磷元素是植物生长所必须的元素，其重要性仅次于氮^[1]. 然而，植物需要的氮元素可以通过土壤中以及根部的固氮菌和硝化细菌将空气中的氮气转化为硝态氮来实现^[2]，但所需磷元素只能通过吸收土壤中的可溶性磷来满足^[3]. 据报道，我国共有74%的耕地存在缺磷现象^[4]. 土壤中，尤其是矿区土壤中，由于存在大量的重金属，而重金属又极容易与可溶性磷元素形成难溶性的磷酸化合物，如AlPO₄、 Ca₃(PO₄)₂ 和FePO₄等^[5,6]，因而造成土壤中磷元素的缺乏. 国内外常用的改善土壤磷元素的方法是施加化学磷肥，但是化学磷肥的使用率非常低，一般在当季的利用率仅为10%~20%^[7]. 目前，我国采用的磷矿粉加工法制造的化学磷肥成本高^[8]，而且，过量地向土壤中施磷肥，不仅造成大量经济损失，同时也带来各种环境污染问题^[9].

解磷微生物是大量存在于土壤中的一个类群，具有将难溶性的磷酸化合物降解为可溶性磷化合物以及释放质子的作用，因此，解磷微生物可以提高土壤中植物可吸收磷元素的含量以及促进植物生长^[10,11]. 田秀平等^[7]将两株解磷细菌接种于土壤之后，发现土壤中有效磷的含量分别增加了14.92 mg ·kg^-1和5.77 mg ·kg^-1. 魏自民等^[12]发现，接种了高温解无机磷细菌可明显增加堆肥中难溶性磷矿粉的转化率. Taurian等^[13]接种了从土壤中分离得到的59株具有解磷特性的细菌，发现这些微生物不仅能增加花生根的长度和干重，还可以促进植物根瘤的形成. 因此解磷微生物可以作为菌剂施用于环境中以改善土壤的理化性质.

矿区土壤中重金属含量非常高，因此在使用解磷微生物作为菌剂对矿区土壤进行生物修复时，既要选择具有较高重金属抗性的微生物，同时还需考虑在不同重金属条件下对微生物解磷量的影响. 重金属对于解磷微生物生长的抑制作用在国内外已多有报道^[14,15]，然而到目前为止，重金属对解磷微生物解磷量的研究还非常少. 本研究从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中筛选出两株具有降解难溶性无机磷和有机磷化合物的解磷细菌，并测定了在含有3种重金属的不同浓度培养基中可溶磷含量变化，以期为重金属污染土壤的生物修复提供优良的菌种资源.

1 材料与方法 1.1 材料和仪器 1.1.1 土样

表层土样采自于湖南省湘西自治州花垣县铅锌矿. 样品采集时间为2012年7月，土样采集后分装于塑封袋中，过1 mm土壤筛后于4℃保存. 经分析，土样中含有的主要重金属种类和含量分别为：Zn 0.74 g ·kg^-1,Cu 38.7 mg ·kg^-1,Pb 1.1 g ·kg^-1,Cd 6.73 mg ·kg^-1,Sb 0.82 g ·kg^-1.

1.1.2 培养基

无机磷培养基：蔗糖10 g，Ca₃(PO₄)₂10 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO₄ ·7H₂O 0.3 g,FeSO₄ ·7H₂O 0.03 g,MnSO₄ ·H₂O 0.03 g,(NH₄)₂SO₄ 0.5 g,Yeast Extract 0.5 g,蒸馏水1 L，pH 7.2,121℃灭菌15 min，固体培养基加入20 g ·L^-1琼脂.

有机磷固体培养基：将无机磷固体培养基[不加Ca₃(PO₄)₂]融化后，冷却至50℃左右，加入卵黄稀释液，每100 mL培养基中加10 mL卵黄稀释液，以卵黄为唯一磷源.

有机磷液体培养基：于不加磷酸钙的无机磷液体培养基中加入过滤除菌的卵磷脂溶液，终浓度设定为0.2 g ·L^-1.

1.1.3 仪器

HCY大容量全温振荡培养箱，JY600C电泳仪，Tocan全自动凝胶成像系统，BIO-RAD基因扩增仪，SPX-150B生化培养箱，UV-2102C型紫外可见分光光度计.

1.2 方法 1.2.1 土壤中解磷菌的筛选和分离

称量10 g保存的土样，倒入已经加入150 mL无菌蒸馏水的无菌锥形瓶中，于28℃摇床150 r ·min^-1振荡2 h，然后取出于室温静置30 min，取1 mL上清液于含有9 mL无菌水的试管中，按照此方法依次稀释至10^-6，然后取每个稀释度的稀释液200 μL，涂布于无机磷固体培养基，每个稀释度涂布3个平板，将平板置于28℃恒温箱中培养5 d，将平板中出现解磷圈的细菌进行分离纯化并接种于斜面中保存.

1.2.2 细菌DNA的提取和16S rRNA序列测定

细菌DNA的提取：将待鉴定的细菌首先在LB培养基上划线，活化，然后挑取单菌落于液体LB培养基中培养48 h，再按照细菌DNA提取试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)中的步骤提取基因组DNA，产物于-20℃保存.

16S rRNA基因序列测定：引物选择原核微生物16S rRNA的通用引物1492R (5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′)和27F(5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′),PCR扩增步骤可见文献^[16]的方法进行操作. 将PCR扩增产物交予北京诺赛公司进行测序，获得结果后将序列带入NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank中进行Blast同源性分析.

1.2.3 解磷细菌无机磷溶磷量的检测

将待测的细菌菌落，取单菌落于LB液体培养基中活化48 h，得到的菌液浓度为10⁸ cfu ·mL^-1,取1 mL菌液分别加入已经装有20 mL灭菌的液体无机磷培养基的50 mL锥形瓶中，每种细菌接种3瓶锥形瓶，同时设置不加解磷菌的实验作为对照，然后置于28℃摇床中150 r ·min^-1培养2周，每隔24 h使用磷锑钼蓝分光光度法^[17]检测上清液中可溶性磷的含量.

1.2.4 解磷细菌有机磷溶磷量及酸性磷酸酶的检测

将细菌接种于有机磷平板中，在28℃恒温条件下培养1周，观察平板底部产生解磷圈的情况，将具有有机磷降解能力的解磷细菌进行活化，取1 mL活化菌液接种于有机磷液体培养基中，每种细菌做3个重复，同时设计不接种解磷菌的作为空白对照，28℃摇床中150 r ·min^-1培养1周，测定上清液中可溶性磷含量. 根据测定上清液的pH值，偏酸性，因此，使用对硝基酚磷酸钠法^[18]测定酸性磷酸酶含量.

1.2.5 解磷细菌接种于含有重金属的无机磷培养基中溶磷量的检测

分别配制ZnCl₂、 Pb(NO₃)₂和Cr(NO₃)₂母液，121℃灭菌之后，分别加入已灭菌的无机磷固体及液体培养基中，使得3种重金属的终浓度均分别为0、 100、 500、 1 000和2 000 mg ·L^-1，每种重金属的每个浓度梯度均做3次重复.

将活化后的解磷细菌接种于分别含有3种重金属的5个浓度梯度的平板上，每个实验处理重复5次，接种后的平板于28℃恒温培养1周，测定每个平板中细菌菌落直径(colony diameter,CD)以及解磷圈直径(phosphate halo diameter,HD).

取1 mL活化的解磷细菌菌液，加入3种重金属的5个浓度梯度下的液体培养基中，28℃摇床中150 r ·min^-1振荡培养，并于培养的第1、 5、 10、 15 d分别检测上清液中可溶性磷含量. 同时设置不加解磷细菌的对照组实验测定上清液中的可溶性磷的含量.

1.2.6 结果处理

使用软件Excel和SPSS 19.0对实验所测得的数据进行处理绘图，同时使用邓肯多重范围检测(Duncan multiple range test)对不同数据之间进行分析.

2 结果与分析 2.1 解磷细菌的筛选和鉴定

培养1周后，通过平板涂布稀释法，共筛选出17种细菌和2种真菌，其中的两种解磷细菌T PSB1和T PSB2能形成相对较大的解磷圈，通过原核微生物16S rRNA基因序列测序分析，其序列大小分别为1 451 bp和1 438 bp,与嗜麦芽寡养单胞菌和唐菖蒲伯克霍尔德菌的同源性最高，分别达到了99.65%和99.86%，GenBank的登录号为KC503914.1和AY297695.1.

2.2 无机磷可溶磷量

从图 1可看出，两株解磷细菌T PSB1和T PSB2在刚接种的第1 d，解磷量快速升高，分别达到213.4 mg ·L^-1和164.9 mg ·L^-1. 在接种的第2 d，解磷量出现了先下降，后上升的趋势，分别在培养到第8 d和第9 d达到最高值，分别为402.9 mg ·L^-1和589.9 mg ·L^-1. 随后，解磷量缓慢下降，在培养的最后4 d，液体培养基中的可溶性磷含量基本保持稳定. 从图 1(a)中可看出，T PSB1在培养了1 d后，培养基的pH从7.2降为最低值4.95，然后缓慢上升，第14 d时达到最大值. 从图 1(b)中看出，T PSB2在培养了1 d后，pH也迅速下降，在第3 d时达到最低值5.62，然后到第14 d时达到最高值.

图 1

Fig. 1

图 1 两株解磷细菌的溶磷量和pH值随时间的变化Fig. 1 Phosphate solubilization capacity and pH values of the two phosphate solubilizing bacteria with the change of time

2.3 有机磷可溶磷量及酸性磷酸酶量

如图 2所示，T PSB1和T PSB2均能在有机磷平板上生长并形成解磷圈，相比之下，T PSB2形成的解磷圈更明显，且直径较T PSB1大，说明在固体培养条件下，T PSB2对于卵黄中的难溶性有机磷降解效率强于T PSB1. 液体培养1周后，测定培养基中可溶性磷含量(如表 1)，T PSB2培养基中可溶性磷含量为4.69 mg ·L^-1，比T PSB1的2.97 mg ·L^-1高，并且培养基中的酸性磷酸酶含量也比T PSB1高. 与空白组进行对比，两株解磷细菌分泌的酸性磷酸酶量和培养基的可溶性磷含量均要高，说明两种细菌对难溶性有机磷的降解与其分泌的酸性磷酸酶的量相关.

图 2

Fig. 2

图 2 两株解磷细菌在有机磷平板上的解磷圈Fig. 2 Halo of the two phosphate solubilizing bacteria on the plates with organic phosphorus

表 1(Table 1)

表 1 三组有机磷实验的培养基的理化性质1)Table 1 Properties of the media used in the three different treatments 接种解磷菌 pH值 解磷量 /mg ·L-1 酸性磷酸酶含量 /mg ·L-1 CK 5.40±0.55a 1.46±0.55a 0a T PSB1 4.82±0.16b 2.97±0.37b 47.64±0.58b T PSB2 4.68±0.1b 4.69±0.61c 54.88±0.50c 1)表中的数值均为3个重复实验的平均值±标准差，每列数字后不同的字母表示在P<0.05水平下数值的差异显著

表 1 三组有机磷实验的培养基的理化性质1)Table 1 Properties of the media used in the three different treatments

2.4 重金属对解磷细菌可溶磷量的影响 2.4.1 固体培养条件下对解磷细菌生长的影响

在培养1周后，对每个平板上的菌落直径CD值分别进行测定，如表 2. 两株细菌对Zn²⁺和Pb²⁺的抗性非常高，在最高浓度为2 000 mg ·L^-1的条件下仍然能够生长，菌落的大小随着重金属浓度的升高而逐渐降低. 两株细菌在Cr²⁺浓度为500 mg ·L^-1的平板上均能生长，而在1 000 mg ·L^-1和2 000 mg ·L^-1的平板上，菌落生长受到了限制，没有形成菌落，CD值为0.

2.4.2 固体培养条件下菌落和解磷圈直径的测定

在培养1周后，对每个平板上的菌落HD值和CD值分别测定，分别记录于表 2和表 3，然后得到含3种重金属培养条件下的HD/CD值，如图 3. 从表 2和表 3看出，两株细菌对Zn²⁺的抗性非常高，在最高浓度2 000 mg ·L^-1的条件下即可以生长，并且还具有解磷能力，HD/CD值随着浓度的升高而降低(图 3). 在含Cr²⁺浓度超过1 000 mg ·L^-1的平板上，由于两株细菌不能生长，因此没有形成解磷圈. T PSB2在浓度为500 mg ·L^-1条件下可以形成解磷圈，而T PSB1在该浓度下只有生长活性，没有形成解磷圈. 两株细菌对于Pb²⁺的抗性也非常高，浓度 为2 000 mg ·L^-1的平板上依然可以长出菌落，但浓度为1 000 mg ·L^-1和2 000 mg ·L^-1时，两株细菌均没有形成解磷圈，HD/CD值则为0.

表 2(Table 2)

表 2 两株细菌在不同重金属平板上的菌落直径 (CD)1)Table 2 Colony diameter (CD) of these two bacteria on different heavy metal plates 项目 空白/mg ·L-1 Pb2+/mg ·L-1 Cr2+/mg ·L-1 Zn2+/mg ·L-1 0 100 500 1 000 2 000 100 500 1 000 2 000 100 500 1 000 2 000 T PSB1 CD/mm 5.6a 7.4b 5.4a 3.8c 3.4c 6.8b 2.5c 0d 0d 5.4a 5.4a 4.2b 3.5b T PSB2 CD/mm 4.9a 6.1b 4.2c 3.2d 2.5e 4.7a 4.5a 0b 0b 6.8b 5.7ab 3.8c 3.9c 1)表中的数值均为5个重复实验的平均值，数字后不同的字母表示在P<0.05水平下数值的差异显著

表 2 两株细菌在不同重金属平板上的菌落直径(CD)1)Table 2 Colony diameter (CD) of these two bacteria on different heavy metal plates

表 3(Table 3)

表 3 两株细菌在不同重金属平板上的解磷圈直径 (HD)1)Table 3 Phosphate halo diameter (HD) of these two bacteria on different heavy metal plates 项目 空白/mg ·L-1 Pb2+/mg ·L-1 Cr2+/mg ·L-1 Zn2+/mg ·L-1 0 100 500 1 000 2 000 100 500 1 000 2 000 100 500 1 000 2 000 T PSB1 HD/mm 11.4a 10.4a 12.8b 0c 0c 9.0b 0c 0c 0c 10.4a 9.2b 6.4c 4.8d T PSB2 HD/mm 8.9a 7.3b 3.4c 0d 0d 8.7a 7.3b 0c 0c 8.6a 7.1b 6b 4.2c 1)表中的数值均为5个重复实验的平均值，数字后不同的字母表示在P<0.05水平下数值的差异显著

表 3 两株细菌在不同重金属平板上的解磷圈直径 (HD)1)Table 3 Phosphate halo diameter (HD) of these two bacteria on different heavy metal plates

图 3

Fig. 3

图 3 两株细菌在不同平板上的HD/CD值Fig. 3 HD/CD values of these two bacteria on different plates

2.4.3 液体培养条件下的可溶磷含量

在接种两株解磷菌的第1、 5、 10、 15 d分别测定每个实验组的培养基上清液中可溶性磷的含量. 从图 4中可以看出，溶磷量在3种重金属培养基中均随着重金属浓度的升高而降低. 而在3种重金属培养基中，两株细菌在含有Zn²⁺的培养基中具有很高的解磷率[如图 4(e)和图 4(f)]. 培养第5 d时，Zn²⁺最高浓度2 000 mg ·L^-1下的可溶性磷量达到最高值，分别为114.8 mg ·L^-1和125.1 mg ·L^-1，而在不含Zn²⁺的培养基中可溶性磷含量分别为190.27 mg ·L^-1和192.44 mg ·L^-1，即在2 000 mg ·L^-1的Zn²⁺浓度培养条件下，两株解磷菌的可溶性磷含量均超过了对照组的50%. 在培养的第10 d和第15 d，高浓度重金属离子的培养基中可溶性磷含量逐渐降低. 在固体培养的条件下，两株细菌在浓度为1 000 mg ·L^-1和2 000 mg ·L^-1的Cr²⁺平板上不能形成菌落，而在液体培养条件下，两株细菌对于铬的抗性要高，在1 000 mg ·L^-1浓度下，两株细菌T PSB1和T PSB2的解磷量分别在接种的第15 d和第10 d达到了最高值，为60.1 mg ·L^-1和98.4 mg ·L^-1. T PSB1在Cr²⁺浓度为2 000 mg ·L^-1的液体培养条件下不能生长[如图 4(c)]，而T PSB2在该浓度下依然能生长，并且解磷量也在接种的第10 d达到了最高值76.6 mg ·L^-1[如图 4(d)]. 相比前两种重金属，Pb²⁺在液体培养的条件下对两株解磷细菌的抑制性最强，浓度在2 000 mg ·L^-1时，两株细菌均不能生长，T PSB1在1 000 mg ·L^-1浓度下在培养第5 d测定出最高溶磷量为57.9 mg ·L^-1[如图 4(a)]，T PSB2同样在第5 d达到最高值71.7 mg ·L^-1[如图 4(b)]. 从图 4中分析发现，两株细菌对于锌的抗性均非常高，浓度超过了2 000 mg ·L^-1，而在Pb²⁺和Cr²⁺的液体培养条件下，细菌T PSB2对于Pb²⁺和Cr²⁺的抗性要高于T PSB1.

图 4

Fig. 4

图 4 两株细菌在3种重金属5种浓度下培养基中可溶性磷含量在15 d内的变化Fig. 4 Changes of the soluble phosphate amounts of the two bacteria in the mediums containing three heavy metals at five concentrations in fifteen days

3 讨论

土壤中解磷微生物的种类非常多，其中以细菌的种类最多，常见的具有解磷特性的细菌种类有：根瘤菌属、 克雷白氏杆菌属、 肠杆菌属、 泛菌属、 欧文氏菌属、 假单胞菌属和芽孢杆菌属等^{[7, 19, 20]}. 本研究筛选到的两株细菌，经鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌和唐菖蒲伯克霍尔德菌. 在含有难溶性磷酸钙的液体培养基中培养1周后，其解磷量最高分别达到402.9 mg ·L^-1和589.9 mg ·L^-1，解磷率分别达到19.7%和28.8%，同时，在有机磷液体培养基中，其解磷量也达到了2.97 mg ·L^-1和4.69 mg ·L^-1. 余贤美等^[21]筛选到1株平板培养条件下HD/CD值为4.13的解磷菌，液体培养条件下的溶磷量在第4 d达到了218.6 μg ·mL^-1. Park等^[22]将筛选到的14株解磷细菌接种于NBRIP液体培养基14 d后发现最高的溶磷量可以达到479.2 mg ·L^-1. 相比较而言，本研究中筛选到的两株细菌具有较强的解磷能力.

高浓度的重金属是矿区土壤生物修复过程中最重要的限制性因素，因此需要筛选一些具有很强抗性的微生物作为菌剂使用. 杨亮等^[23]从土样中分离出能在Pb²⁺浓度为750 mg ·L^-1的培养基中生长的抗性镰刀菌属真菌，同时发现该种真菌在该浓度下对铅的吸附率达到了77.9%. Lai等^[24]从样品中分离到对1 000 mg ·L^-1的Cr⁶⁺具有抗性的菌株，并且发现这些菌株不仅具有很高的Cr⁶⁺抗性，同时在含有Cu、 Pb和Fe的重金属培养基中仍然具有生长活性. 刘云国等^[25]分离到1株同时具有铜和锌抗性的曲霉，其最低抑制浓度分别为400 mg ·L^-1和800 mg ·L^-1. 而本研究从铅锌矿区表层土壤中所筛选到的两株解磷细菌，除了具有很强的无机磷以及有机磷解磷能力之外，对于重金属Pb²⁺、 Zn²⁺和Cr²⁺的抗性也非常强，抗性浓度最高达到了2 000 mg ·L^-1.

本研究通过测定在含有重金属的培养基中两种解磷细菌解磷能力的变化情况，发现培养基中可溶性磷含量随着重金属浓度的升高而降低. 其原因可能由于重金属对于可溶性磷化合物具有很强的吸附性，同时形成难溶性的重金属磷酸化合物^[26]，这些化合物不容易被解磷微生物降解，导致溶液中可溶性磷的降低. 两种解磷细菌，在高浓度培养条件下，仍然具有解磷性，尤其在Zn²⁺培养基中，2 000 mg ·L^-1浓度下的解磷量的最高值达到了114.8 mg ·L^-1和125.1 mg ·L^-1，说明本研究获得的两种解磷细菌，既具有非常高的对Zn、 Pb和Cr的抗性，同时在高浓度培养条件下，仍然具有很好的解磷性. 因此，这两种细菌具有用作微生物菌剂作为生物修复的工具来改善矿区土壤理化性质的潜能.

4 结论

(1)本研究从湖南省湘西自治州花垣县铅锌矿的表层土壤中，筛选出两株具有较强解磷能力的解磷细菌，经16S rRNA基因测序分析鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(T PSB1)和唐菖蒲伯克霍尔德菌(T PSB2).

(2)在含有难溶性磷酸钙的液体培养基中接种该两株细菌T PSB1和T PSB2，培养1周后发现培养基上清液中所含有的可溶性磷含量最高达到了402.9 mg ·L^-1和589.9 mg ·L^-1. 同时两株细菌还被证实具有有机磷降解特性，通过液体培养基中可溶性磷含量和酸性磷酸酶含量的检测，发现两株细菌有机磷降解的效率同分泌的酸性磷酸酶相关.

(3)两株细菌对重金属Zn、 Pb和Cr具有很强的抗性，能分别在含Zn²⁺浓度为2 000 mg ·L^-1和Pb²⁺、 Cr²⁺浓度为1 000 mg ·L^-1的培养基中生长，并且通过无机磷液体培养基上清液中可溶性磷含量的检测发现，两株细菌在含有最高浓度的重金属培养基中依然具有解磷特性.

致谢：在土样采集和对土样理化性质分析过程中，得到了中国林业科学院林业研究所博士后赵秀莲的帮助，在此表示感谢.