海底生物圈蕴藏着巨大的生物量，在全球生物化学循环过程中起着重要作用. 海洋沉积物等极端环境中蕴藏着大量的细菌和古菌^[1,2]. 据估计，深海沉积物中的微生物数量约占地球上微生物总量的1/2～5/6，占地球生物量的1/10～1/3^[3,4]. 古菌类群是深海沉积物中的优势类群，其中产甲烷菌被认为是促进油气田及碳水化合物形成过程中的重要微生物. 海洋沉积物中含有动植物残骸，存在着不同的有机物，促进了厌氧微生物的生长. 大量研究表明一些天然气田和海洋中的碳水化合物主要是由生物成因的甲烷形成的^[5,6]. Grabowski等^[7]对低温油藏样品中的产甲烷菌进行了解析，发现分子生物学方法鉴定的优势产甲烷菌与培养法获得的产甲烷菌相吻合. 该结果说明对于低温油藏环境来说，培养法获得的产甲烷菌在很大程度上代表油气藏中优势产甲烷菌的实际情况，传统培养法是研究油气藏环境中产甲烷菌的一种有效手段. 目前，有关油藏中微生物群落的研究较多，但是生物成因天然气田中的相关微生物群落信息较少. 海洋产甲烷古菌是环境与能源领域密切相关的微生物类群，其研究对于海洋油气田中甲烷形成机制、 天然气水合物的开发及二氧化碳固定具有重要意义. 本研究考察了海洋油气田样品的产甲烷活性，利用培养法对其中的产甲烷微生物多样性进行了解析.

1 材料与方法 1.1 样品采集及培养基

采用3种海洋油气田沉积物作为考察对象，样品pH在7.3~7.8之间(表 1). 东海油气田沉积物(代号EG)，于2012年7月采集； 渤海油气田沉积物2种(代号BO1，BO2)，于2012年11月由中国海洋大学 “东方红2”号考察船采集. 沉积物的采集使用抓斗式采泥器，沉积物采集后放入50 mL无菌离心管中4℃保存.

表 1(Table 1)

表 1 海洋沉积物样品特性1)Table 1 Characteristics of samples collected from marine sediments 样品 来源 深度/m pH 经度 纬度 EG 东海 — 7.3 — — BO1 渤海 27.5 7.4 120°11.733′E 38°20.126′N BO2 渤海 25 7.8 119°47.567′E 38°19.858′N 1) “―”表示未能获取相关信息

表 1 海洋沉积物样品特性1)Table 1 Characteristics of samples collected from marine sediments

产甲烷活性实验及产甲烷菌的分离培养，采用不含硫酸盐的人工海水培养基. 因为硫酸盐的存在会促进硫酸还原菌的生长，对产甲烷古菌产生竞争作用，而且有可能消耗甲烷^[8]. 培养基以氮气和二氧化碳混合气体 (N₂ ∶CO₂=80 ∶20,体积比)置换液体培养基中的气体. 本研究采集样品的pH为7.5左右，而且大量研究表明偏碱性有利于大多数产甲烷菌的生长，因此本实验采用的培养基pH为7.5.

1.2 产甲烷活性评价

产甲烷活性实验以H₂/CO₂(80 ∶20,体积比,0.2 MPa)、 甲酸、 乙酸、 甲醇、 一甲胺、 三甲胺、 2-丙醇，2-丁醇等(5 mmol ·L^-1)作为评价指标，利用气相色谱定期测量甲烷产量，评价油气田沉积物对不同底物的产甲烷活性. 沉积物样品用PBS磷酸缓冲液清洗2次以除去碳源，将沉积物用培养基悬浮，转移到60 mL血清瓶中(液体20 mL)，于25℃和37℃避光静置培养. 实验周期为60 d，每隔7 d测定甲烷产量. 氢气及甲烷采用SP-6890型气相色谱测定^[9].

1.3 产甲烷菌的富集培养

为获得油气田中优势产甲烷菌，以上述具有产甲烷潜力的培养系为植种源，进行富集培养. 以甲烷产量为判断指标，当甲烷产量接近理论产量的50%~80%，传代培养于新鲜培养基中，接种量为10%. 对于富集的培养系，采用液体系列稀释法、 亨盖特滚管技术，添加抗生素等各种传统分离培养方法进行产甲烷菌的分离纯化. 固体培养基采用高纯琼脂(2%)作为凝胶物质. 选用氨苄西林(ampicillin)、 盘尼西林(penicillin)、 卡那霉素(kanamycin)及四环素(treptomycin)这4种抗生素进行产甲烷菌的纯化.

1.4 DNA提取、 PCR扩增及系统解析

采用直接测序法对高度富集或纯化的培养系进行了解析. DNA提取采用玻璃珠及氯仿-苯酚提取法. 16S rRNA基因的PCR(Polymerase Chain Reaction)反应采用产甲烷古菌的特异性引物ARC 109F - UNIV 1492R^[9]. PCR产物用天根生化科技有限公司的试剂盒纯化(TIAN quick Midi Purification Kit)，测序由上海桑尼生物科技有限公司完成，于GenBank数据库进行序列比对.

2 结果与分析 2.1 油气田沉积物产甲烷活性

产甲烷潜力实验(图 1)可以反映海洋沉积物中产甲烷菌的微生物活性. 以3种海洋油气田沉积物作为研究对象，以产甲烷菌可能利用的底物作为碳源：①氢营养型，H₂/CO₂及甲酸； ②乙酸发酵型，乙酸； ③甲基发酵型，甲基类化合物(如甲醇、 一甲胺、 三甲胺)及其他一些醇类(如2-丙醇、 2-丁醇). 海水温度接近25℃，而大部分产甲烷菌在中温37℃条件下生长更快，因此采用25℃和37℃评价产甲烷菌活性. 如图 1所示，3种样品在60 d实验周期，对于不同底物两种温度下的产甲烷活性如下：甲醇>三甲胺>H₂/CO₂>一甲胺； 氢营养型底物主要是H₂/CO₂，3种样品在25℃及37℃都有较高的氢气利用活性； 以一甲氨为底物时，同一样品对于培养温度具有选择性，如东海样品只在37℃有活性，而渤海-2样品只在25℃有活性； 乙酸为底物时，东海与渤海-1这2种油气田样品在37℃有活性，而25℃条件下培养6个月均没有活性； 以甲酸、 2-丙醇、 2-丁醇为底物时都没有甲烷产生，延长培养6个月也没有活性(数据未显示). 活性实验结果表明，在海洋油气田环境下，主要是氢营养及甲基营养型途径产生天然气甲烷. 不同来源的海洋油气田沉积物，在不同底物和温度下，表现了复杂的产甲烷活性，整体来说37℃培养条件的产甲烷速率高于25℃.

图 1

Fig. 1

图 1 油气田样品对不同底物的60 d甲烷产量Fig. 1 Methane production from different substrates by gas field samples after 60 days incubation

2.2 产甲烷菌的富集培养

以具有产甲烷活性的培养系为接种源，以H₂/CO₂、 甲醇、 一甲胺及三甲胺作为底物，进行传代培养. 获得了具有产甲烷活性的培养系23个，其中甲醇的活性最高，传代频率为3~5 d、 三甲胺为5~7 d、 H₂/CO₂为1~2周、 一甲胺为1~3周. 采用各种传统分离培养方法进行产甲烷菌的分离纯化，获得的海洋产甲烷培养系及菌株如图 2所示.

图 2

Fig. 2

图 2 海洋油气田沉积物获得的产甲烷菌位相差照片 (标尺为10 μm)Fig. 2 Phase-contrast micrographs of methanogens obtained from marine gas field sediments

2.3 16S rRNA系统鉴定

采用16S rRNA直接测序法，对产甲烷菌基本纯化的培养系(富集6代以上)或纯菌株进行解析，23个体系中的优势产甲烷菌主要属于Methanosarcinales目Methanosarcinaceae科及Methanomicrobiales目Methanomicrobiaceae科，共计5个属、 10个种，与已知产甲烷菌相似度在95%~100%(表 2). 3种油气田样品，以H₂/CO₂为底物在两种温度条件下，获得的产甲烷菌属于3个属的4个种：Methanosarcina barkeri、 Methanogenium frigidum、 Methanogenium cariaci 及 Methanoculleus submarinus. 这些产甲烷菌都属于氢营养型产甲烷菌，主要利用氢气和甲酸盐，只有Methanosarcina barkeri还可以利用醋酸、 甲醇、 甲胺、 丙醇等^[10]. Methanogenium cariaci 和 Methanoculleus submarinus都分离自海洋沉积物，是海洋沉积物中的常见产甲烷菌^[11,12]. 而Methanosarcina barkeri、 Methanogenium frigidum分离自淡水环境，但具有一定的耐盐性^[10,13].

表 2(Table 2)

表 2 海洋油气田富集培养的产甲烷菌16S rRNA基因解析 1)Table 2 Methanogens of the enrichment cultures from marine gas field determined by 16S rRNA gene-based direct sequence analysis 1)H2/CO2 为 200 kPa，其余底物浓度均为5 mmol ·L-1

表 2 海洋油气田富集培养的产甲烷菌16S rRNA基因解析1)Table 2 Methanogens of the enrichment cultures from marine gas field determined by 16S rRNA gene-based direct sequence analysis

以甲醇为底物获得的优势产甲烷菌都属于Methanosarcinales目Methanosarcinaceae科的3个属Methanosarcina、 Methanolobus和Methanococcoides. 25℃的培养条件下所获得的优势产甲烷菌都与Methanococcoides methylutens近缘，而在37℃的培养条件下，3种样品所获得的优势产甲烷菌不同，分别与Methanolobus zinderi、 Methanococcoides methylutens和Methanosarcina siciliae近缘. Methanococcoides methylutens、 Methanolobus zinderi和Methanosarcina siciliae都是甲基营养型产甲烷菌. Methanolobus zinderi首先分离于煤层中的盐水中，能在高盐的培养基中生长，而且在海水的盐度范围内生长更快^[14]； Methanosarcina siciliae分离于湖泊沉积物，轻微嗜盐具有耐盐性^[15].

以一甲胺为底物在两种温度条件下获得的产甲烷菌都与Methanococcoides methylutens近缘(相似性99%~100%). Methanococcoides methylutens分离于海洋沉积物，是甲基营养型产甲烷菌，主要利用甲基类的碳源，如甲醇、 一甲胺、 二甲胺、 三甲胺^[16]. 以三甲胺为底物所获得的6个培养系中，优势产甲烷菌都属于Methanosarcinales目Methanosarcinaceae科的2个属Methanosarcina和Methanococcoides. 其中5个培养系中的产甲烷菌属于Methanococcoides属的3个种：Methanococcoides burtonii、 Methanococcoides methylutens及Methanococcoides alaskense，另一个东海EG样品25℃培养系，优势产甲烷菌与Methanosarcina semesiae近缘. Methanococcoides alaskense和Methanococcoides methylutens首先分离于海洋沉积物^[16,17]； Methanococcoides burtonii分离于南极洲的深水湖泊，但湖泊的粒子组成与海水相似^[18]； Methanosarcina semesiae分离于红树林沼泽，但具有嗜盐性，海水的盐度更适合其生长^[19]. 海洋沉积物中的产甲烷菌大多具有耐盐性，有一些高度耐盐^[20].

3 讨论

在海洋油气田沉积物中存在着各种碳源^[21]. 发酵型细菌将大分子有机物质分解为产甲烷菌能利用的小分子物质，如氢气、 甲基氨及乙酸等，为产甲烷菌的生长提供了底物. 本研究的油气田样品对H₂/CO₂、 甲醇和甲基类化合物有较高的产甲烷活性，说明在海洋油气田环境下，主要有氢营养及甲基营养型途径产生天然气甲烷. 通过富集培养获得5属10种产甲烷菌，均属于Methanosarcinales目及Methanomicrobiales目，大多属于海洋沉积物中的常见产甲烷菌. 这一结论与Grabowski等^[7]在2005年对低温油藏的研究中所获得的优势产甲烷菌相一致. Orphan 等^[22]在2000年对70℃的高温油藏的分子解析结果表明，高温油藏中的优势产甲烷菌同样属于Methanosarcinales目和Methanomicrobiales目，但是其通过富集培养的方法获得的优势产甲烷菌则属于Methanobacteriales目、 Methanomicrobiales目和Methanococcales目. 虽然利用两种方法所获得的优势产甲烷菌有很大差别，但是优势目都有Methanomicrobiales 目，这与本研究所得结果相一致. 其中富集培养获得的Methanobacteriales目中的Methanobacterium属和Methanococcales目中的Methanococcus属均属于高温油田的常见属. 这表明这些嗜热产甲烷菌群在高温油藏中分布广泛，在高温油藏的形成过程中起重要作用. 在富集培养中采用60~90℃的培养温度接近油气田实际环境温度，但是富集培养和分子解析的优势产甲烷菌仍有很大的不同，这与高温油气田的环境在实验室中难以模拟，只控制温度不能模拟实际环境相关. 2012年Zhao等^[23]用分子手段对20.6、 32和37℃的油田样品进行了解析，其中优势产甲烷菌也是Methanosarcinales目和Methanomicrobiales目，而高温油田的优势产甲烷菌则属于Methanosarcinales目和Methanobacteriales目. Wang等^[24]对70℃的高温油田采用富集培养法获得的优势产甲烷菌与Machimaru等^[25]用分子手段对日本海的53℃高温气田的解析结果中获得的优势产甲烷菌相同，均属于Methanosarcinales目和Methanomicrobiales目. 综合本研究及文献报道，Methanosarcinales目、 Methanobacteriales目和Methanomicrobiales目是油气田中的常见产甲烷菌，其中Methanosarcinales目和Methanobacteriales目在高温油田中占优势，而Methanosarcinales目和Methanomicrobiales目在中低温油田普遍存在.

4 结论

(1)本研究的海洋油气田沉积物主要对氢气、 甲醇、 甲胺具有较高的产甲烷活性，而对甲酸盐及乙酸盐则没有微生物活性. 不同来源的海洋油气田沉积物，在不同底物和温度下，表现了复杂的产甲烷活性，整体来说37℃培养条件的产甲烷速率高于25℃.

(2)利用培养法对海洋油气田中的产甲烷菌进行了多样性解析，获得的优势产甲烷菌主要属于Methanosarcinales目的Methanosarcinaceae科及Methanomicrobiales目的Methanomicrobiaceae科，其中Methanococcoides、 Methanogenium和Methanosar-cina为海洋油气田中主要优势菌属，推测与油气田形成相关.

致谢： 在此感谢中国海洋大学海洋地球科学学院王厚杰副教授提供油气田沉积物样品.