微藻是高效的光合作用水生生物，其细胞主要化学成分是脂类、 蛋白质、 纤维素和木质素等^[1]. 微藻中的脂肪酸多为C14~C18，这些脂肪酸是生物柴油的主要成分^[2,3]. 微藻环境适应能力很强，可在淡水、 海水和多种污水中生长，仅占用少量的土地资源，生产生物柴油的潜力巨大^[4,5]. 能源微藻中的产油小球藻可以进行工业化生产，是理想的能源微藻资源^[6,7]. 因此，本研究利用适合大规模培养、 油脂含量较高、 研究较为成熟的产油小球藻作为试验原料.

微藻的生长需要大量的水、 养料(碳源、 氮源和磷源等)以及光照，这些培养成本导致微藻生物柴油价格是石油价格的2倍多^[8]. 微藻生物柴油要真正成为一种替代能源，降低其培养成本至关重要. 微藻生长所需的光照可利用自然光，碳源可利用空气、 烟道气中的CO₂等，所以大量的水和其他养料来源成了关键. 牛粪发酵后的沼液污水中含有大量的氮磷以及有机碳(可提供微藻生长所需的碳源)等成分，非常适合微藻的生长，使微藻的大规模培养减少了水的消耗，同时解决了部分养料来源问题^[9,10]，大大降低了生物柴油生产成本.

人们往往希望利用高污染的污水进行微藻培养，虽然意义重大，但是由于其组成复杂及污染物浓度过高，导致微藻的适应周期过长甚至抑制了微藻生长，大大降低了产油率，故难以形成持续化的大规模供应. 不同的藻种污水适应能力不同，故对于污染物浓度过高的污水需要进行一定的处理，并且污水中并不一定含有微藻所需生长的全部营养元素，有些营养成分需要另外添加^[11,12]. 因此本研究利用4种产油小球藻，在不同体积比的沼液污水与绿藻培养基形成的混合培养基中，分析了沼液污水培养微藻的可行性，选育最高产油率时产油小球藻和沼液污水培养基组合，在最高产油率的小球藻和沼液污水培养基的基础上，继续考察在沼液污水中添加不同营养成分藻细胞的产油率以及氮磷的去除效率，进一步优化沼液污水培养基，以期为利用沼液污水大规模培养产油小球藻奠定基础.

1 材料与方法 1.1 材料、 试剂

试验所用的小球藻BJ01(Chlorella sp.)、 小球藻BJ05(Chlorella pyrenoidosa)、 小球藻BJ07(Chlorella vulgaris)由本实验室自行筛选获得，为了便于区分，将美国明尼苏达大学阮榕生教授惠赠的小球藻(Chlorella sp.)编号为BJ09. 所用试剂均为分析纯. 1.2 主要仪器、 设备

热电鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂101-IEBS)、 电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司BS223S)、 高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心仪器有限公司GL-21M)、 水质分析仪(默克Pharo 300)、 真空冷冻干燥机(中国农机院研制)、 恒温水浴锅(上海森信水浴锅有限公司DK-S24)、 超静音可调式气泵(广东海利有限公司ACO-9602).

沼液取自中国农业机械化科学研究院农业生态科技园沼液发酵池，加入4倍清水搅拌经自然沉降1周后弃去沉淀，6000 r ·min^-1离心10 min取上清液，上述方式处理获得共50 L的沼液污水备用. 分析上清液的水质指标化学需氧量 (COD)、 总氮 (TN)、 总磷 (TP)、 铵态氮 (NH⁺₄-N)，该沼液污水的pH为6.4，结果见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 处理后得到的沼液污水水质指标 Table 1 Water quality index of biogas slurry after treatment 指标 COD TN TP NH+4-N 含量/mg ·L-1 2590 61.8 38.2 6.8

表 1 处理后得到的沼液污水水质指标 Table 1 Water quality index of biogas slurry after treatment

绿藻培养基中各营养成分是标准BG11培养基^[13]中的2倍，其组成(mg ·L^-1)如下：NaNO₃ 3000； MgSO₄ ·7H₂O 150； CaCl₂ ·2H₂O 72； 柠檬酸，12； Na₂EDTA 2； 柠檬酸铁铵 12； Na₂CO₃ 40； KH₂PO₄ ·H₂O 80； 微量元素 (A5): ZnSO₄ ·7H₂O 0.444； CuSO₄ ·7H₂O 0.158； MnCl₄ ·4H₂O 3.62； Na₂MoO₄ ·2H₂O 78； Co(NO₃)₂ ·6H₂O 0.098； H₃BO₃ 5.72.

以绿藻培养基培养的4种处于对数生长期的小球藻为种子液，接种到如表 2所示的5种试验组培养基中，接种后的干重折合约(0.1±0.01) g ·L^-1，于温度为 (26±1)℃，光强为(5000±500) lx条件下，在培养体积为2 L的三角瓶中，由底部连续通入空气培养(空气流速为60 L ·h^-1)18 d. 每天取20 mL测生物量. 培养结束后离心藻液，干燥测得最终生物量、 含油率、 产油率同时检测培养液中COD(chemical oxygen demand,化学需氧量)、 TN(总氮)、 TP(总磷)、 NH⁺₄-N去除率. 每组设3个平行对照.

表 2(Table 2)

表 2 5种培养基的体积组成 Table 2 Composition of the five kinds of culture medium 项目 培养基编号 1 2 3 4 5 沼液污水比例 0 1/10 1/4 1/2 3/4 绿藻培养基比例 1 9/10 3/4 1/2 1/4

表 2 5种培养基的体积组成 Table 2 Composition of the five kinds of culture medium

在5种培养基筛选得到的培养基基础上，利用营养缺陷试验进一步优化培养基，营养缺陷组的试验安排如表 3所示.

表 3(Table 3)

表 3 培养基营养元素筛选试验 Table 3 Experimental group arrangements for the screening of nutrients in wastewater medium 组成 试验组编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NaNO3 - + + + + + + + + KH2PO4 + - + + + + + + + MgSO4 ·7H2O + + - + + + + + + CaCl2 ·2H2O + + + - + + + + + 柠檬酸 + + + + - + + + + 柠檬酸铁铵 + + + + + - + + + Na2EDTA + + + + + + - + + Na2CO3 + + + + + + + - + A5 + + + + + + + + -

表 3 培养基营养元素筛选试验 Table 3 Experimental group arrangements for the screening of nutrients in wastewater medium

试验期间每天上午10:00取各试验组藻液20 mL于50 mL离心管(提前烘至恒重W1)中6000 r ·min^-1离心10 min，弃上清液，将含有藻体的离心管于105℃烘箱下烘至恒重(W2)，藻细胞生物量DW(g ·L^-1)的计算式如下：

小球藻油脂提取方法如下^{[14, 15, 16]}：准确称取待测藻粉各1.0 g(W4)于研钵中，加入1.0 g石英砂，研磨5 min，转入碘量瓶，加入100 mL乙醚，在超声波功率为500 W下每超声5 s间歇10 s，反复20次后，置于通风橱中提取12 h后用滤纸过滤，并用少量乙醚洗涤三角瓶和滤渣3次过滤至250 mL三角瓶中，60℃水浴锅中蒸发浓缩至干后，将三角瓶置于105℃烘箱中烘至恒重，准确称取油脂质量(W3)，计算含油率u(%)：

产油率m定义为平均每天每升培养基中的藻细胞所产的油脂质量，它综合考虑了单位体积培养基中微藻能达到的生物量和藻体含油率两个因素. 产油率m[mg ·(L ·d)^-1]计算公式为：

利用水质分析仪进行测定.

2 结果与分析 2.1 4种小球藻在不同培养基中的生物量、 含油率和产油率

每天监测各组生物量变化，并收获各试验组第18 d的藻液，测得各试验组的生物量、 含油率和产油率如图 1~3所示. 由图 1可以看出，在4号和5号培养基中，4种小球藻的生物量较在1号、 2号、 3号培养基中显著降低，可见，沼液污水所占比例过高会显著抑制小球藻的生长，特别是在沼液污水占3/4的5号培养基中，4种小球藻的生长量几乎为零； 而在2号和3号培养基中的4种小球藻的生物量与1号培养基中得到的生物量相差不大，所以一定比例范围内的污水浓度对小球藻的生长没有影响，利用沼液污水配制而成的培养基是可行的. 相比较4种小球藻，在不同比例的污水培养基中，小球藻BJ05和BJ01的生物量均显著大于BJ07和BJ09，说明小球藻BJ05和BJ01的适应污水环境能力更强； 除了在1号不含污水的绿藻培养基中，小球藻BJ05的生物量小于小球藻BJ01的生物量，而在2~5号含不同污水比例的培养基中，小球藻BJ05的生物量均略大于小球藻BJ01的生物量.

图 1

Fig. 1

图 1 不同小球藻在 5种培养基中的生物量比较 Fig. 1 Biomass of different chlorella in the 5 kinds of culture medium

图 2

Fig. 2

图 2 不同小球藻在5种培养基中的含油率比较 Fig. 2 Oil content of different chlorella in the 5 kinds of culture medium

图 3

Fig. 3

图 3 不同小球藻在5种培养基中的产油率 Fig. 3 Oil productivity of different chlorella in the 5 kinds of culture medium

图 2可以看出，4种小球藻在5种培养基中的藻细胞含油率在8.3%~16.2%间浮动，在5种培养基中，BJ05的细胞含油率均比其他3种小球藻高，在5号培养基中BJ05的细胞含油率达到最高，为16.2%，其次为3号培养基中的15.6%.

图 3可以看出，在生物量和含油率二者的综合影响下，4种小球藻在5种培养基中的产油率相差较大，BJ05和BJ01由于其生物量和细胞含油率均较BJ07和BJ09高，所以二者的产油率明显较高，而相比较BJ05和BJ01的产油率，由于BJ05的细胞含油率较高，所以BJ05的产油率较高； 除BJ05外，随着培养基中沼液污水所占比例的提高，BJ07、 BJ09和BJ01的产油率呈下降趋势，BJ05在3号培养基中的产油率较在1号、 2号培养基中的产油率略有提高，达到20种试验组合中的最高值，在4号和5号培养基中由于其生物量极低导致其产油量急剧下降. 虽然BJ05在2号和3号培养基中的产油率几乎没有差距，但是，从处理更多的污水角度来讲，3号培养基更具有优势.

沼液污水中含有氮磷等多种营养成分，部分营养成分可能含量较高足以供应小球藻的生长，而有些营养成分可能较低不足以供应小球藻的生长，为了降低培养成本，在利用污水培养小球藻时，只希望添加沼液中不足以供应小球藻生长的营养成分. 因此在3号培养基基础上，缺乏绿藻培养基中不同营养母液或微量营养元素，考察污水培养时哪些营养成分为微藻生长所必需.

如图 4所示，BJ05在分别不添加柠檬酸和碳酸钠的培养基中生长情况良好，测得产油率分别为9.23 mg ·(L ·d)^-1、 9.15 mg ·(L ·d)^-1，而其它试验组生长情况较差，无法正常生长. 说明柠檬酸和碳酸钠并非必须添加，而其他营养元素则必须添加才能满足小球藻的生长. 分析原因可能是碳酸钠为小球藻生长过程提供无机碳源，而通入的空气中含有CO₂能够提供无机碳，柠檬酸提供有机碳源，但污水中的COD较高，说明有机碳含量较高，能够满足小球藻BJ05的碳源需求，而污水中其他营养成分的缺乏则必须经人工添加方可满足小球藻的生长.

图 4

Fig. 4

图 4 沼液添加不同营养元素对 BJ05生长的影响 Fig. 4 Effects of different nutrients added in wastewater on the growth of chlorella BJ05

在3号培养基不添加碳酸钠或柠檬酸试验的基础上，考察同时不添加碳酸钠和柠檬酸对BJ05的生长和产油的影响，结果如图 5所示，BJ05在同时不添加柠檬酸和碳酸钠的3号培养基中生长情况良好，并且测得其生物量和细胞含油率分别为1.08 g ·L^-1，含油率为15.6%，产油率达9.36 mg ·(L ·d)^-1，高于未优化的3号培养基中得到的9.20 mg ·(L ·d)^-1，分析原因可能是碳源过量，柠檬酸和碳酸钠的添加反而抑制了小球藻BJ05产油.

图 5

Fig. 5

图 5 BJ05在不添加柠檬酸和碳酸钠的沼液中生长情况 Fig. 5 Growth of chlorella BJ05 in biogass slurry without addition of citrate acid and Na2CO3

分别比较不添加柠檬酸或碳酸钠、 以及同时不添加柠檬酸和碳酸钠这3种情况下，小球藻BJ05产油率相差不大，说明柠檬酸和碳酸钠非必须添加. 培养结束后，检测3号培养基中COD、 TN、 TP、 NH⁺₄-N的消耗量发现，BJ05在该培养基中的COD、 TN、 TP、 NH⁺₄-N去除率分别达到59%、 75%、 61%、 100%.

3 讨论

本研究基于沼液污水，对不同比例的培养基和不同小球藻藻种进行了选育，选育出小球藻BJ05，但是，对于培养基的选育仍然有需进一步研究的地方，比如，如何保证沼液污水的相对稳定性，还需更多的前处理研究. 另外，研究每种营养成分添加多少能保证小球藻的产油率不受影响或者有更大的提高，从而进一步减小培养小球藻产油的成本，具有更现实的意义.

4 结论

(1) 本研究基于中国农业机械化科学研究院农业生态科技园沼气发酵池中的沼液污水，探讨沼液污水培养小球藻产油的可行性. 结果发现，BJ05能很好地在含1/4沼液污水的培养基中生长，并获得较高的产油率，沼液污水中添加适量的无机氮、 无机磷，镁盐、 钙盐、 柠檬酸铁铵、 络合剂和微量元素，即可较好地用于微藻的培养与油脂生产，但对于沼液污水的稳定性和营养元素的添加的量还有待进一步研究，这样才具有更好的应用前景.

(2)同时，对培养水体中COD、 TN 和TP 残留的检测结果发现，微藻对无机氮与磷均有着高效的吸收机制. 沼液污水用于含油微藻的培养前景广阔，通过部分营养元素的添加，即可获得高产油率的微藻生物质，在产生巨大经济效益的同时，解决了污水处理中无机氮与无机磷难以去除的难点，可以缓解农村发展对环境破坏的压力，对我国农村和能源发展具有重要社会效益.