2014, Vol. 35
2. 中国科学院南京地理与湖泊研究所, 湖泊与环境国家重点实验室, 南京 210008;
3. 河海大学水文水资源学院, 南京 210098
2. State Key Laboratory of Lake Science and Environment, Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;
3. College of Hydrology and Water Resources, Hohai University, Nanjing 210098, China
氮素是影响湖泊富营养化的关键元素之一，氮素的生物地球化学循环在湖泊营养盐循环中占有重要地位[1]. 硝化作用(NH3→NO-2→NO-3)是氮循环过程的关键步骤，而氨氧化过程(NH3→NO-2)是硝化作用的限速步骤[2]. 微生物是氮循环的驱动者，氨氧化微生物的群落结构、 丰度和活性将直接或间接地影响生态系统中的氨氧化过程[3]. 2005年，Knneke等分离到1株以氨为单一能源自养生长的泉古菌，证实氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)一样，也可以进行氨氧化，一些对河口沉积物[4]、 水生植物根系[5]和湖泊沉积物[6]等生境的研究表明，硝化过程与AOA高度相关. 氨氧化菌在全球具有很广的生态位，总体上看，近年来对氨氧化菌(AOA和AOB)分子生态学的研究还主要集中于土壤和海洋环境[7]. 另外，Coci等[8]研究盐度对氨氧化细菌群落的影响； Herrmann等[9]研究水生植物根系对氨氧化菌群落结构与丰度的影响. 相比较而言，淡水湖泊生态系统中氨氧化菌(特别是AOA)的群落结构、 丰度及活性的研究还比较缺乏，对其生态学功能仍需进一步探索.
在湖泊生态系统中，底栖动物主要是通过掘穴、 沉积物再构造[10]、 生物搬运[11]、 摄食[12]、 排泄[13]和分泌[14]等生命活动改变表层沉积物的理化性质，使得沉积物孔隙率和含水率升高，增加溶解氧在沉积物中的渗透深度[15]，增大水土界面面积，增加溶解态物质的交换通量，促进氨氮向上覆水中的扩散[16]，为氨氧化菌的生长和代谢提供了更多适宜的微环境，也为氨氧化过程提供了更多的电子受体. 底栖动物的活动会通过影响氨氧化微生物的群落组成和活性，最终影响氨氧化过程[17]. 太湖是我国第三大淡水湖，也是我国富营养化较为严重的湖泊. 太湖底栖动物群落结构和多样性研究表明：河蚬(Corbicula fluminea)在太湖贡湖湾等富营养化严重的湖区占绝对优势[18]. 河蚬为瓣腮纲双壳类软体动物，其能在几分钟内用斧状足挖掘沉积物进而将全部躯体钻入栖息，这种掘穴方式会对沉积物表面造成强烈的破坏和扰动[19].它们既滤食上覆水中的浮游生物和有机碎屑，也摄食沉积物中底栖藻类和有机碎屑等[20]. 这种特有的生活习性，会对湖泊沉积物的理化性质产生重要的影响，继而可能会影响氨氧化过程. 由于受到技术手段的限制，目前，国内外尚未有从微生物学角度探讨不同密度河蚬扰动对沉积物中氨氧化菌影响的研究报道，因而亟待研究探索.
基于以上研究现状，本研究通过构建湖泊沉积物-水微宇宙实验系统，运用克隆建库、 实时荧光定量PCR等分子生物学方法，模拟分析了不同密度河蚬生物扰动对太湖沉积物中氨氧化微生物群落结构和多样性的影响.
1 材料与方法 1.1 野外采样与室内培养体系构建
在太湖富营养化较重且河蚬生物量较大的西岸大浦口湖区(31°18′12.10″N，119°56′17.77″E)用彼得森采泥器采集沉积物[21]，收集河蚬. 水和沉积物样品在采集后立刻运回实验室，河蚬放在包含沉积物与湖水的水槽内暂养. 用250 μm筛网去除较大颗粒物. 湖水经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤、 备用.
将过筛后混匀的沉积物移入聚乙烯玻璃柱中(沉积物深度12 cm)，且沉积物部分用锡箔纸包住，利用输液器向每根玻璃柱引入10 cm深的湖水. 将构建好的体系放在室温下稳定一周. 按照上述方法构建得到12个湖泊微宇宙模拟体系，分以下4种不同方式处理: ①对照组(无河蚬)； ②低密度河蚬组； ③中密度河蚬组； ④高密度河蚬组，每组处理设3个平行样(表 1). 选取壳长、 壳宽、 壳高及体重相当且活性较强的河蚬放在已稳定的体系中，于25℃培养箱中培养，待所有的河蚬钻入沉积物后，设定光暗比为12 h ∶12 h，每隔2 d测定理化指标：溶解氧(dissolved oxygen，DO)、 氧化还原电位(oxidation-reduction potential，ORP)和pH.
 | 表 1 不同处理组所投加河蚬的生物量Table 1 Biomass of the C. fluminea added in different treatments |
1.2 样品采集
实验持续60 d，分别在实验开始的第10、 20、 40、 60 d采集沉积物样品. 每次采样前取出原管中河蚬总量的约四分之一. 用内径为1 cm的PVC管采集表层0~1 cm的沉积物，每次采样每个微宇宙体系取3根管子，并将同一处理组的3个平行样沉积物混合在一起，进行后续分析.
1.3 化学分析
沉积物样品分析前用真空冷冻干燥机(ALPHA1-2； 德国CHRIST)冻干. 沉积物中总氮与总磷用碱性过硫酸钾进行消解，NH+4-N、 NO-3-N、 NO-2-N 采用2 mol ·L-1 KCl进行提取. 消解和提取液样品用流动注射仪(San++，SKALAR，Netherlands)进行测定. 理化指标的组间差异用SPSS 17.0软件进行比较.
1.4 构建克隆文库 1.4.1 样品总DNA的提取
取0.25 g冻干后的沉积物样品，利用DNA提取试剂盒(Power Soil DNA Isolation Kit，Mobio，USA)提取样品总DNA. 采用DNA纯化试剂盒PowerCleanTM DNA Clean-Up Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA,USA)对所提DNA进行纯化. 采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA样品，保存于-20℃冰箱中.
1.4.2 AOA和AOB的amoA基因片段的PCR 扩增
分别应用AOA和AOB的amoA基因片段特异性引物[22, 23]，对之前所提的总DNA进行PCR扩增(表 2).
| 表 2 AOA与AOB的扩增引物序列Table 2 Primer sequences of archaeal and bacterial amoA genes |
扩增AOA的PCR反应体系为25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，正反向引物各 0.5 μL，Taq酶 0.4 μL，DNA 模板1 μL，用 ddH2O补足至25 μL. AOA的PCR 扩增程序：95℃,5 min； 10×(94℃,30 s； 58℃,30 s； 72℃,60s)； 30×(92℃,30 s； 57℃,30 s； 72℃,60 s)； 72℃,10 min. AOB的PCR反应体系为25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，正反向引物各1 μL，Taq酶 0.4 μL，DNA模板1 μL，用 ddH2O补足至25 μL. AOB的PCR 扩增程序: 94℃，5 min； 94℃，30 s； 52℃，30 s； 72℃，1 min，32个循环； 72℃最终延伸7 min.
氨氧化菌(AOA和AOB)amoA基因PCR产物均用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Gold view(0.5 μg ·mL-1)染色后，在凝胶成像仪拍照.
1.4.3 克隆文库构建和测序
对获得的PCR产物进行TA克隆. PCR扩增产物用Promega Agarose Gel DNA(Promega，Madison，WI)纯化试剂盒进行切胶纯化，回收的PCR产物与pGEM-Teasy载体(Promega，Madison，WI)连接，转入Takara感受态细胞(DH5α)，最后进行蓝白斑筛选. 对选取的白色克隆子进行PCR扩增，以鉴定阳性克隆，所用引物为载体通用引物T7、 SP6.挑选阳性克隆送上海美吉生物公司测序. 应用DNASTAR软件对测序结果进行编辑，去除载体序列后用BLAST在GenBank数据库中搜索相似序列，并用ClustalX软件与数据库中的相关的amoA功能基因序列进行多重序列比对，使用MEGA(molecular evolutionary genetics analysis) 4.1软件以邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树.
本研究中获得的古菌和细菌amoA基因已上传到GenBank数据库，古菌amoA基因序列：登录号KF767121-KF767238.细菌amoA基因序列：登录号KC549811-KC549909； KF767239- KF767273.
1.5 实时荧光定量 PCR 技术 1.5.1 质粒DNA提取
分别克隆古菌和细菌的amoA基因，挑取单菌落培养，取单克隆菌液采用Axygen质粒小量制备试剂盒提取质粒. 在Eppendorf核酸蛋白测定仪(BioPhotometer plus)上测定质粒DNA浓度，通过10倍稀释法分别将质粒DNA稀释成一系列的浓度梯度，用于进行定量PCR时标准曲线的建立.
1.5.2 实时荧光定量PCR
采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法分别对AOA和AOB的amoA基因进行定量分析，其定量均采用SYBR Green法. 实验中设置阴性对照，每个样品做3个平行，同时以梯度稀释的质粒DNA和样品DNA进行定量PCR反应. AOA、 AOB定量所用引物参见上述普通PCR扩增. 扩增体系均为20 μL：SYBR Green Premix (Takara，大连) 10 μL，浓度为10 pmol的AOA和AOB正反向引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O补足至20 μL. 采用IQ5 Thermocycler扩增仪(RG65HD，Corbett，Australia)进行定量PCR. AOA和AOB定量PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min； (95℃变性30 s，53℃退火60 s，72℃延伸20 s)共40个循环； 最终在72℃延伸10 min. 要求amoA基因的扩增效率为0.95~1.05； 可决系数R2大于0.98，溶解曲线为单一峰.
2 结果与讨论 2.1 不同处理组沉积物样品的理化指标
从图 1中的数据可以看出，河蚬处理组沉积物的总氮低于对照组，这表明河蚬的生物扰动作用对表层沉积物中氮素的释放有明显的促进作用. 3个处理组的亚硝态氮浓度比对照组低，河蚬的扰动行为明显地促进了亚硝态氮向上覆水的释放. 低密度的河蚬扰动能明显增加氨氮和硝氮向上覆水方向的释放. 这些结果表明适量的河蚬生物扰动有利于促进沉积物-水界面无机氮交换. 陈振楼等[19]通过探讨双壳类底栖动物河蚬对长江口潮滩沉积物-水界面无机氮交换的影响，发现界面附近河蚬的扰动和喷灌活动改变了沉积物中无机氮的垂直剖面特征. Mermillod-Blondin等[24]探讨鸟蛤(Cerastoderma edule)、 日本旋卷蜾赢蜚(Corophium volutator)、 沙蚕(Nereis diversicolor) 这3种底栖动物扰动对海洋的水-沉积物界面的物理、 化学和生物性质的影响，认为日本旋卷蜾赢蜚和沙蚕这两个物种通过制造洞穴，改变沉积物的物理结构，增加了氧气的消耗、 铵的释放. 河蚬扰动行为影响无机氮在沉积物-水界面的迁移究竟与溶氧量、 沉积物孔隙率和含水率、 底物氨的可利用性等哪些因素有关尚待进一步研究.
 | 柱状图上的不同字母代表不同组之间存在显著性差异，P<0.05图 1 不同处理组沉积物中营养盐浓度Fig. 1 Nutrient concentrations in the sediments of different treatments |
2.2 氨氧化菌(AOA和AOB)的多样性
利用 DOTUR软件对沉积物中AOA和AOB的多样性进行分析，将相似性为95%以上的序列分为一个OTU. 为了进行多样性比较，本研究统计了克隆文库的Shannon指数(H)和SChao1这2个系数(表 3、表 4).
| 表 3 氨氧化古菌amoA的多样性分析Table 3 Diversity of archaeal amoA sequences |
| 表 4 氨氧化细菌amoA基因的多样性分析Table 4 Diversity of bacterial amoA gene sequences |
通过对氨氧化古菌amoA基因克隆建库分析可见(表 3)，处理组的OTU数目、 多样性指数Shannon-Wiener(H)和SChao1数值都低于对照组，表明处理组的氨氧化古菌群落结构、 多样性比对照组单一，集中在少数几个类群. 同时，中密度处理组氨氧化古菌群落结构、 多样性比其他两个处理组要单一，表明适量的河蚬扰动能给某些氨氧化古菌类群提供很好的生态位.
通过对氨氧化细菌amoA基因克隆建库分析(表 4)，处理组的OTU数目、 多样性指数Shannon-Wiener(H)和SChao1数值都低于对照组，这与氨氧化古菌结果类似，表明处理组的氨氧化细菌群落结构、 多样性比对照组单一，低密度处理组的河蚬扰动可能为某些氨氧化细菌类群提供适合的生态位. 上述结果说明，河蚬的添加会使得微宇宙体系中氨氧化菌(AOB和AOA)的多样性降低.
2.3 荧光定量PCR分析
采用实时荧光定量PCR技术，对3个处理组的表层沉积物样品进行AOA和AOB的定量PCR分析，结果见图 2.从中可知，3个处理组表层沉积物中AOB amoA基因的丰度均高于AOA，这与已有的研究结果一致. 如Caffrey等[25]在Weeks海湾河口、 对照组、 处理组：括号内数字为属同一OTU的序列数Jiang等[26] 在中国青海湖沉积物中发现多数样品中AOB的amoA基因拷贝数略高于AOA的amoA基因拷贝数. 但是，也有相反的研究报道：在土壤[27]、 海洋[28]和淡水湖等环境中普遍发现AOA的amoA拷贝数比AOB的要高得多. Martens-Habbena等[29]研究泉古菌 Nitrosopumilus maritimus SCM1的氨氧化动力学，发现AOA在与其它微生物竞争底物时占有绝对的优势， 图 2显示河蚬密度越高则氨氧化细菌的amoA基因丰度越低，氨氧化古菌的基因丰度在中密度最高，推测河蚬的扰动行为可能改变了表层沉积物的氨氮浓度，AOA更适应中密度的河蚬扰动环境. 上述结果表明，河蚬的扰动行为对氨氧化菌amoA基因丰度产生了一定影响.
 | 图 2 不同处理组的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)amoA基因丰度 Fig. 2 Abundance of bacterial and archaeal amoA genes in the sediments of different treatments |
2.4 系统进化树分析
图 3和图 4为分别将沉积物中氨氧化细菌和氨氧 化古菌的amoA基因序列的OTU代表序列与GenBank中的相关序列进行系统发育树分析.
 | 图 3 不同处理组中细菌amoA基因序列的系统发育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of bacterial amoA gene sequences of different sediments |
 | 对照组、 处理组：括号内数字为属同一OTU的序列数图 4 不同处理组中古菌amoA基因序列的系统发育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of archaeal amoA gene sequences of different treatments |
低密度处理组的氨氧化古菌的amoA基因序列与之前报道的从西雅图海洋水族馆中成功分离的海洋氨氧化古菌菌株Nitrosopumilus maritimus SCM1的相似性较高[30]. 中密度处理组的氨氧化古菌amoA基因序列均属于Nitrosotalea类群. 高密度处理组的氨氧化古菌的amoA基因序列分属于Nitrosopumilus和Nitrosotalea两个类群.
通过相对丰度分析比较(图 5)，对照组和低密度处理组包含了Nitrosopumilus、 Nitrosotalea和Nitrososphaera 这3个氨氧化古菌类群，Nitrosopumilus类群在对照组占比例很高，随着河蚬扰动剧烈程度的提高，其所占比例越来越小，直至高密度河蚬扰动其相对丰度又出现增加，而中密度处理组只有Nitrosotalea一个类群，表明适量的河蚬扰动适合Nitrosotalea种群，这符合Erguder等[31]提出的观点，即部分类型的AOA可能专一性地存在于比较特殊的生境中. 氨氮浓度、 pH和温度的变化都会影响生态系统中AOA的群落结构. 稻田土壤中氮肥的施用也会显著促进AOA的生长[5]. 培养温度(10~30℃)变化对AOA群落结构有明显影响[23]. 推测河蚬生物扰动行为可能通过影响氮素的分布，进而影响AOA群落结构.
 | 图 5 不同处理组的氨氧化古菌类群相对丰度Fig. 5 Relative abundance of the archaeal amoA gene groups recovered from different sediment samples |
AOB是一类化能自养的微生物，广泛分布于土壤、 海洋、 江河、 湖泊及其沉积物等环境中，主要有以下5个属：亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、 亚硝化囊杆菌属 (Nitrosocystis)、 亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、 亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化胶团菌属 (Nitrosogloea). 从系统发育上来看(图 3)，对照组序列分为两大类群：亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira). 通过不同类群相对丰度分析(图 6)，3个不同密度的河蚬扰动体系中，氨氧化细菌(AOB)均为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas). Satoh等[17]研究疣吻沙蚕(Tylorrhynchus heterochaetus)的生物扰动对潮间带沉积物的氨氧化细菌群落结构的影响，结果显示表层沉积物的氨氧化细菌群落主要是Nitrosomonas sp. Strain Nm143-like sequences，同时有不少研究报道过亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)通常在富含氨氮环境中具有竞争优势[32]. 亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)在太湖体系里数量分布的绝对优势性，进一步反映了太湖水体中氨氮污染程度较高的现状. Verhamme等[33]研究氨浓度对氨氧化菌的生长影响，发现氨氧化细菌只在最高氨浓度(200 μg)生长显著. 推测河蚬扰动行为影响表层沉积物中氨氮浓度，进而影响氨氧化细菌群落结构.
 | 图 6 不同处理组的氨氧化细菌群落相对丰度Fig. 6 Relative abundance of the bacterial amoA gene groups recovered from different sediments |
3 结论
(1)河蚬的生物扰动行为增加了沉积物-水之间的氮素交换，适中的河蚬生物量会促进硝化过程.
(2)3个处理组表层沉积物中细菌amoA基因丰度均高于古菌，且河蚬密度越高则氨氧化细菌的amoA基因丰度越低. 河蚬的扰动行为对氨氧化菌amoA基因丰度产生了一定影响.
(3)amoA基因的系统发育分析表明，河蚬的添加使得微宇宙体系中氨氧化菌(AOA和AOB)的多样性降低. 河蚬扰动体系中，AOA为海洋或土壤生态系统中的常见类群，AOB均为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)类群. 总之，河蚬的生物扰动会影响氨氧化菌群落结构和丰度，进而会影响氨氧化进程.
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