在20世纪80年代兴起的Microtox技术(又称发光细菌毒性测试技术)，广泛应用于各种工业废水^{[1, 2, 3]}和地表水^[4]的毒性监测. 其原理为将海洋荧光发光菌暴露在各种环境样品中(水样品或土壤提取物)，通过检测荧光的减少量来表征环境中样品的生物毒性^{[5, 6]}，但天然发光菌存在灵敏度不够、 生物学意义不明确等诸多问题. 所以，国外许多研究人员把目光投向基因工程改造发光菌^{[7, 8, 9, 10]}，此类诱导型重组发光菌能够合成如β-半乳糖苷酶^{[11, 12, 13]}、 荧光素酶^{[14, 15, 16]}、 GFP^{[17, 18, 19]}等报告蛋白^{[20, 21, 22]}，用于表征环境中样品的毒性^[23]. 近来，研究人员开发出一种极其敏感且具有专一性并由基因编码的荧光感受器Frex^[24]，从而达到监控细胞内NADH水平的变化. 其作用原理为Frex蛋白能与体内的NADH进行结合，使其构象发生变化后激发强荧光^[25]. 目前该荧光感受器已经应用于哺乳细胞中监测如NADH转移、 葡萄糖代谢、 电子传递链、 氧化还原反映等作用. 本研究完成了Frex表达质粒转化入大肠杆菌并使其正确表达，后将该重组菌暴露于毒性环境中，通过监测菌液荧光值的变化来反映环境中生物毒性的大小. 本实验优化形成了一套新型的基因工程发光菌测试方法，初步将其应用于生物毒性物质检测，所得结果均验证了该方法的可行性.

1 材料与方法 1.1 材料

E.coli BL21(DE3)pLysS购于北京TransGen生物技术有限公司. Frex重组表达质粒来自华东理工大学杨弋教授. SDS-PAGE蛋白marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司. Western-blot蛋白marker购于Rainbow公司. 一抗His-probe购于Santa Cruz Biotechnology公司，二抗Anti-rabbit-HRP购于GE Healthcare公司. ECL Western blotting检测试剂盒购自Millipore公司. Frex纯化蛋白由实验室纯化及保存. 实验室已保存氯化汞母液浓度为2 000 mg ·L^-1，分别用去离子水配置3，5-二氯苯酚、 重铬酸钾、 硫酸锌母液，浓度均为2 000 mg ·L^-1. 其他试剂及药品均为进口或国产分析纯.

LB培养基(g ·L^-1)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，121℃灭菌20 min，用于BL21(DE3)pLysS培养.

LB选择培养基(g ·L^-1)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，121℃灭菌20 min，冷却后加入Amp，终浓度为100 μg ·L^-1，用于E.coli转化子培养.

对于固体培养基，则在液体培养基中加入1.5%的琼脂粉. 1.2 方法 1.2.1 表达菌种的筛选及目的蛋白表达

实验筛选多种宿主菌，最终使用BL21(DE3)pLysS菌株诱导表达Frex蛋白. 将重组质粒pRSETb-Frex转化，次日挑单克隆37℃、 220 r ·min^-1接种入5 mL LB选择培养基中培养过夜. 第3 d按1 ∶100放大至200 mL的LB选择培养基摇瓶培养. 在D值达到0.6～0.8时. 加入 IPTG(终浓度0.1 mmol ·L^-1). 18℃、 220 r ·min^-1条件下诱导表达.

分别在不同的温度、 IPTG浓度和诱导时间对Frex进行诱导表达. 取样进行SDS-PAGE电泳. 诱导前取1 mL菌液，后续每隔2 h取1 mL菌液并测取D及菌液荧光值变化，绘制菌体生长与荧光值相关曲线，确定后续菌体毒物测试最佳时段.

将上一步收集所得1 mL菌液12 000 r ·min^-1离心3 min，弃上清，用50 μL 1×PBS(pH=7.4)悬浮菌体加入20 μL 5×loading buffer，沸水煮10 min后，20 μL两块胶板同时上样. 按常规进行电泳(120 V，90 min). SDS-PAGE电泳完毕后，第一块胶考马斯亮蓝染色. 蛋白质条带通过全自动凝胶成像ChampGel-3200分析系统扫描检测进行分析. 另一块胶经电转移到硝酸纤维素膜上. 用含有5%脱脂牛奶的1×PBST缓冲液室温封闭1 h，用一抗His-probe 4℃孵育过夜，1×PBST缓冲液每隔5 min清洗5次后加入二抗Anti-rabbit-HRP孵育2 h. 再次用1×PBST缓冲液每隔5min清洗5次后用ECL法进行曝光，使用Image Quant LAS 4000 mini进行成像.

诱导后菌液4 000 r ·min^-1离心5 min后弃上清，用新鲜的LB培养基重悬菌体，悬浮后菌液分别取1 mL加入EP管中，置于20、 25、 30、 37℃水浴保温5 min，96孔板亦同等温度保温，取200 μL菌液加入96孔板中，测量荧光值变化. 上步其余重悬后菌液每20 mL分装入50 mL的试管中，分别用HCl和NaOH调节pH至2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0、 12.0、 13.0，分别从各试管取200 μL菌液加入96孔板中(3组平行)，测得不同pH条件下菌液荧光值. 取不同pH条件下菌液，25℃保温15 min后，结晶紫染色后显微镜下观察细胞菌体形态.

收集诱导后菌体，4 000 r ·min^-1离心去上清，新鲜LB培养基重悬，所得菌液放入25℃水浴保温5 min. 将毒物氯化汞、 3，5-二氯苯酚、 重铬酸钾、 硫酸锌分别稀释成不同浓度于1 mL EP管中保存，置于25℃保温5 min. 酶标仪机器恒定测量温度为25℃，取保温重悬菌液180 μL分别加入96孔板中，酶标仪测取初始荧光值(确保各孔间菌液荧光值相对差值<5%). 再依次向各孔中加入不同浓度毒物20 μL(加入20 μL无菌水孔作为阴性对照). 首先设定酶标仪每隔1 s自动测取各孔间荧光值变化，观测荧光值是否在一定时间内趋于稳定，观测总时间为2～3 min. 设定机器每隔30 s自动测取各孔内荧光值变化，每次测量前设定振动5 s以确保菌液和毒物充分混匀，测量总时间为15 min.

所有数据均由OriginPro 8.5作图软件处理.

相对荧光强度(RFU)=加入毒物孔板荧光值/对照孔板荧光值×100%

荧光抑制率(Inhibitory rate)=(对照孔板荧光值-加入毒物孔板荧光值)/对照孔板荧光值×100%

2 结果与讨论 2.1 目的蛋白鉴定

如图 1所示，泳道1为纯化蛋白，2为未诱导菌体，3～12分别为诱导2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 h后菌体蛋白表达情况. Frex表达质粒带有His-tag标签，故通过图 1可以验证Frex在大肠杆菌中已正确表达，蛋白表达量在诱导6 h后趋于最大值，菌体自身存在部分本底表达(未加IPTG表达融合蛋白). 诱导温度设定为18℃，诱导时间为20 h，如图 2(a)所示，泳道1为纯化蛋白，2～6为IPTG 浓度分别为0.1、 0.3、 0.5、 0.8、 1.0 mmol ·L^-1时菌体诱导表达情况. 结果表明IPTG浓度对于Frex表达量影响并不明显，故本实验采用IPTG诱导浓度为0.1 mmol ·L^-1. 设定诱导时间为20 h，IPTG浓度为0.1 mmol ·L^-1，如图 2(b)所示，泳道1为纯化蛋白. 2～5分别为温度18、 25、 30、 37℃条件下菌体蛋白表达情况. 结果表明诱导温度对蛋白表达量无明显影响，但为了Frex的正确表达，本实验诱导温度设定为18℃.

图 1

Fig. 1

图 1 融合蛋白Frex的鉴定 Fig. 1 Western blotting analysis of fusion protein Frex

图 2

Fig. 2

图 2 Frex在大肠杆菌BL21(DE3)pLsyS中的表达及SDS-PAGE分析 Fig. 2 Influence of inducer concentration on the expression of fusion protein Frex

图 3结果表明，当D=0.7左右加入IPTG诱导后，菌体量在6 h内增长较快，6～20 h内增殖速度明显变慢，20 h后菌体生长进入平台期，趋于稳定，诱导后菌液最大D值为1.8左右. 随着诱导时间增加，菌体D值变大，菌体内诱导表达的蛋白量增多，由图 1已知，菌体在诱导6 h后，目的蛋白含量趋于最大值，后续增加量不明显，而图 3中可以看出菌体荧光呈持续增加，诱导16 h后达到最大值662，取样检测结果表明，此时菌体形态和活力均非常良好，故为了提高毒物实验的准确性和灵敏性，笔者决定取诱导16～20 h后菌体进行后续荧光发光菌毒物实验.

图 3

Fig. 3

图 3 IPTG诱导后菌体生长D及荧光值曲线 Fig. 3 Growth and fluorescence curve of BL21(DE3)pLysS induced by IPTG

Zhao等^[25]通过对比不同激发波长下检测的荧光强度，发现当Frex蛋白与NADH结合后在发射波长E_m=518 nm时，在激发波长E_x为420 nm与500 nm均出现峰值^[26]，通过酶标仪可以检测出较强荧光. 当E_x分别为500 nm与420 nm时，前者所测得荧光强度约为后者5倍. 同时由于激发波长为420 nm时，菌体在培养基中本底荧光值较大，故本实验选取后续毒物实验荧光测量波长E_x与E_m分别为500 nm和525 nm，这样实验中所测菌体荧光值能够更加贴切地反映菌体荧光总量的变化.

图 4

Fig. 4

图 4 发光菌毒物测试条件 Fig. 4 Toxicology test conditions of luminescent bacteria

如图 4(a)所示，该菌体荧光值随pH的增大而增大，在pH=10时达到最大荧光值. 而如图 5所示，菌体在pH分别为4.0与10.0的条件下，形态结构已经发生明显变化. 若在此条件下进行发光菌毒物实验，结果并不能完全表征生物毒性. 而诱导后菌液pH值约为7.4左右，在国标规定范围内，故后续实验条件pH范围固定在6.5～7.5之间，既可以维持良好的菌体形态和消除pH波动带来的荧光值的变化，同时也可以确保大部分毒物形态与性质不被破坏，充分表征其生物毒性大小. 目前，国内利用生物荧光发光菌检测环境中有毒物质pH都控制为7.0左右，原因在于消除pH对菌体的影响. 然而，有研究表明为了消除pH的影响，在未知毒物性质的情况下，把pH强行调至7.0左右，这样很有可能会改变毒物的形态和性质. ISO113483: 2007中规定，一般情况下，若样品的pH在6.0～8.5，则不需要调节pH. 国内也有一些专家甚至把发光细菌稳定发光的pH范围^[27]扩大到了5.0～9.0. 因此，建议针对不同的菌种确定其最适的pH范围. 如图 4(b)所示，实验温度为20、 25、 30、 37℃时，菌液荧光值差异较小，说明该重组发光菌具有良好的热稳定性，故后续实验采取接近室温25℃条件下进行.

图 5

Fig. 5

图 5 不同pH条件下菌体显微镜成像 (物镜10×，油镜100×) Fig. 5 Microscope images of bacteria at different pH

在直接终点法毒物实验中，诱导16 h后菌液直接加入不同浓度的4种有毒物质，测得菌液的荧光变化值如图 6所示. 从中可以看出氯化汞、 3，5-二 氯苯酚、 重铬酸钾、 硫酸锌等4种物质对菌体荧光值均有一定的催灭作用，物质种类及毒物浓度的不同致使菌体荧光值不同程度地降低，从而以此来表征不同物质生物毒性的大小. 如图 6(a)、 6(b)和6(d)所示，随着毒物浓度的升高菌体荧光值逐渐下降，低浓度的毒物3，5-二氯苯酚、 硫酸锌、 氯化汞的加入对菌体荧光值产生了少量激活作用，致使菌体的相对荧光值有部分增高，图 6(c)中低浓度毒物重铬酸钾的加入致使菌体相对荧光值降低，由此可以说明，该发光菌对4种物质反应灵敏度极限值约为1 mg ·L^-1. 图 6(b)和6(d)所示，菌体相对荧光值在本实验测试范围内(0～2 000 mg ·L^-1)已分别趋近极限值0.8和0.7，由此可以推断该发光菌对硫酸锌和氯化汞的检测最高极限约为1 000 mg ·L^-1，同理图 6(a)和6(c)表明该发光菌对3，5-二氯苯酚和重铬酸钾的最高测试极限大于2 000 mg ·L^-1. 根据拟合后曲线公式可以求出，图 6中3，5-二氯苯酚、 硫酸锌、 重铬酸钾、 氯化汞这4种物质EC₂₀分别为1 047.5、 978.0、 68.2、 332.5 mg ·L^-1，因此可以得出本研究的荧光菌对该4种物质的检测灵敏度大小依次为重铬酸钾>氯化汞>硫酸锌>3，5-二氯苯酚. Imbi等^[28]比较了3，5-二氯苯酚、 硫酸锌、 氯化汞、 重铬酸钾等7种物质对重组菌E.coli MC1061(pDNlux)和E.coli MC1061(pSLlux)以及V. fischeri等发光菌的影响(暴露时间为30 min)，证明了毒物作用途径同为氧化损伤与重金属盐变性，该实验结果与本实验类似，氯化汞与重铬酸钾的EC₅₀值均小于3，5-二氯苯酚和硫酸锌等其他毒物，对发光菌具有较强毒性作用.

图 6

Fig. 6

图 6 终点法毒物实验分析 Fig. 6 Direct endpoint assay

图 7为不同浓度硫酸锌与荧光发光菌的作用随时间变化，表明毒物与发光菌作用能快速达到相对稳定状态(即相对荧光值不再发生明显变化)，此过程反应所需时间非常短，通常只需数十秒至几分钟. 如图 7(a)所示，菌体在加入硫酸锌后终浓度为10 mg ·L^-1时，荧光值相对值在迅速升高约0.1，而菌体加入硫酸锌后终浓度为1 000 mg ·L^-1时，相对荧光值迅速降低约0.15，由此可以看出发光菌对毒物反应十分迅速. 图 7(b)表明，在硫酸锌终浓度为100 mg ·L^-1时，相对荧光值迅速下降至0.831后2 min内缓慢回升至1.03，后保持相对稳定状态. 我国常见的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、 费氏弧菌、 青海弧菌，此类发光菌急性毒物试验常用检测时间均为15 min^[29]，故本验方法较此类发光菌有反应迅速的优势.

图 7

Fig. 7

图 7 硫酸锌对发光菌作用分析 Fig. 7 Effect of zinc sulfate heptahydrate on luminescent bacteria assay

本实验作为一种原核生物实验方法，由于原核生物自身特点不可避免地含有一些缺陷，例如某些化合物表现毒性须经过真核生物体内复杂的代谢活化，所以原核细胞对毒性物质的耐受性较真核细胞高^[30]. 而从本实验结果可以看出BL21(DE3)plysS菌体不仅满足了接近淡水的培养条件,并具有较高的毒物耐受性，在用于检测高浓度、 成分复杂的废水方面可以提供更好的技术支撑. 其快速反应的特点以及良好的热稳定性足以保证第一时间高效地获取微生物所处环境的基本信息，并为进一步的高级动物毒性试验和化学分析提供了可靠的依据.此基因工程菌的引入,将大大扩宽发光细菌法的应用范围与灵活性. 若能进一步改进和解决该发光细菌的适应性、 稳定性、 活化保存技术和菌体的固定化技术等问题，各种类型的生物发光传感器^{[31, 32, 33]}等应用产品将不断涌现.

综上所述，该基因工程菌分别具有所需毒物与菌体的接触反应时间非常短、灵敏度高、毒物耐受性强、 热稳定性好且适用于淡水环境等优点，笔者希望综合指示快和灵敏性高两大优点，使其未来可能成为一种快速预警和监测水体环境污染的工具.

3 结论

(1)成功在宿主菌BL21(DE3)pLysS中表达Frex荧光蛋白，诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol ·L^-1，温度为18℃，诱导时间20 h，此条件下菌体内荧光蛋白表达量高且代谢稳定； 确定发光菌毒物测试pH范围固定在6.5～7.5之间，激发波长E_x与发射波长E_m分别为500 nm和525 nm，该发光菌具有优良的热稳定性，测试温度为25～40℃时均具有良好的发光性能.

(2)不同浓度3，5-二氯苯酚、 硫酸锌、 重铬酸钾、 氯化汞这4种标准物质，菌体均能做出不同程度的反应，此过程反应所需时间非常短，通常只需数十秒至几分钟，能够极其快速地表征出样品的生物毒性. 本实验毒物检测的最低阈值为1 mg ·L^-1，具有较高的灵敏性. 硫酸锌和氯化汞最大检测上限约为1 000 mg ·L^-1，而由于常温下苯酚和重铬酸钾溶解度的限制，只能判断其检测上限大于2 000 mg ·L^-1，据此性质可将该发光菌应用于高浓度工业废水的毒性评价.

(3)本荧光菌对3，5-二氯苯酚、 硫酸锌、 重铬酸钾、 氯化汞这4种物质的检测灵敏度大小依次为重铬酸钾>氯化汞>硫酸锌>3，5-二氯苯酚，本实验条件下菌体生理形态结构稳定，能够准确地反映样品生物毒性大小.