2014, Vol.35 
大规模金属矿藏的开采，产生了大量硫化金属尾矿如黄铁矿、砷黄铁矿等. 这些尾矿给环境带来了很大威胁，如长期暴露于空气中，则会与微生物和水发生风化、 溶浸、 氧化和水解一系列反应形成酸性矿山废水(acid mine drainage,AMD)[1]. 酸性矿山废水pH非常低且含有大量金属离子，如铁、 铜、 锌、 锰等，对周围水体、 土壤环境带来了十分严重的危害[2,3]. 在黄铁矿等硫化矿物的氧化过程中，Leptospirillum ferrooxidans、 Acidithiobacillus ferrooxidans和Ferroplasma spp.等嗜酸微生物发挥着重要的催化作用[4]. 有嗜酸微生物参与时，黄铁矿的氧化速率明显高于化学氧化对黄铁矿的氧化作用，在适宜条件下它们可使整个反应的速度提高106倍[5].
低pH和高金属含量不仅影响周围地区的生态系统，而且影响元素的生物地球化学循环. 氮循环是元素地球化学循环中非常重要的一部分. 氮循环主要由固氮、 氨化、 硝化、 反硝化等过程组成，均由微生物驱动. 氨氧化过程不仅是硝化作用的限速步骤，更是整个氮元素循环的中心环节[6,7]. 在很长一段时间里，氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)被认为是唯一可以催化氨氧化的微生物[8]，其存在直接影响硝化作用强度以及硝化速率[9]. 但近几年的研究却发现，氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)广泛地分布在海洋、 土壤、 沉积物、 淡水以及污水处理厂等诸多环境中[10]，而且在大多数土壤中AOA是主要的氨氧化承担者[11]. 已有研究表明，在pH 3.7~6.0的酸性红壤中，氨氧化古菌(AOA)的氨单加氧酶α亚基基因(amoA)拷贝数多于细菌amoA[11]，表明氨氧化古菌可能发挥着更重要的作用. 但关于pH小于3的极端酸性环境中氨氧化类群的研究，目前还鲜见报道.
本研究取样点位于安徽省某酸性矿山废水区域，采集有短小植被覆盖区域的根际土壤，采用分子生物学技术分析其细菌和古菌的组成结构并探讨承担氨氧化功能的微生物类群. 研究结果不但有助于人们增加对矿区土壤微生物组成的了解，而且扩展了人们对极端酸性土壤中氮循环机制的认识，有利于对污染土壤的生物治理和生态恢复.
1 材料与方法 1.1 样品采集及分析
样品于2012年8月采集于安徽某铁矿酸性矿山废水库边有短小植被覆盖区域. 采集根际土壤样品后，装于无菌封口袋中，4℃保存运输至实验室并尽快进行实验操作. 取100 g土壤研磨过1 mm筛，以去除植物根系； 将50 g过筛的土壤50℃烘干24 h，计算含水率. 用KCl溶液作为介质测定样品pH. 总有机碳(total organic carbon,TOC)含量由总有机碳测定分析仪Multi N/C 2100测定. 氨氮和硝氮含量采用氯化钾溶液提取-分光光度法测定[12]. 使用M3浸提剂[13]制备浸提液，用于有效磷和有效金属的测定. 使用经离心后的浸提液，采用钼锑抗分光光度法测定有效磷含量[14]. 有效金属含量采用ICP(iCAP 6000,Thermo)测定，具体测定方法见文献[15]. 土壤中微生物丰度(Microbial abundance)采用吖啶橙染色直接计数法(acridine orange direct counting,AODC)测定，具体方法见文献[16].
1.2 土壤基因组DNA的提取取0.5 g土壤样品，用基因组DNA提取试剂盒直接提取样品中的总DNA(参照MoBio试剂盒生产商建议步骤). 提取出来的基因组总DNA经Nanodrop测定DNA浓度后置于-20℃保存.
1.3 细菌16S rRNA基因的扩增利用细菌通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[17]，以土壤基因组DNA为模板，扩增样品中细菌的16S rDNA基因片段. PCR反应条件设置为预变性95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火53℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，35个循环后，72℃延伸7 min. 所有PCR产物都在-20℃保存.
1.4 古菌16S rRNA基因的扩增以土壤基因组DNA为模板，利用古菌通用引物109F(ACK GCT CAG TAA CAC GT)和934R(GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT)[18]扩增样品中古细菌的16S rRNA基因片段. PCR反应条件设置为预变性95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火48℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，35个循环后，72℃延伸5 min.
1.5 氨单加氧酶基因(amoA)的扩增amoA是氨氧化功能酶——氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)α亚基的编码基因. 以土壤基因组DNA模板，分别利用氨氧化细菌amoA引物amoA-1F(GGG GHT TYT ACT GGT GGT)和amoA-2R(CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC)[19]、 amoA-3F(GGT GAG TGG GYT AAC MG)和amoA-4R(GCT AGC CAC TTT CTG G)[20]，氨氧化古菌amoA引物AF(STA ATG GTC TGG CTT AGA)和AR(GCG GCC ATC CAT CTG TAT GT)[21]扩增样品中氨氧化细菌和氨氧化古菌的氨单加氧酶基因片段. 氨氧化细菌PCR反应条件设置为95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火48℃ 45 s，延伸72℃ 2 min，35个循环后，72℃延伸10 min. 氨氧化古菌PCR反应条件设置为95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火48℃ 60 s，延伸72℃ 2 min，35个循环后，72℃延伸10 min.
1.6 克隆文库的构建分别构建土壤样品中细菌和古细菌的16S rDNA克隆文库以及氨氧化古菌的amoA克隆文库. 氨氧化细菌amoA基因经反复扩增，均未得到PCR产物，故未构建该文库. 克隆文库构建方法为：将PCR产物连接到Promega公司的pGEM-T克隆载体上，按照生产商的说明将质粒转化于E. coli DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp/X-gal/IPTG的LB平板，于37℃静置培养17 h，之后在4℃静置2 h显色，随机挑取白色菌落，重新培养. 利用载体特异性引物对M13-M4(GTT TTC CCA GTC ACG AC)和M13-RV(CAG GAA ACA GCT ATG AC)进行PCR扩增验证插入片段大小以筛选阳性克隆. 细菌、 古菌和氨氧化古菌克隆文库分别挑取105、 38和43个阳性克隆送交上海生工进行测序.
1.7 序列测定以及系统发育分析利用Bellerophon程序检测并去除嵌合体[22]. 然后用Dotur软件对所得序列进行分类，计算香农指数(Shannon)和辛普森指数(Simpson)并制作饱和曲线. 最后选取代表克隆运用Blast程序与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中进行相似性搜索并下载相似性最高的序列和相似性较高的已知种属的序列. 将所有序列用BioEdit中的ClustalW程序进行比对，并用MEGA 4.0软件构建系统发育树.
1.8 序列登录号将本研究中所得序列提交至GenBank中，细菌16S rDNA的序列登录号为KF863913-KF863952，KF924200-KF924205； 古菌16S rDNA的序列登录号为KF918278-KF918306； 氨氧化古菌amoA的序列登录号为KF916687-KF916696.
2 结果与分析 2.1 AODC结果与理化分析
所采集土壤样品的部分物理化学参数见表 1. 样品酸性很强，pHKCl仅为2.83. 总有机碳含量为0.675%，低于农田和森林土壤TOC平均含量[23,24]； 含水率为9.5%； 土壤微生物丰度为3.1×108 个 ·g-1； NH+4-N和NO-3-N含量分别为7.6 mg ·kg-1、 3.1 mg ·kg-1. 经测得样品中有效金属含量很高，其中Al含量最高达1 380.3 mg ·kg-1，Fe含量高达57.0 mg ·kg-1. SO2-4含量高达2 168.0 mg ·kg-1.
 | 表 1 土壤样品的部分化学参数 Table 1 Chemical parameters of the soil sample |
经测序细菌文库共获得103条序列，去除载体和嵌合体后有效序列为95条； 古细菌与氨氧化古 菌文库分别得到28条和39条有效序列. 3个文库的饱和曲线如图 1所示，3个文库饱和曲线均趋于平缓，可以比较完整地反映样品中细菌、 古菌和氨氧化古菌群落结构. 从香农指数(Shannon)和辛普森指数(Simpson)可以看出该样品中细菌的多样性高于古菌(表 2).
 | 图1 细菌、 古菌和氨氧化古菌饱和度曲线 Fig. 1 Saturation curves of bacteria,achaea and AOA OTU |
| 表 2 细菌、 古菌以及氨氧化古菌克隆文库多样性指数 Table 2 Diversity indices of the bacteria and archaea and AOA clone libraries of the soil sample |
将每种基因型的序列输入RDP网站，得到该基因型所属的系统发育类群. 结果显示，细菌文库中包含了11个类群(如图 2)，其中所占比例最大的3个类群分别为Acidobacteria(47.4%)、 Verrucomicrobia(18.9%)、 Chloroflexi(10.5%).
 | 图 2 细菌文库中各类群所占比例
Fig. 2 Proportion of each phylotype in the clone library
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经NCBI数据库中Blast程序比对分析后，选取主要克隆进行比对，发现与该矿区土壤样品中细菌亲缘关系较近的克隆均来自于一些酸性环境中，如某些矿区酸性土壤、 酸性湿地底泥、 酸性红壤和酸性矿山废水等，或者植被根际等.
本研究中酸杆菌门是所占比例最高的门类，在文库中丰度达47.4%. 酸杆菌门细菌在环境中分布广泛，尤其在土壤和沉积物中所占比例较高——在细菌16S rRNA基因文库中的丰度可达10%~50%[25, 26, 27, 28, 29, 30]. 该样品中酸杆菌门细菌多属于Gp1类群(如图 3). 酸杆菌门的一些成员对于极端环境如金属污染和酸性环境具有耐受性[26].Lee等[29]在研究韩国某地栗子树根际土壤时，分别应用PCR以及反转录PCR(reverse transcription PCR)研究土壤样品中微生物多样性，在rRNA基因文库以及由rRNA反转录得到的cDNA文库中，酸杆菌门所占比例都大于50%，表明酸杆菌门细菌在该土壤样品中数量最多而且新陈代谢活性最高.
 | 图 3 基于16S rDNA序列的Acidobacteria细菌系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of Acidobacteria in the soil based on 16S rDNA sequences
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克隆Bac-XC-105(2.0%)、 Bac-XC-109(5.1%)、 Bac-XC-19(1.0%)和Bac-XC-25(1.0%)均与Candidatus Koribacter versatilis 的亲缘关系较近. Ward等[31]比较了包括Candidatus Koribacter versatilis在内的酸杆菌门中3个种的全基因组，发现Candidatus Koribacter versatilis具备硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，且适宜在pH 4.0~6.5的环境中生存.
克隆Bac-XC-27(4.0%)、 Bac-XC-86(1.0%)和Bac-XC-99(1.0%)与菌株Acidobacteria sp. isolate N3B的16S rDNA序列相似性均为97%，该菌株分离自法国加尔省一流经古代矿区的酸性溪流中[32]. Acidobacteria属菌株多为分离自酸性环境的化能异养菌，革兰氏染色呈阴性，好氧； 可在pH 3.0~6.0、 温度为20~37℃的环境中生存[33].
克隆Bac-XC-14和Bac-XC-4(丰度分别为4.0%和3.0%)与Holophaga sp.的16S rDNA序列同源性较高. Holophaga属细菌在一些酸性矿坑水中曾检测到，如江西德兴市银山铅锌矿的露天矿坑储水池和地下300多m隧道中自然氧化形成的酸性矿坑水[34]. Holophaga属细菌多为革兰氏阴性严格厌氧菌，可在温度为10~35℃环境中生存，最适温度为28~32℃，最适pH为6.8~7.5[35].
克隆Bac-XC-41(5.1%)和Bac-XC-80(2.0%)在系统发育树上与Acidopila rosea聚为一类(图 3). Okamura等[36]分别在日本的一个AMD处理厂(水样pH 2.7)和一个茶叶种植园土壤(pH 4.5)中分离到两株Acidipila rosea. Acidipila rosea为革兰氏阴性好氧菌，细胞呈球形或球杆形，营养类型为化能有机营养型； 可以在pH 3.0~6.0范围内生存，最适pH为4.5； pH 7.0时不能生存.
如图 4所示，放线菌门包括3种基因型(占文库的4.0%)都与Aciditerrimonas ferrireducens在系统发育树上聚为一簇. Aciditerrimonas ferrireducens是一种中度嗜热的嗜酸菌，具有还原铁的能力； 革兰氏染色呈阳性，可以在pH 2.0~4.5，温度35~58℃的环境中生存，最适pH为3.0，最适生长温度为50℃. 有氧条件下营养类型为化能异养，无氧环境中为化能自养，利用三价铁氧化氢获得能量[37].
 | 图 4 基于16S rDNA序列的其它门细菌系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree of other bacteria in the soil based on 16S rDNA sequences
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α-变形菌门在本文库中所占比例仅为6.0%. 其中克隆Bac-XC-102(3.0%)与红游动菌属(Rhodoplanes sp.)Z2-YC6860在系统发育树上聚为一簇. 红游动菌属细菌为一类紫色非硫细菌； 细胞革兰氏染色呈阴性，兼性厌氧光能营养型细菌，细胞含有类胡萝卜素和菌绿素； 该类细菌在黑暗厌氧条件下可以完成反硝化过程进行脱氮[38].
2.3.2 古菌多样性以及系统发育分析经过RDP网站的比对分析，本研究的土壤样品中古菌属于两个类群，即广古菌门(Euryarchaeota)和奇古菌门(Thaumarchaeota). 测试的29个克隆分属于14个操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)，其中10个OTUs(22个克隆)属于奇古菌门，4个OTUs(7个克隆)属于广古菌门. 与细菌相比，古菌多样性明显较低. 通过系统发育分析发现该土壤样品中古菌与氨氧化作用密切相关.
奇古菌门是2008年从中温环境来源的古菌(温泉古菌)划分出来的一个新类群[39]. 古菌文库中归类于奇古菌门的古细菌均与氨氧化作用相关. 奇古菌门的氨氧化古菌分布广泛，在沉积物、 土壤、 淡水以及海洋环境中其amoA含量显著高于氨氧化细菌[40]. 一些研究运用抑制剂抑制硝化作用结合使用稳定性同位素探测技术(stable isotope probing,SIP)等证明了氨氧化古菌在一些自然环境尤其是寡营养环境的硝化作用中起重要作用[13, 39, 40].
奇古菌门中比例最高也是文库中丰度最大的基因型为Arch-XC-25，所占比例为27.6%. 在GenBank数据库的比对结果中，与该克隆亲缘关系较近的均为未培养菌株(如图 5)，多数检测自土壤和沉积物中； 其中相似度为99%的一个序列分离自美国橡树岭Melton河支流流域沿岸pH为4.5的土壤样品. 克隆Arc-XC-13在文库中丰度为13.8%，与该克隆亲缘关系最近的克隆来自金属矿区(如铀尾矿)和酸性泉水. 基因型Arc-XC-11和Arc-XC-27各包含两个克隆(丰度为6.9%)，其余基因型均为单克隆. 与这些基因型相似的序列多分离自酸性红壤、 酸性矿山废水、 酸性温泉以及植物根际土壤等. 在GenBank数据库中与本研究中所有古菌基因型相似度在93%以上的都为未得到纯培养的古菌的16S rDNA序列. 而去除未培养古菌的序列后，本研究中所有古菌的序列类型都与Nitrososphaera(亚硝化球菌属)亲缘关系最近，相似度为81%~87%. Nitrososphaera 属的Nitrososphaera viennensis EN76(维也纳亚硝化球菌)是第一株分离自土壤环境的氨氧化古菌[41]； Nitrososphaera gargensis(加尔加亚硝化球菌)分离自俄罗斯加尔加地区的一个温泉，具有氧化氨的能力，但是氨浓度超过3 mmol ·L-1会抑制其生长[42]. 分离自英格兰酸性土壤(pH 4.5)的Nitrosotalea devanaterra(阿伯丁土壤亚硝化细杆菌)是1株嗜酸氨氧化古菌，pH 4~5时均生长良好，当pH>5.5时生长会受到抑制； 最适生长温度为25℃[43]. 已有研究表明，在酸性土壤中，AOA与硝化潜势存在明显正相关关系，主导氨氧化过程的发生[43]. 本研究土壤也具有类似特点，氨氧化过程可能主要由氨氧化古菌驱动.
 | 图 5 基于16S rDNA序列的古菌系统发育树 Fig. 5 Phylogenetic tree of achaea in the soil based on 16S rDNA sequences |
本研究的文库中广古菌门包括3种基因型，其中基因型Arc-XC-22丰度最大，为13.8%. 这3种基因型的最相似序列均分离自哥伦比亚安第斯山脉的一个酸性温泉[44]和日本箱根大涌谷的一个酸性温泉[45]. 克隆Arc-XC-3与数据库中序列相似度低于80%，可能是广古菌门的新种. 广古菌门的所有基因型与在GenBank中最相似的菌种均为产甲烷古菌(Methanogenic archaea)，相似度均为82%~84%. 产甲烷古菌是一类严格厌氧的仅利用二氧化碳和氢气、 甲酸盐、 甲醇、 甲胺、 和/或乙酸盐进行能量代谢并产生甲烷的古菌. 这类微生物在全球碳循环中发挥重要作用[46].
2.3.3 氨氧化古菌多样性以及系统发育分析该土壤样品未扩增到氨氧化细菌的amoA基因片段，说明样品中不存在氨氧化细菌或氨氧化细菌含量很低.
由古菌文库组成可知本样品中大多数古菌与氨氧化功能相关，故利用古菌特异性氨单加氧酶引物对AF和AR扩增氨单加氧酶基因序列，共得到39条有效基因序列. 经与GenBank数据库中已有序列比对，发现该土壤样品中多数氨氧化古菌的最相似序列来自酸性红壤、 酸性土壤和酸性矿山等与本样品所取条件相似的环境中，其中多数与已知菌种的相似性都低于90%，基因型AOA-XC-17和AOA-XC-19与Nitrosotalea devanaterra(阿伯丁土壤亚硝化细杆菌)的相似性都为94%. 从氨氧化古菌的系统发育树(图 6)可看出，Cluster 3中的基因型AOA-XC-1(文库中丰度为5.1%)，AOA-XC-10(12.8%)，AOA-XC-13(10.3%)，AOA-XC-28(2.6%)，AOA-XC-33(2.6%)与数据库中的氨氧化古菌序列相似性都较低，与已得到纯培养的氨氧化古菌(全部位于Cluster 2中)亲缘关系较远，证明该土壤样品中存在AOA新类群.
 | 图 6 基于amoA序列的氨氧化古菌(AOA)系统发育树
Fig. 6 Phylogenetic tree of AOA in the soil based on amoA sequences
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在前期研究中，笔者利用分子生物学的方法着重研究了取样地的酸性矿山废水库的微生物群落结构和该区域内废矿石中真核生物的多样性[17,47]. 取样区域AMD的pH在3以下[17]，周围区域废矿石的pH也低于3[47]. 本研究中的土壤样品受到酸性矿山废水的严重污染. 该样品克隆文库中细菌、 古菌序列在数据库中的最相似序列多分离自酸性土壤、 酸性沼泽、 酸性红壤以及酸性矿山等理化条件相似的环境中. 细菌文库中最大的门类为酸杆菌门，在该门类中存在耐酸耐重金属的类群. 此外，文库中存在与反硝化作用相关的菌种，如Candidatus Koribacter versatilis、 红游动菌属(Rhodoplanes sp.)，也存在与铁还原相关的菌种，如Aciditerrimonas ferrireducens，但未发现与氨氧化作用相关的菌种，说明该样品中不存在或存在较少的氨氧化细菌. 而在古菌文库中却发现，大部分古菌是与氨氧化作用相关的奇古菌门的成员，且与已得到纯培养的菌种亲缘关系较远. Nitrosotalea devanaterra是奇古菌门中唯一一种嗜酸的氨氧化古菌，但是该细菌与本研究中所有AOA序列的相似性都极低. 经建立古菌amoA克隆文库，同样证实该土壤样品中存在氨氧化古菌，所以取样区域内氨氧化过程主要由氨氧化古菌主导. 文库中所得到的amoA序列与已得到纯培养的氨氧化古菌的amoA序列相似性均低于85%，而且其中5种基因型与数据库中已有研究的类群亲缘关系较远，在系统发育树上组成一个独立分枝，由此推断该土壤中可能存在未知的氨氧化古菌类群. 矿区土壤由于其较低的pH和高重金属含量使其具有特殊性，其中所含微生物对低pH和重金属耐受性高，为今后矿区土壤以及理化性质相似的污染土壤的原位生物修复提供可靠依据.
4 结论
(1) 取样区域土壤受到酸性矿山废水的严重污染，pH仅为2.83，金属Fe和Al含量都很高. 文库中的序列均与酸性环境中检测到的序列具有较高的同源性，证明该土壤中存在大量耐酸以及嗜酸的微生物.
(2) 细菌文库覆盖11个类群，酸杆菌门丰度近50%，第二大门类为疣微菌门，所占比例为18.9%. 古菌文库多样性低，只存在两大门类，分别为奇古菌门和广古菌门，前者占优势地位.
(3) 细菌文库中未发现与氨氧化作用相关的类群，只存在反硝化细菌参与N元素的生物地球化学循环. 该土壤样品中的氨氧化作用主要由奇古菌门的氨氧化古菌所驱动，且该区域存在氨氧化古菌的新类群.
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