微生物燃料电池(microbial fuel cells，MFCs)是一种利用微生物的代谢将废水中污染物的化学能转化为电能的废水处理技术^{[1, 2]}. 光合微生物应用于MFCs中产生了光合微生物燃料电池(photosynthesis microbial fuel cells，photoMFCs)，实现污染物降解产生绿色能源的同时将光能转化为电能，因而受到科研工作者越来越多的重视^{[3, 4]}. 产电光合微生物的富集是photoMFCs能量转换的基础，也是电池启动的限速步骤之一^{[5, 6]}. 光照促进光合微生物的富集，恒电位有助于产电菌快速形成菌膜. Wang等^[7]发现0.2 V(vs. Ag/AgCl) 电位促进产电微生物在阳极表面形成生物膜. Finkelstein等^[8]发现更高的电位可以加快阳极微生物的富集从而缩短MFCs的启动时间，因此光照条件下控制合理的电位有利于快速驯化得到光合产电微生物，缩短photoMFCs的启动时间. 研究光照条件下不同电位对微生物群落多样性的影响，有助于加深对光合微生物改善photoMFCs性能机制的认识.

随着分子生物学理论和技术的快速发展，一些基于PCR的分子指纹技术已广泛应用于环境微生物种群结构分析，这些技术不依赖于微生物实验室培养方法，通过基因指纹图谱即可对微生物群落多样性及其时空动态进行分析，分子指纹技术中尤以变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)^[9]和末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)^[10]两种方法应用最为广泛.

本研究采用三电极体系控制电极电位，通过DGGE和T-RFLP两种技术分别考察0、 0.2、 0.4和0.6 V(vs. Ag/AgCl)下光照培养25 d后电极生物膜细菌群落多样性，同时比较了DGGE和T-RFLP这两种分子生态学方法在评价细菌多样性的优缺点，以期为选择适合的方法分析微生物群落多样性提供参考．

1 材料与方法 1.1 实验装置

实验装置如图 1所示. 三电极体系由100 mL 广口瓶制成，工作电极和对电极材料均为碳毡，几何面积分别为4 cm²(2 cm×2 cm)和 6 cm²(1.5 cm×4 cm)，电极使用前依次用 0.1 mol ·L^-1 HCl和0.1 mol ·L^-1 NaOH浸泡去除表面吸附物，参比电极为Ag/AgCl(3 M sat. KCl). 广口瓶加橡胶塞以保证三电极体系处于厌氧状态，工作电极和对电极用钛丝引出，与参比电极一起固定于橡胶塞.

图 1

Fig. 1

图 1 实验装置示意Fig. 1 Diagram of experimental setup

1.2 光照条件下不同电压驯化污泥

接种污泥采自厦门集美污水厂二沉池，每个三电极体系接种8.0 g污泥，加入人工废水，人工废水成分为: CH₃COONa(0.82 g ·L^-1)，KH₂PO₄(6.28 g ·L^-1)，NaHCO₃(2.0 g ·L^-1)，K₂HPO₄(10.0 g ·L^-1)，Na₂SO₄(0.5 g ·L^-1)，NaCl(0.5 g ·L^-1)和MgSO₄ ·7H₂O(0.2 g ·L^-1). 4个实验组采用电池测试系统(Maccor，美国)分别设置恒电位0、 0.2、 0.4、 0.6 V(vs. Ag/AgCl)，3000 lx光强条件下28℃培养25 d.

1.3 微生物DNA 提取

工作电极用磷酸钠盐缓冲液(50 mmol ·L^-1，pH 7.0)洗涤2次后，采用环境样品总DNA提取试剂盒(百泰克，北京)提取工作电极表面菌膜基因组DNA. 提取的DNA用灭菌高纯水溶解后，-20℃保存.

1.4 PCR扩增

以提取的DNA做模板，采用不同的引物(表 1)进行扩增，其中用于DGGE的引物为341F-GC和534R^[11]，用于T-RFLP的引物为27F和1492R^[12]，其中27F的5′端以荧光染料FAM标记. PCR反应体系组成: 10×PCR buffer 2 μL、 dNTP 2 μL、 正向引物1 μL、 反向引物1 μL、 Taq 酶(5 U ·μL^-1) 0.125 μL、 模板DNA 1 μL，蒸馏水补足至25 μL. PCR扩增的温度程序分别如下.

表 1(Table 1)

表 1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers 引物名称 序列(5′ 3′) 27 F-FAM AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492 R GGTTACCTTGTTACGACTT 341 F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 534 R ATTACCGCGGCTGCTGG

表 1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers

DGGE：采用降落 PCR 策略，95℃预变性 5 min； 前10个循环为95℃ 40 s，56~51℃ 40 s，(每个循环后复性温度下降低0.5℃)，72℃延伸45 s； 后20个循环采用95℃ 40 s，51℃ 40 s，72℃延伸45 s； 最后72℃延伸10 min； 4℃保存.

T-RFLP：95℃，预变性5min； 95℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 90 s，30个循环； 72℃，7 min； 4℃保存.

1.5 分子生态学分析方法 1.5.1 DGGE

采用Dcode基因突变检测系统(伯乐公司，美国)对16S rRNA 基因V3区扩增产物进行DGGE电泳分析. 所用聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%(质量浓度)，变性剂浓度梯度为30%~45%，电泳缓冲液为1×TAE，运行条件如下: 电泳温度60℃，40 V预电泳30 min，然后90 V电泳13 h. 电泳结束后，凝胶用SYBR Green I染色30 min，凝胶成像系统观察条带，使用 Quantity One 1-D软件分析. 对较亮的条带进行切割、 纯化、 扩增、 连接、 克隆后测序，将所测序列与 GenBank数据库中的已有序列进行 BLAST比对，获得相似性较高的16S rRNA基因序列，采用Clustal W、 MEGA 5.0 软件进行分析，邻接法(Neighbor-Joining Method)构建系统发育树图，1000次随机抽样，计算自引导值(Bootstrap)以评估系统发生树的置信度．

1.5.2 T-RFLP

16S rRNA基因扩增产物纯化后分别用Hae Ⅲ^[13]和MspⅠ^[14](TaKaRa，大连)进行酶切，反应体系为20 μL，37℃ 酶切6 h，65℃灭活15 min. 酶切产物乙醇沉淀脱盐后与内标GS500混合，ABI3700 DNA测序仪进行毛细管电泳检测(委托华大基因完成)，所得电泳图谱用软件GeneMarker进行分析. 结果处理后上传至http://trflp. limnology. wisc. edu/assignment. jsp进行比对分析. 碱基大小在 50 bp以下以及相对峰面积小于1%的末端限制性片段(terminal restriction fragment，T-RF)不予统计.

2 结果与讨论 2.1 DGGE分析不同电位下电极生物膜细菌群落多样性 电极生物膜细菌16S rRNA基因V3 区扩增产物经DGGE分离，图谱扣除背景和修正条带后如图 2所示，不同电位下电极样品DGGE图谱条带的数目和位置均有一定的差异. 从中可以看出: 0 V(vs. Ag/AgCl)电位下，电极生物膜细菌DGGE所得条带较多且分布紧密，说明该电极生物膜细菌群落具有较高的多样性. 0.6 V(vs. Ag/AgCl)下电极生物膜细菌DGGE条带数量较其它电位明显降低，高电位下电极生物膜细菌群落的多样性降低，可能较高的电位更有利于产电菌的富集使得细菌菌群多样性降低.

图 2

Fig. 2

1: 0 V；2: 0.2 V；3: 0.4 V；4: 0.6 V图 2 光照及不同电位下电极生物膜细菌16S rRNA基因 V3 区DGGE图谱Fig. 2 DGGE pattern of 16S rRNA V3 region of bacterial of biofilm on electrode at different potentials under illumination

DGGE 图谱还表明4个电位下电极生物膜细菌中既有共同的种类，也有自己独特的种属，形成了各自特定细菌群落多样性. 切胶回收图谱中16个较亮的条带，测序后构建系统发育树(图 3). 条带7、 8、 11、 13、 14、 15、 16的亮度较强，且在4个泳道中都有分布，这些条带测序结果表明光照条件下本研究设置的4个电位电极微附着的细菌主要包括 α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、 β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和 梭菌纲(Clostridia). 条带7与梭菌Clostridium sticklandii strain DSM 519序列相似性最高，该条带在0 V(vs. Ag/AgCl)电极样品图谱中最亮，说明该菌在0 V(vs. Ag/AgCl)电极含量最为丰富； 条带5序列相似性最高的是Uncultured bacterium clone MB_P17，该条带只在0.6 V(vs. Ag/AgCl)电极生物膜中分布，10号条带序列相似性最近的是β-变形菌纲(β-Proteobacteria)，该条带在0 和 0.4V(vs. Ag/AgCl)两个电极生物膜都有分布，但在0.4 V(vs. Ag/AgCl)电极生物膜含量最为丰富； 与光合细菌序列相似性最高的条带是4、 14和16，这3个条带在0、 0.2、 0.4、 0.6 V(vs. Ag/AgCl)电极生物膜中都有分布，测序的16条带，与梭菌和变形菌序列相似性最高的占了11条，可见变形菌和梭菌是电极光照恒电位下生物膜中的优势菌种，目前文献报道变形菌和梭菌都有产电菌分布^[15].

图 3

Fig. 3

分枝节点数值表示 bootstrap(1 000次抽样)的支持百分率图 3 光照及不同电位下电极生物膜细菌16S rRNA基因 V3 区系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of 16S rRNA V3 region of bacterial of biofilm on electrode at different potentials under light

2.2 T-RFLP分析不同电位下电极生物膜细菌群落多样性

光照条件下不同电位电极生物膜细菌16S rRNA基因PCR产物经Hae Ⅲ或MspⅠ酶切，毛细管电泳获得T-RFLP图谱. GeneMarker软件对片段长度在70~500 bp，且相对峰面积大于1%的T-RF进行统计分析(图 4)，由图 4知同一样品扩增产物经不同酶切所得到T-RF长度和数量都有一定的差异，0、 0.2、 0.4、 0.6 V(vs. Ag/AgCl)电位下电极生物膜细菌16S rRNA基因PCR产物经Hae Ⅲ酶切得到的T-RF数量分别为: 5、 10、 8、 6，经MspⅠ酶切获得的T-RF数量分别为：3、 9、 9、 8. 在0 V(vs. Ag/AgCl)电位下，电极生物膜细菌16S rRNA基因PCR产物经MspⅠ酶切的T-RFLP图谱中，长度为125 bp的T-RF相对峰面积为95.28%，使得大量低丰度T-RF的荧光信号被掩蔽，得到的T-RF数量偏低，不利于反映样品真实的细菌群落多样性，因此内切酶的选择直接影响到T-RFLP结果.

图 4

Fig. 4

图 4 光照及不同电位下电极生物膜细菌末端限制性片段的相对百分含量Fig. 4 Relative abundance of T-RFs of bacterial of biofilm on electrode at different potentials under illumination

2.3 DGGE与T-RFLP分析细菌群落多样性比较

DGGE图谱中的条带相当于T-RFLP图谱的T-RF，DGGE图谱中条带的亮度与T-RFLP图谱T-RF峰面积对应，代表了该片段的浓度，即相应群落的相对数量^{[16, 17]}. 本研究采用DGGE和T-RFLP分别对光照条件下不同电位电极生物膜细菌进行多样性分析，两种方法对同一样品分析结果有一定的差异，DGGE结果显示0 V(vs. Ag/AgCl)电极生物膜细菌多样性最丰富，但采用T-RFLP分析时，Hae Ⅲ和MspⅠ两种酶切结果都表明该电位下电极生物膜细菌获得的T-RF数量最少. 同一批样品两种方法得出差异的结论，这也是目前基于PCR发展起来的分子生态学方法存在的一个共同问题^[18]. DGGE和T-RFLP进行分子生态学分析的原理都是科学的，但实际操作中例如PCR扩增条件及DNA提取效果等因素的干扰都会造成分析结果的差异，实际操作过程中只能尽量减少干扰，但还是无法做到完全准确地根据获得的图谱反映真实的种群结构，故无法单纯的根据实验结果评判DGGE和T-RFLP两种方法的优劣.

DGGE技术具有重复性好等优点^[19]，且能对图谱进行杂交或直接克隆测序分析，这极大地提高了DGGE的分析能力，但是DGGE分析也存在着以下不足：①分辨率低和灵敏性差，Muyzer等^[9]报道DGGE对于丰度低于1%的种群相对难检测； ②胶浓度、 PCR条件等对DGGE图谱影响显著^[20]； ③其检测的DNA片段长度有限，获得菌种的信息少^[21]； ④一条DGGE带可能代表几种菌，不同的几条DGGE带也可能代表同一种细菌^[22]； ⑤不能进行准确的种群定量分析和基因表达的水平检测^[23].

与DGGE技术相比，T-RFLP技术具有高通量、 操作简单、 灵敏度高等优点^[24]. 正是由于该技术的灵敏度高，所以PCR、 酶切等步骤差异会导致相当大的误差，且PCR 过程引入的误差没有规律性. 另外单纯的T-RFLP 技术虽然可以提供微生物相对数量信息，但不能对图谱进行杂交或直接克隆测序分析，无法确定是何种微生物，定性信息不足. 由于数据库，尤其是除了rRNA基因之外的其它功能基因库的不完善，某些出现在 T-RFLP中的 R-TF可能找不到匹配的对象.

综上所述，DGGE、 T-RFLP两种分子生态学方法在分析微生物种群多样性时各有优劣. 因此，应根据实验要求，充分考虑各个方法的基础背景和优缺点，选择合适的方法，或者通过多种方法组合弥补各自方法的不足，得到更准确全面的分子生态学信息.

3 结论

(1) DGGE结果显示光照条件下不同电位电极生物膜细菌主要属于α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、 β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和梭菌纲(Clostridia).

(2) T-RFLP结果显示0.2 V(vs. Ag/AgCl)处理下T-RF的数量最高，片段数量随电压进一步升高呈现降低趋势.

(3) DGGE或T-RFLP需要与其他分子生物学技术结合，才能更好地评价环境因素如电位对微生物群落的种群多样性的影响.