植物多酚是植物体内的复杂酚类次生代谢物[1],研究发现穗花狐尾藻[2]、 芦苇[3]、 大麦秸秆[4]以及水稻秸秆[5,6]的提取物或浸出液中所含有的植物多酚类物质具有显著的抑制藻类生长的效应,例如对苯二酚[7,8]、 阿魏酸和香豆素[9]等. 很多水华蓝藻能分泌影响人类健康的藻毒素,而研究显示在抑藻类物质作用下藻毒素的产生与释放会发生变化,如铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)在浮萍分泌的化感物质[10]作用下,胞内产生的藻毒素和释放到胞外的藻毒素均高于对照样; 不同浓度对苯二酚、 焦棓酸[11]、 壬基酚[12]作用于铜绿微囊藻时,细胞内毒素和细胞外毒素随投加浓度不同而不同,如0.2 mg ·L-1壬基酚作用时,胞内毒素高于对照样,胞外毒素低于对照样,但在2 mg ·L-1壬基酚作用下,胞内胞外毒素均低于对照样. 因此在使用抑藻类物质抑藻时,藻毒素的产生与释放直接关系到抑藻类物质应用的安全性[13].
上述研究表明化感类物质会对藻毒素的产生与释放产生影响,但是对藻细胞在不同生长抑制状态下藻毒素的产生与释放不是很清楚,即对由不同投加剂量产生的不同抑藻效应中藻毒素的产生与释放规律缺乏研究. 因此,本研究选用了植物多酚中抑制铜绿微囊藻效果比较好的对苯二酚[7],根据其作用于铜绿微囊藻的剂量效应关系,确定了不同的投加剂量,分析了藻细胞在不同生长抑制状态下,藻毒素Microcystin-LR(MCLR)的产生与释放,并通过测定总有机碳TOC和三维荧光光谱研究了此过程中胞内有机物的释放情况.
1 材料与方法 1.1 藻的培养
铜绿微囊藻(FACHB 905)购自于中国科学院水生生物研究所,接种于BG11培养基中,在30℃、 2 000 lx、 14 h/10 h光暗比条件下培养. 待进入对数期后开始实验.
1.2 分析方法 1.2.1 MCLR提取、 分离与测定取15 mL含藻样品,于4 800 r ·min-1、 4℃下离心20 min,藻细胞沉渣用于胞内MCLR的测定,上清液用于胞外MCLR的测定. 藻细胞沉渣经反复冻融3次后,用80%甲醇(Fisher,美国,色谱纯)振荡提取2次,每次5 h,合并振荡提取液,离心去藻渣后,于60℃水浴中去除甲醇,浓缩至0.3 mL,过0.45 μm滤膜,待测. 上清液过0.45 μm滤膜后经固相萃取(SPE)富集分离富集MCLR,洗脱液于60℃水浴中浓缩至0.3 mL,SPE操作和HPLC测定方法参见文献[14]. 高效液相色谱仪 (Waters 2695/2998,美国)的MCLR检测限是4.2 μg ·L-1,色谱柱为Agilent TC-C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm),MCLR标样(10 mg ·L-1)购自于中国科学院水生生物研究所.
1.2.2 中性红染色率测定取500 mg ·L-1中性红溶液3 mL,加入铜绿微囊藻液0.1 mL,混匀,避光染色15 min,于显微镜(BX51TF,日本Olympus公司)观测细胞染色情况并计数,染色率为染色细胞与总细胞数的比值[15].
1.2.3 TOC测定取含藻样品离心后的上清液,过0.45 μm滤膜后,采用总碳分析仪(TOC-V CSN,日本岛津)测定TOC值.
1.2.4 三维荧光光谱测定取含藻样品离心后的上清液,采用Hitachi F-7000 型荧光光谱仪测定溶解性有机物的三维荧光光谱. 激发波长Ex=1 nm,发射波长Em=5 nm; 扫描波长范围:Ex为200~450 nm,Em为250~550 nm. 1.3 实验方法 1.3.1 剂量效应关系
取细胞密度约为3×1010个 ·L-1的藻液10 mL,加入1 000 mg ·L-1对苯二酚水溶液,使其终浓度为1.0、 2.0、 2.5、 3.0、 5.0、 8.0 mg ·L-1,于光照培养箱中培养. 96 h后,取藻液测定中性红染色率,用概率单位法得到剂量效应关系.
1.3.2 MCLR产生与释放向细胞密度约为3×1010个 ·L-1的300 mL藻液中加入1 000 mg ·L-1对苯二酚水溶液,使其终浓度为EC20、 EC50、 EC70、 EC90、 EC99,即使藻细胞死亡20%、 50%、 70%、 90%、 99%所对应的对苯二酚浓度,在第0、 1、 2、 4、 6 d取样,其中取15 mL测胞内、 胞外MCLR,取25 mL测TOC和三维荧光. 实验共进行2组平行. 2 结果与讨论 2.1 剂量效应关系
在用常规计数藻细胞密度的方式确定剂量效应关系时,有可能会把已死却还未溶解的藻细胞作为活细胞,而用中性红染色法时,死细胞会被染成红色,而活细胞仍为绿色,所以本研究采用中性红染色法来判别细胞的活性,所测定的中性红染色率代表了细胞的死亡率[15,16]. 结果显示,对苯二酚抑藻的剂量效应关系为:y=3.98x+3.55,式中x是对苯二酚浓度的对数值,y是死亡率百分比对应的概率值,拟合度R2为0.98. 由该式可以得到EC20、 EC50、 EC70、 EC90和EC99对应的对苯二酚浓度分别为1.42、 2.32、 3.14、 4.86和10 mg ·L-1,该结果即作为以下实验的投加剂量.
2.2 MCLR的产生与释放 2.2.1 胞内MCLR微囊藻毒素是由淡水蓝绿藻产生的一类肝毒素缩氨酸,其中LR型微囊藻毒素(MCLR)最为常见,且已知毒性较强、 急性危害较大,它在细胞内产生,是细胞内毒素[17,18]. 如图 1所示,在对苯二酚EC99和EC90剂量作用下,胞内MCLR相较于对照样先上升后迅速下降,在4 h时达到最大值390.7 μg ·L-1和379.6 μg ·L-1,分别为对照样的1.33倍和1.29倍,可以看出,在高剂量对苯二酚作用下,铜绿微囊藻受到外界强烈刺激,细胞在短时间内产生了过量的藻毒素. 一般认为藻细胞内的能量主要用于自身生长的营养物质合成以及用于抵抗环境的胁迫[13]. 高剂量对苯二酚作为一种环境胁迫,使藻细胞将能量更多地用于藻毒素的合成来抵御外界环境的变化. 不过,在随后的第1 d,胞内MCLR浓度又降至6.23 μg ·L-1和6.11 μg ·L-1,只相当于对照样的1.7%,说明藻细胞死亡后胞内藻毒素释放出去. 在EC70和EC50剂量作用下,胞内MCLR相比于对照样在逐渐下降,第1 d分别降为对照样的82.4%和86.0%,第6 d降至对照样的3.7%和10.1%. 在EC20剂量作用下,胞内MCLR则一直约为对照样的60.1%~70.4%. 可以发现,对苯二酚浓度越高,即外界刺激越大,藻细胞死亡得越快,由此而导致的胞内MCLR也下降得越快,即胞内MCLR越快地被释放出来.
![]() | 图 1 胞内MCLR浓度随时间的变化
Fig. 1 Variation of intracellular MCLR during the cultivation
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藻细胞死亡破裂后MCLR会被释放到水体中,而MCLR易溶于水[19],本研究将释放溶解到水中的MCLR称为胞外MCLR. 如图 2所示,除了EC20,其它剂量作用下的胞外MCLR均是先上升后逐渐下降,EC99在13 h达到最大值879.8 μg ·L-1,约为对照样的79.2倍; EC90在第1 d达最大值831.6 μg ·L-1,约为对照样的66.6倍; EC70和EC50则在第2 d达到最大值,分别为对照样的38.2倍和27.1倍. 结果显示,对苯二酚浓度越高,胞外MCLR升高的越多,即胞内MCLR向外释放的越多. 至第6 d,不同剂量条件下的胞外MCLR与其最大值相比,均减少了约200~300 μg ·L-1.
![]() | 图 2 胞外MCLR浓度随时间的变化
Fig. 2 Variation of extracellular MCLR during the cultivation
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总MCLR为胞内MCLR和胞外MCLR的总和,反映了MCLR总量的变化,以及MCLR产生与释放的变化规律. 如图 3所示,在EC20剂量作用下,总MCLR约为对照样的72.4%~83.0%,且藻细胞生长过程中一直低于对照样,表明藻细胞生长受到一定程度抑制的同时,MCLR的合成也受到了抑制,但是胞外MCLR浓度却高于对照样(图 2),约为对照样的2.03~4.48倍. 虽然胞内藻毒素产生量偏低,但仍有14.4%~21.8%的MCLR释放至胞外,说明即使在低剂量对苯二酚作用下,藻细胞仍向环境水体释放MCLR. 在EC50~EC99剂量作用下,总MCLR先上升后下降,最大值达到对照样的1.77~3.13倍,至第6 d又减少了约300~400 μg ·L-1,EC50和EC70降为对照样的63.6%、 90.3%,均已小于对照样,而EC90和EC99则降为对照样的1.1倍和1.51倍,仍高于对照样. Jang等[10]研究发现在浮萍通过释放化感物质作用于铜绿微囊藻的12 d里,胞内胞外藻毒素及其总量均高于对照样,这和本研究中高剂量对苯二酚作用下的结果类似,可见一些抑藻剂的投加会刺激藻细胞产生并释放更多的藻毒素. 结果表明在EC50~EC99作用下,虽然藻细胞的生长受到较强的抑制,但是多数细胞的死亡,导致细胞内原有的藻毒素以及对苯二酚刺激下产生的藻毒素释放进水体,不过随着时间的推移,藻毒素浓度出现了下降趋势. 相比之下,对照样的藻毒素总量随着细胞的生长而逐渐升高,所以,如果不对藻细胞的生长进行抑制,当这些细胞死亡时,仍将释放出大量的毒素. 藻毒素的产生和释放除了与抑藻剂投加剂量有关外,还与藻种有关,研究显示在同一浓度壬基酚的作用下,2种不同的铜绿微囊藻胞内藻毒素的产生量不同、 释放量也不同[12].
![]() | 图 3 总MCLR浓度随时间的变化
Fig. 3 Variation of total MCLR during the cultivation
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MCLR的物理化学性质很稳定,但是在本研究中,胞外MCLR出现了逐渐下降的现象,这是由于实验是在无菌条件下进行的,所以不存在微生物的降解作用. 研究显示,蓝藻中的色素[20]、 叶绿素[21]以及腐殖质[22]等可以作为光敏剂,使藻毒素在日光照射下发生降解,因此,在培养箱的光照条件下,藻毒素MCLR发生了一定程度的降解去除.
2.3 胞内有机物的释放三维荧光光谱可以有效分析溶解性有机物的化学组成[23],本研究通过对藻液离心后上清液的荧光光谱分析细胞内有机物在对苯二酚作用下的释放情况. 图 4为对照样的三维荧光光谱图,共检测出3组荧光峰,峰A在Ex/Em=(275~280) nm/(331~342) nm范围内,主要是类蛋白物质,即类溶解性微生物代谢产物,如类色氨酸、 类酪氨酸及其残基; 峰B在Ex/Em=(344~375) nm/(424~462) nm范围内,是类腐殖酸物质; 峰C在Ex/Em=(260~275) nm/(421~464) nm范围内,是紫外区的类富里酸物质[1,24].
![]() | 图 4 对照样第1 d的三维荧光光谱图
Fig. 4 Three-dimensional fluorescence spectrum of the control sample on the 1st day
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不同剂量条件下峰A、 峰B和峰C相对荧光强度随时间的变化如图 5所示. 可以看出,不管对苯二酚的剂量是多少,相比对照样,峰B和峰C强度在第1 d都有所升高. 但是对苯二酚空白样品的三维荧光谱图中却没有检测出峰B和峰C,表明在对苯二酚作用下,藻细胞释放了更多的类腐殖酸和类富里酸物质,且对苯二酚浓度越高,类腐殖酸和类富里酸升高得越多,即释放得越多. 第1 d后峰B和峰C强度开始明显下降,到第6 d已接近对照样品.
![]() | 图 5 对苯二酚作用下各荧光峰强度随时间的变化
Fig. 5 Variation of fluorescence intensity during the cultivation under the inhibition of hydroquinone
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峰A的变化规律与峰B、 峰C完全不同,根据对苯二酚空白样品的三维荧光光谱检测,可以发现它在峰A处具有很强的荧光特性,EC20~EC99所对应的相对荧光强度约为1 300~7 900. 但是当藻液中加入对苯二酚后,峰A的强度反而出现了显著下降,均低于1 300,说明藻细胞对对苯二酚产生了强烈的吸收,对苯二酚进入细胞体内,导致溶液中峰A强度的下降,这也是对苯二酚能够抑制藻细胞生长的原因. 除了EC99外,在其它剂量作用下,峰A强度与对照样相近或略高,而EC99的峰A强度只有对照样的52.8%~62.6%,这可能是因为部分类蛋白物质被死亡的藻细胞所吸附. 研究显示,微囊藻细胞碎屑能够吸附氨氮,并在30 min内即达平衡,吸附过程符合Herry吸附模式[25]; 死亡的蓝藻细胞还能吸附重金属Cu2+,Freundlich模型能很好地描述这个生物吸附过程[26]. 因此,在EC99作用下,大量死亡的细胞反过来吸附了所释放的类蛋白有机物.
图 6是不同生长抑制状态下,胞外TOC浓度随时间的变化. 从中可知,在对苯二酚作用下,第1 d的TOC值均高于对照样,由于对苯二酚被藻细胞所吸收,所以溶液中TOC的升高应该是由细胞分泌物质所带来的. 类腐殖酸、 类富里酸以及其它有机物质的释放均对TOC值的升高起到了一定作用. 可以发现,虽然在EC50和EC70作用下,类腐殖酸、 类富里酸浓度后来都有明显降低,但是TOC的变化却不是很大,这可能是因为类腐殖酸和类富里酸逐渐被降解为不具备荧光特性的小分子溶解性有机物,因此TOC能够检测出来,但是三维荧光光谱却检测不出来. 与EC50和EC70不同,在EC90和EC99剂量作用下,TOC浓度从第2 d开始下降,与第1 d相比,第6 d的TOC浓度分别降低了38.3%和33.2%,这可能仍然源于死亡藻细胞所产生的吸附效应. 从高剂量对苯二酚作用下三维荧光光谱和TOC的结果不难看出,藻细胞死亡后极有可能作为生物吸附剂,对溶液中的部分物质产生了吸附效应.
![]() | 图 6 TOC浓度随时间的变化
Fig. 6 Variation of TOC during the cultivation
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不同对苯二酚投加剂量使铜绿微囊藻处于不同生长抑制状态,藻毒素的产生与释放规律不同. 在EC20作用下,藻毒素合成受到抑制; 在EC50~EC99作用下,藻细胞受到刺激,产生了更多的藻毒素,且大部分释放至胞外,在光照以及其它物质的作用下,胞外毒素可以被降解. 对苯二酚投加后,能够被藻细胞迅速吸收进入细胞体内,在其作用下,铜绿微囊藻向胞外释放的有机物主要是类腐殖酸和类富里酸物质,类蛋白物质释放则不明显.
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