好氧反硝化菌是一类在有氧条件下利用周质硝酸盐还原酶等好氧反硝化酶系进行反硝化脱氮反应的异养型微生物^[1]. 20世纪70年代，Krul等^[2]最早给出了好氧反硝化反应的科学确证，80年代，Robertson 等^[3]首次观察到好氧反硝化现象并分离出好氧反硝化菌. 这一发现打破了传统理论认为反硝化只能在缺氧条件下进行的认识，为污水脱氮引入了全新的概念. 好氧反硝化菌具有适应性较强、 生长速度快、 容易控制等优点，在污水脱氮处理方面具有广阔的应用前景，引起了国内外研究者的广泛关注.

目前，筛选出的多数好氧反硝化菌在反硝化过程中存在反硝化活性低、 亚硝酸盐氮积累严重、 TN去除率低等问题，如杨基先等^[4]从活性污泥筛选出的好氧反硝化菌株G3在最优条件下，24 h内亚硝酸盐氮积累12.03 mg ·L^-1. Wang等^[5]筛选出的菌株Pseudomonas sp.HS-N62在初始硝酸盐氮浓度为140 mg ·L^-1，9 h时亚硝酸盐氮积累89.4 mg ·L^-1，反应末期TN去除率仅65.9%. Zheng等^[6]研究表明，好氧反硝化菌株Marinobacter sp.在3 d内将147.4 mg ·L^-1的硝酸盐氮几乎全部转化为亚硝酸盐氮. 极少数好氧反硝化菌具有快速高效脱氮性能，如朱晓宇等^[7]分离出的2株反硝化菌Pseudomonas pseudoaloaligenes ZW23和Pseudomonas mendocina ZW27，均可在12 h内引起反应体系内TN的显著下降，脱氮速率分别达到21.72 mg ·(L ·h)^-1和22.31 mg ·(L ·h)^-1，反应过程无亚硝酸盐氮积累. 为更好地将好氧反硝化菌应用于实际废水脱氮处理，筛选分离出快速高效、 环境适应性强的好氧反硝化菌仍然是一项极为迫切的任务. 本研究报道了1株具有耐低温兼性嗜碱特性的高效好氧反硝化菌，并对其进行了鉴定，较为详实地考察了其反硝化特性，一方面丰富了好氧反硝化菌种资源库，另一方面为污水脱氮提供了候选菌株和理论支持. 1 材料与方法 1.1 菌株来源

菌株分离自浙江萧山锦江绿色能源有限公司垃圾渗滤液生化反应池活性污泥.

富集培养基 SM(g ·L^-1)^[8]：六水丁二酸钠14.8； NaNO₃ 0.85； KH₂PO₄ 1.36； (NH₄)₂SO₄ 0.27； 酵母浸膏 1； MgSO₄ ·7H₂O 0.19； 微量元素 2 mL； pH 7.2.

溴百里酚蓝(BTB)培养基(g ·L^-1)^[8]: L-天门冬酰胺 1.0； KNO₃ 1.0； 丁二酸钠 ·6H₂O 14.2； KH₂PO₄ 1.0； FeCl₂ ·4H₂O 0.04； CaCl₂ 0.15； MgSO₄ ·7H₂O 1； 琼脂 20； BTB 1 mL； pH 7.2.

反硝化培养基 DM(g ·L^-1)：六水丁二酸钠11.82 g； NaNO₃ 0.85 g； 维氏盐溶液 50 mL，pH 7.2.

LB活化培养基(g ·L^-1)：蛋白胨 10.0； 酵母浸膏 5.0； NaCl 5.0； pH 7.

微量元素溶液(g ·L^-1)：EDTA 50.0； ZnSO₄ ·7H₂O 3.9； CaCl₂ 5.5； MnCl₂ ·4H₂O 5.06； FeSO₄ ·7H₂O 5.0； (NH₄)₆Mo₇O₂₄ ·4H₂O 1.1； CuSO₄ ·5H₂O 1.57； CoCl₂ ·6H₂O 1.61； pH 6.0.

维氏盐溶液(g ·L^-1)：K₂HPO₄ 5.0； MgSO₄ ·7H₂O 2.5； NaCl 2.5； MnSO₄ ·H₂O 0.05； FeSO₄ ·7H₂O 0.05.

取5 mL用玻璃珠均匀打散的活性污泥转接至装有95 mL SM容积为250 mL的三角瓶内，置于30℃,180 r ·min^-1摇床条件培养，每隔4 d以5%的接种量转接1次. 经过一段时间的富集驯化后，通过倍比稀释、 涂布BTB平板，挑取BTB平板上蓝色单菌落连续划线纯化，将纯化后的单菌落接种至斜面，保存.

用LB培养基活化初筛菌，取活化种子液离心并用无菌生理盐水重悬洗涤，重复3次后重悬菌体，配制成D600为1.0的菌悬液，以2%的接种量接种到装有100 mL DM的250 mL三角瓶中，置于30℃,180 r ·min^-1摇床条件下培养2 d，混匀，测定各培养液中的TN，每株菌设置3个平行. 1.4 菌株的形态及生理生化鉴定

参照文献^{[9, 10]}. 1.5 16S rDNA序列分析 1.5.1 基因组DNA的提取

根据文献^[11]中的CTAB方法进行.

以基因组DNA为模板扩增16S rDNA，采用通用引物，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反向引 物 为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，均由生物工程(上海)有限公司合成. PCR反应体系(50 μL)为：10×PCR Buffer 5 μL； dNTPs 4 μL； 引物27F和1492R各1 μL； 模板DNA 1 μL； Taq DNA聚合酶 1 μL； ddH₂O 37 μL. PCR反应条件为：94℃ 预变性4 min； 94℃ 变性1 min，55℃ 退火50 s，72℃ 延伸1 min，30个循环； 72℃ 延伸10 min. 扩增结束用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物用Takara DNA片段纯化试剂盒纯化，切胶回收后送至生物工程(上海)有限公司测序.

将获得的16S rDNA序列在EzTaxon server 2.1中进行序列相似性比对，从LPSN数据库中选取该菌株对应的模式菌株，使用MEGA 4.0软件进行多序列比对分析，并用N-J法构建系统发育树. 1.6 菌株 GL19好氧反硝化特性研究 1.6.1 菌悬液的制备

斜面菌株用LB培养基活化2次后，离心，用无菌生理盐水洗涤3次，悬浮于无菌生理盐水，配制成D600为1.0的菌悬液.

1.6.2 碳源对菌株好氧反硝化特性影响

分别以葡萄糖、 丁二酸钠、 柠檬酸钠、 乙酸钠、 乙醇以及甲醇作为唯一碳源，维持C/N 15，以2%的接种量接种于装有100 mL DM的250 mL三角瓶中，30℃、 180 r ·min^-1恒温摇床培养48 h，每4 h取样测定培养液的D600，离心后测定pH、 硝酸盐氮(NO^-₃-N)、 亚硝酸盐氮(NO^-₂-N)以及总氮(TN).

改变培养基中柠檬酸钠的量，将C/N调整为5、 8、 10、 12、 15、 18. 接种量2%，30℃、 180 r ·min^-1恒温摇床培养36 h，取样及指标测定同1.6.2节.

培养基的初始pH分别调整为5、 6、 7、 8、 9、 10. 将菌株以2%的接种量接入适宜碳源和C/N的DM中，30℃、 180 r ·min^-1恒温摇床培养36 h，取样及指标测定同1.6.2节.

以摇床转速表征溶氧大小，分别设定摇床转速为120、 180、 200及230 r ·min^-1，对应DO分别为4.8、 6.9、 7.2及7.7 mg ·L^-1. 将菌株以2%的接种量接入适宜碳源、 C/N及pH的DM中，30℃ 恒温摇床培养36 h，取样及指标测定同1.6.2节.

将菌株以2%接种量接入适宜碳源、 C/N及pH的DM中，分别置于15、 30、 34、 40℃,适当转速的恒温摇床下培养36 h，取样及指标测定同1.6.2节.

以亚硝酸钠作为DM中的唯一氮源，维持C/N 15，以2%的接种量进行接种，置于30℃、 180 r ·min^-1的恒温摇床培养36 h，每4 h取样测定培养基中的D600、 总氮(TN)，离心后测定pH、 亚硝酸盐氮(NO^-₂-N)及总氮(TN).

以硫酸铵作为DM中的唯一氮源，维持C/N 15，以2%的接种量进行接种，置于30℃、 180 r ·min^-1的恒温摇床培养36 h，每4 h取样测定培养基中的D600、 总氮(TN)，离心后测定pH、 氨氮(NH⁺₄-N)及总氮(TN). 1.7 分析方法

NO^-₃-N：GB7480-87酚二磺酸分光光度法； NO^-₂-N：GB 7493-87 N-(1-萘基)-乙二胺光度法； TN: GB 11894-89过硫酸钾氧化-紫外分光光度法； NH⁺₄-N：GB 7479-87纳氏试剂分光光度法； 菌体生长量:光密度法(D600)； pH值采用Switzerland生产的MP220-pH计测定； DO采用美国哈希(HACH)公司生产的HQd Portable Meter测定.

2 结果与讨论 2.1 菌株的分离筛选

经过近6个月的富集驯化、 BTB平板筛选，得到34株菌. 经摇瓶复筛(结果见图 1)得到TN去除率高于45%的菌株GL2和GL19，分别为45.8%、 51.7%. 由于此处的TN是未经过离心测定的，既包括了培养基内硝酸盐氮、 亚硝酸盐氮等无机氮又包括胞内外可被氧化的有机氮. 所以，TN的去除率即可用来表示菌株好氧反硝化脱氮能力. 选取菌株GL19进行后续研究.

图 1

Fig. 1

图 1 定量筛选结果 Fig. 1 Results of quantitative screening

菌株GL19在富集培养基琼脂平板上培养24 h，菌落呈圆形，边缘不整齐，白色黏稠，不易挑取，表面光滑，半透明. 油镜下观察细胞为短棒状(图 2)，革兰氏染色阴性. 透射电镜观察(图 3)菌株呈直棒状，大小为(0.3~0.5) μm×(1.0~2.5) μm，端生单鞭毛. 菌株生理生化试验结果见表 1.

图 2

Fig. 2

图 2 菌株GL19菌体形态 (10×100) Fig. 2 Unicell morphology of strain GL19(10×100)

图 3

Fig. 3

图 3 菌株GL19透射电镜观察 (×30000) Fig. 3 Transmission electron microscopy of strain GL19(×30000)

表 1(Table 1)

表 1 菌株GL19生理生化鉴定结果 1) Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain GL19 生理生化指标 结果 生理生化指标 结果 葡萄糖氧化 - 色氨酸脱氨酶 - 接触酶 + 精氨酸双水解酶 + 氧化酶 + 鸟氨酸脱羧酶 - 硝酸盐还原 + 赖氨酸脱羧酶 + V-P - 精氨酸脱羧酶 + 甲基红 - 明胶液化 - 吲哚 - Tween80 + 4℃ 生长 + 硫化氢 + 42℃ 生长 + 酪素水解 - 淀粉水解 - 反硝化 + 1)表中“＋”表示阳性； “－”表示阴性

表 1 菌株GL19生理生化鉴定结果 1) Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain GL19

将获得的16S rDNA序列在EzTaxon server 2.1中进行序列相似性比对，从LPSN数据库中选取该菌株对应的模式菌株,使用MEGA 4.0软件进行多序列比对分析，并用N-J法构建系统发育树，如图 4所示. 结果表明，菌株GL19与多株Pseudomonas sp. 16S rDNA 序列的相似性达99%. 其中与Pseudomonas toyotomiensis HT-3^T 16S rDNA 序列的相似性高达99.783%，结合菌株的形态学及生理生化试验结果，可确定菌株GL19为假单胞菌属Pseudomonas sp.. GenBank登录号为(KC710974).

图 4

Fig. 4

图 4 基于16S rDNA序列同源性构建的菌株GL19及相关细菌的系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic trees of strain GL19 and related bacteria based on the partial 16S rDNA sequences

在微生物好氧反硝化过程中，碳源在为菌体生长提供能量的同时，也扮演着反硝化过程中电子供体的角色，对微生物好氧反硝化过程有着很重要的影响^[12,13]. 图 5为不同碳源条件下菌体的生长情况及脱氮特性. 结果表明，碳源对菌体的生长和脱氮特性影响较大. 以柠檬酸钠或丁二酸钠为碳源时菌体生长良好，24 h内NO^-₃-N去除率分别可达99.3%、 100%，TN的去除率均大于96.0%，但以丁二酸钠为碳源，全程有少量NO^-₂-N积累. 以葡萄糖、 乙酸钠及乙醇为碳源，菌体经较长的延滞期才到达对数期，NO^-₃-N也主要在对数期被利用，NO^-₃-N去除率在48 h内分别可达96.9%、 88.6%、 92.6%，对应TN去除率分别为93.0%、 81.2%、 88.8%. 菌株在以甲醇为碳源时，几乎不生长. 这与Wang等^[5]研究相似，菌株GL19能够利用常见小分子碳源进行生长及反硝化. 菌株之所以不能利用甲醇，可能是由于甲醇对菌体产生了毒害作用. 本试验考察的碳源种类较少，因而今后可以研究其它廉价碳源对该菌株反硝化活性的影响，为菌株实际应用提供理论参考. 考虑到丁二酸钠价格较贵、 且反应全程有NO^-₂-N积累，后续试验选用柠檬酸钠为碳源.

图 5

Fig. 5

图 5 碳源对菌株GL19好氧反硝化特性的影响 Fig. 5 Effects of carbon source on the aerobic denitrification of strain GL19

很多研究表明C/N对好氧反硝化的影响很大，且普遍认为较高的C/N会增强好氧反硝化效果^[14,15]. 图 6为不同C/N条件下，菌体在不同时间段的好氧反硝化活性. 结果显示不同C/N对菌体的生长和反硝化能力有着很大的影响. 当C/N不大于12时，由于碳源不充足，菌体的生长和反硝化活性都受到一定程度的抑制，NO^-₃-N不能完全去除，TN去除率最大仅为84.8%，且整个过程均有NO^-₂-N积累，特别当C/N为5时，NO^-₃-N及TN的去除率仅为55.4%、 35.1%. 当C/N增大到15时，NO^-₃-N去除率达100%，对应TN去除率为96.9%，且最终无NO^-₂-N积累. 继续增大C/N，菌体浓度虽有一定程度的提高，但反硝化活性已经达到稳定，即C/N为15时，菌体反硝化所需的能量已经很充足. 但实际废水尤其是高浓度含氮废水的C/N比较低，增加C/N比势必会增加废水处理的成本，故在实际应用中应视情况而定，综合考虑.

图 6

Fig. 6

图 6 C/N对菌株GL19好氧反硝化特性的影响 Fig. 6 Effects of C/N on the aerobic denitrification of strain GL19

环境中pH的改变能够引起微生物细胞膜电荷的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收. 此外，pH还影响微生物反硝化酶的活性，pH过高或过低均会导致反硝化酶活力降低甚至失活^[16]. 图 7为不同pH条件下，菌体在不同时间段的生长情况及好氧反硝化活性. 从中可以看出，菌体生长的pH范围为6~10，当pH为5时，菌体不能生长. pH为6~10时，菌体能够生长并发挥反硝化作用，最终NO^-₃-N的去除率均可达100%，TN平均去除率约96.0%，无NO^-₂-N积累. pH为6时，菌体经过近20 h的适应期才进入对数期，且过程中NO^-₂-N积累严重，最高积累10.7 mg ·L^-1. 可能是由于酸性环境抑制了亚硝酸盐还原酶的活性，进入对数期后，随着pH升高，亚硝酸盐还原酶恢复活性，最终将积累的NO^-₂-N全部还原. pH为10较之pH为6，菌体生长适应期短、 NO^-₂-N微量积累、 反硝化速率高，说明该菌在碱性环境下能较好地生长并发挥反硝化作用，具有兼性嗜碱特性. 而目前分离出的大多数好氧反硝化菌脱氮适宜pH为中性或偏碱，在pH为10条件下几乎没有太大的反硝化能力. Wang等^[5]对Pseudomonas sp.HS-N62研究表明，在pH为10时，菌株硝酸盐氮去除率不足50%. Zheng等^[17]对耐冷反硝化菌Psychrobacter sp. S1-1研究表明，偏碱性条件下菌株的反硝化能力大大降低. 李卫芬等^[18]利用Pseudomonas stutzeri F1进行反硝化研究表明，在pH大于8的条件下菌体就出现了生长不好，脱氮效率低的现象. 结果表明菌株GL19具有兼性嗜碱特性，pH适应范围优于目前分离出的大多数好氧反硝化菌.

图 7

Fig. 7

图 7 初始pH对菌株GL19好氧反硝化特性的影响 Fig. 7 Effects of initial pH on the aerobic denitrification of strain GL19

DO作为反硝化过程中重要的影响因素之一，其浓度高低直接影响好氧反硝化菌的生长状况及脱氮活性，且不同菌种的好氧反硝化机制存在较大差异，有必要做进一步研究^{[19, 20, 21]}. 本试验通过调节摇床转速来实现培养基中不同的DO浓度. 由图 8可知，转速越高，菌株适应期越短，达到最佳脱氮效果时间越短，但彼此相差不大，4个DO浓度均可在16~20 h内实现NO^-₃-N完全去除，TN去除率均约95.0%，NO^-₂-N在中间阶段出现少量积累，而后被迅速利用. 其中NO^-₃-N反应速率最高可达24.32 mg ·(L ·h)^-1，而目前好氧反硝化菌反应速率大多在4.50~13.67 mg ·(L ·h)^-1，菌株GL19的反应速率是这些菌的1.77~5.40倍. 这说明4.8~7.7 mg ·L^-1范围，好氧反硝化相关酶系均具有较强的活性，受DO浓度影响较小. 目前大多数分离出的好氧反硝化菌的反硝化活性都在某种程度上受到DO的影响，如Marinobacter sp. F6^[6]、 Pseudomonas stutzeri F1^[18]、 Pseudomonas stutzeri YHA-13^[22]、 Agrobacterium sp. LAD9^[23]等. 少数研究者发现某些好氧反硝化菌反硝化活性不受DO影响，如Acinetobacter sp. C-4^[24]，在100~200 r ·min^-1范围内均可维持高效去除率. 本研究结果表明DO对菌株GL19的生长及反硝化活性影响较小，这进一步证实该菌株在实际废水处理上的潜在实用价值.

图 8

Fig. 8

图 8 DO对菌株GL19好氧反硝化特性的影响 Fig. 8 Effects of DO on the aerobic denitrification of strain GL19

温度是影响菌体生长及好氧反硝化酶活性的一个重要因素，温度过高或过低均会影响菌体的生长和反硝化酶的活性. 图 9为不同温度条件下，菌体在不同时间段的生长状况及反硝化活性. 从中可以看出，温度对菌株GL19的生长及反硝化活性有着显著的影响. 当温度为15℃ 时，菌体经约20 h的适应期进入对数期，进入对数期后的16 h内，将NO^-₃-N完全去除，NO^-₃-N反应速率最高达8.31 mg ·(L ·h)^-1，TN去除率约94.3%，最终无NO^-₂-N积累. 在温度为30℃、 34℃ 条件下，菌株能够快速生长，反硝化速率也大大增强，20 h时NO^-₃-N去除率达到100%，TN去除率分别达到96.8%、 96.2%，反应末期无NO^-₂-N积累. 当温度为40℃ 时，菌体浓度最大，但脱氮效果降低，NO^-₃-N、 TN最大去除率分别仅为84.3%、 78.8%，NO^-₂-N全程积累，末期积累量为3.33 mg ·L^-1，说明该菌株最适生长温度与好氧反硝化最适温度不同，40℃ 高温抑制了菌株反硝化酶系的活性. 而张苗等^[25]筛选出的Chelatococcus sp.TAD1可在50℃ 好氧条件下24 h内可将63.79 mg ·L^-1硝酸盐氮降至0.46 mg ·L^-1. 相比而言在高温环境下菌株GL19存在反硝化活性不高的问题，但菌株GL19具有较强的耐冷特性，在低温15℃ 条件下，仍能够生长并发挥反硝化作用. 而南方地区冬季废水脱氮系统的水温一般为18℃ 左右，因此该菌可作为南方地区冬季废水脱氮工艺的候选菌株.

图 9

Fig. 9

图 9 温度对菌株GL19好氧反硝化特性的影响 Fig. 9 Effects of temperature on the aerobic denitrification of strain GL19

菌株GL19对亚硝酸盐利用情况如图 10所示，菌株经过8 h的适应期后进入对数期，进入对数期12 h内，即将初始浓度为140 mg ·L^-1的NO^-₂-N全部去除，对应TN去除率为94.8%. 整个反应过程未离心TN去除率为44.1%，即约44%的氮以气体的形式释放，反应过程有NO^-₃-N积累(图 10中未显示)，但反应末期检测不到NO^-₃-N的存在，这一方面说明菌株在一定条件下可被诱导产生异养硝化酶系之一的亚硝酸盐氧化酶； 另一方面说明菌株能以硝酸盐或亚硝酸盐为底物进行高效好氧反硝化作用，可以作为处理不同废水水质的候选菌株.

图 10

Fig. 10

图 10 菌株GL19亚硝酸盐反硝化过程 Fig. 10 Process of nitrite denitrification of strain GL19

目前分离出的大多数好氧反硝化菌都具有异养硝化特性. 为验证菌株GL19是否具有异养硝化特性，本研究以硫酸铵作为DM中的唯一氮源，考察不同时间段菌体的生长状况及异养硝化特性，结果见图 11. 从中可知，菌株GL19在4 h时即进入对数期，于28 h内将初始浓度为280 mg ·L^-1的NH⁺₄-N降至3.11 mg ·L^-1，NH⁺₄-N去除率达98.9%，相应TN去除率为91.7%. 整个反应过程未离心TN去除率为35.1%，这说明在异养硝化过程中约35%的氮因反硝化作用以气体形式释放，整个反应没有检测到NO^-₃-N、 NO^-₂-N，这可能是因为菌株GL19具有较高的好氧反硝化活性，异养硝化的中间代谢产物产生即被利用，所以检测不到中间代谢物，也有可能菌株GL19具有特殊的异养硝化代谢途径：NH⁺₄-N→NH₂OH→N₂ O→N₂^[26]. 综上可知，好氧反硝化菌株GL19兼具异养硝化特性，能够独立实现同一反应器内的同步硝化反硝化.

图 11

Fig. 11

图 11 菌株GL19异养硝化特性 Fig. 11 Nitrification performance of the strain GL19

(1)从垃圾渗滤液活性污泥中筛选到1株高效好氧反硝化菌GL19. 通过形态观察、 生理生化特征及16S rDNA分析，初步鉴定该菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，GenBank登录号为KC710974.

(2) 研究发现碳源、 C/N、 pH及温度对菌株反硝化活性影响较大. 在柠檬酸钠为碳源、 C/N不低于15、 pH 6~10、 DO 4.8~7.7 mg ·L^-1及温度15~34℃,硝酸盐氮负荷为140 mg ·L^-1的条件下，硝酸盐去除率均达100%，TN平均去除率为96.5%，最终无亚硝酸盐积累，具有耐冷兼性嗜碱、 高效脱氮特性.

(3) 该菌能够利用氨氮、 硝酸盐氮及亚硝酸盐氮进行快速高效地脱氮，可应用于不同含氮水质废水的脱氮处理，同时该菌具有耐冷特性，其在南方地区冬季废水脱氮处理方面也具有一定的潜在实用价值.