%,从而极大地限制了Cd的毒害效应. 本试验条件下,与对照相比较,“Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理减少了番茄果实中FE、 FW、 FNaCl、 FHAc、 FHCl和FR 各形态Cd含量. 可见,黑麦草和丛枝菌根单一或联合作用均表现对土壤重金属Cd污染良好的修复能力. 该结果与杜善周等[24]和王发园等[31]的报道一致.
供试的2个番茄品种Cd主要累积于叶和茎中,积累较少的是根和果实(表 3),可见番茄对Cd的转移能力较强. 此结果与朱芳等[18]研究显示的番茄Cd主要集中在根部有所不同. 本试验中,番茄果实干样中Cd含量>3.0 mg ·kg-1,除以番茄果实的水分系数(平均为16.5),番茄果实鲜样中Cd含量>0.3 mg ·kg-1,远远高于国家对蔬菜和水果的Cd限量标准(以FW计,≤0.05 mg ·kg-1),说明番茄不但对Cd有较强的迁移能力,而且在可食部位对Cd 也有很强的富集能力. 显示在Cd污染较重的地区,种植番茄可能存在果实产品受Cd污染的风险. “Cd+黑麦草或丛枝菌根”处理降低了茎Cd积累量和植株Cd全量,“Cd+黑麦草+丛枝菌根”处理还减少了2个品种果实Cd的积累量. 原因可能是黑麦草根部与番茄根部竞争吸收运输重金属Cd可能降低了Cd离子在番茄体内的浓度,丛枝菌根可能改变了Cd离子在根部吸收运输的位点从而降低了Cd离子向植物体内的木质部长距离输送,使果实中Cd含量相对较少. 也可能是因为丛枝菌根真菌均降低植物地上部重金属浓度,提高根对重金属的吸收,抑制重金属向地上部转运,认为重金属可与菌根中含有真菌蛋白配体的半胱氨酸形成复合体而滞留在根中[31]. 试验也发现“Cd+黑麦草”处理降低了“德福mm-8”果实Cd积累量,但增加了“洛贝琪”果实Cd积累量; “Cd+丛枝菌根”处理减少了“洛贝琪”果实Cd积累量,但增加了“德福mm-8”果实Cd积累量. 究其原因还有待进一步研究. 比较2个番茄品种,各处理果实Cd积累量及植株全Cd含量一般以“德福mm-8”>“洛贝琪”. 由此可见,供试2个番茄品种无论是生物量、 抗氧化酶活性、 丙二醛含量还是果实Cd总提取量、 各部位Cd含量及积累量,在2个品种间和不同处理间的差异均达到显著性水平. 该结果进一步应证了番茄对Cd耐性和吸收富集存在基因型差异[18].
4 结论
(1)在重金属Cd污染(20 mg ·kg-1Cd)下,黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复均有利于缓解Cd对番茄生长的抑制. 供试2个番茄品种以“洛贝琪”对Cd的耐性更强.
(2)黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复可降低2个品种番茄叶和根的MDA含量,CAT、 SOD、 POD活性,减少由于Cd胁迫诱导产生的活性氧、 植物体内脂类过氧化作用对植株造成的伤害.
(3)番茄果实中的Cd主要以氯化钠提取态(FNaCl)和活性偏低的残渣态Cd(FR)形式存在,占Cd提取总量的69.2%,活性较高的FW和FE仅占Cd提取总量的15.6%. 番茄果实中各形态Cd含量大小顺为FNaCl>FR>FW>FE> FHCl>FHAc. 黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复减少了2个番茄品种果实中各形态Cd含量.
(4)番茄Cd主要积累在叶和茎,果实和根积累较少. 黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复使番茄果实、 叶、 茎和根中的Cd含量不同程度降低. 就番茄产量而言,“Cd+丛枝菌根”处理最佳,如综合考虑番茄产量、 Cd含量及积累量,以“Cd+黑麦草+丛枝菌根”处理最好.
(5)番茄对Cd耐性和对Cd的吸收富集存在基因型差异. 因此,在Cd污染较重的地区,选择“洛贝琪”为栽培品种可有效降低番茄果实产品遭受Cd污染的风险. 由于本试验仅用了2个番茄品种,且盆栽试验又具有一定的局限性,因此,黑麦草和丛枝菌根单一或联合修复土壤Cd污染的效果还有待更深入地研究以及在田间进行验证.
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