1 甲烷菌的发现历史

微生物产甲烷是一个非常普遍的现象，如许多动物的胃肠道系统、 湿地土壤、 河湖等水体的沉积物以及许多极端环境如高温、 高寒、 高盐环境等都存在产甲烷过程[1].

1776年意大利物理学家Alessandro Volta发现富含腐烂水草的溪流、 沼泽和湖泊会产生可燃性气体^[2]. 随后Bechamp等^[3]研究发现这些可燃性气体的生成是微生物作用导致的. 1931年Fischer等^[2]从污泥中得到了一种培养物(没有指明是纯培养微生物)，可以利用一氧化碳作为碳源生产甲烷. 直到1933年Stephenson等^[4]从来自于英国Ouse河的污泥中第一次分离得到了产甲烷菌的纯培养物，他们把样品接种到以甲酸为唯一碳源的培养基中发酵，结果表明该培养物可以生产甲烷：

Wolfe等^[5]第一个得到了产甲烷菌纯培养物并第一次对产甲烷菌的产甲烷代谢酶类和反应过程进行了研究，他们的工作被认为是产甲烷菌研究新时代的标志. 此后随着厌氧培养技术的进步，特别是1950年Hungate首创了亨盖特滚管技术，在厌氧生物降解的环境中如淡水及海水沉积物、 昆虫和动物等的消化道、 厌氧废弃物处理厂等处分离了大量的产甲烷菌^[5,6,7,8,9]. 近年来由于分子生物学技术和厌氧培养技术的进步，各种环境如动物胃肠道、 水稻田、 微生物垫、 热泉等环境中也都分离得到了产甲烷^{[1, 10, 11]}，使人们加深了产甲烷菌在自然界广泛分布现象的认识.

2 产甲烷菌的分类

随着越来越多产甲烷菌的分离及进一步的生理生化和基因组特点的分析，研究人员发现越来越多的产甲烷菌和传统意义上的细菌的区别. 19世纪70年代末逐渐形成了区别于细菌的古细菌的概念^[12]，并在1990年正式确定了古细菌的分类地位^[13]. 产甲烷菌一词则是于 1974 年由Bryant^[14] 首次提出的，将产甲烷菌同嗜甲烷菌(以甲烷为底物的细菌)区分开. 利用16S rRNA序列信息对产甲烷菌进行分类是Balch等^[15]在1979年首先提出的. 他们通过对比16S rRNA序列的相似性，把当时已经纯培养的17株产甲烷菌分为3个目(甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、 甲烷球菌目(Methanococcales)和甲烷微菌目(Methanomicrobiales)，4个科，7个属. 随着所分离的产甲烷菌的增多，需要丰富产甲烷菌类群的分类特征. 当前产甲烷菌新种描述的基本标准特征包括培养特性、 形态学特性、 革兰氏染色特点、 电镜形态、 抗原特性、 核酸的GC含量及序列特点和细胞脂类等. 最新的分类中产甲烷菌包含6个目(Methanocellales目2008划分^[16])，12个科，35个属^[17](表 1).

表 1(Table 1)

表 1 产甲烷菌分类 Table 1 Taxonomy of methanogens 目 科 属 Methanobacteriales Methanobacteriaceae Methanobacterium Methanobrevibacter Methanosphaera Methanothermobacter Methanothermaceae Methanothermaceae Methanococcales Methanococcaceae Methanococcus Methanothermococcus Methanocaldococcaceae Methanocaldococcus Methanotorris Methanomicrobiales Methanomicrobiaceae Methanoculleus Methanofollis Methanogenium Methanolacinia Methanomicrobium Methanoplanus Methanospirillaceae Methanospirillum Methanocorpusculaceae Methanocorpusculum Methanocalculus Unclassified Methanolinea Candidatus Methanoregula Candidatus Methanosphaerula Methanosarcinales Methanosarcinaceae Methanosarcina Methanococcoides Methanohalobium Methanohalophilus Methanolobus Methanomethylovorans Methanimicrococcus Methanosalsum Methanosaetaceae Methanosaeta Methermicoccaceae Methermicoccus Methanopyrales Methanopyraceae Methanopyrus Methanocellales Methanocellaceae Methanocella

表 1 产甲烷菌分类 Table 1 Taxonomy of methanogens

2005年Bapteste等^[18]对除Methanocellales外的产甲烷菌进行了系统发育分析，并研究了当时已经发现的产甲烷菌的核糖体蛋白和其他一些共有的蛋白，将产甲烷菌划分为2个纲(Class Ⅰ and Class Ⅱ)：Class Ⅰ：甲烷杆菌目(Methanobacteriales)，甲烷球菌目(Methanococcales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)； Class Ⅱ：甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales). 目前对于Class Ⅱ的分类得到了学术界的肯定，但是Class I还存在许多争议，缺乏足够的数据支撑^[18,19]. 2008年，Thauer等^[20]根据细胞中是否含细胞色素将产甲烷菌分为两组(Group1 和Group 2),Group1：甲烷八叠球菌目； Group2：甲烷杆菌目、 甲烷球菌目、 甲烷火菌目和甲烷微菌目. 2009年Luo等^[21]以基因序列为计算基础，利用MSOAR软件分析了8株产甲烷菌的同源基因. 他们的分析结果同样支持产甲烷菌的2纲分类理论，但是不同的是他们把甲烷杆菌目和甲烷火菌目同样归为Class Ⅱ. 而Anderson等^[22]依据产甲烷菌的关键蛋白基因将产甲烷菌分为3个纲：Class I：甲烷杆菌目，甲烷球菌目和甲烷火菌目； Class Ⅱ：甲烷微菌目； Class Ⅲ：甲烷八叠球菌目.

产甲烷菌在形态上与其他微生物变化不大，已发现的产甲烷菌形态上有杆状、 规则或不规则的球状、 长链杆状、 螺旋状、 八叠状等，有时也呈现一些不规则形状如不规则扁平盘状^[17]. 一些菌株可以聚集生长形成菌落. 产甲烷菌的细胞壁结构与其他细菌的细胞壁结构差别很大. 一般细菌的细胞壁均有胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的肽聚糖或二氨基庚二酸成分，产甲烷菌的细胞壁没有胞壁酸也没有二氨基庚二酸成分而是有大量的杂多糖和许多蛋白质亚基组成^[23]. 细胞壁的特性决定了其革兰氏染色结果不同于其他细菌. 产甲烷菌的革兰氏染色既有阴性也有阳性，甚至在同一属内不同种之间也是既有阴性也有阳性^[24]. 不同的产甲烷菌细胞壁之间也有区别. 甲烷八叠球菌属和甲烷鬃菌属的部分种的细胞中含有气泡. 产甲烷菌的细胞膜结构与细菌的细胞膜差别很大，甚至产甲烷菌之间的差别也很大.

产甲烷菌对底物有很强的特异性，它们可以利用的底物只有H₂、 CO₂、 甲酸、 甲醇、 甲胺、 乙酸等，最终的代谢产物都含有甲烷. 产甲烷是产甲烷菌获得能量的唯一途径，同时产甲烷菌是唯一以甲烷作为代谢终产物的微生物类群^[25]. 目前的研究发现产甲烷菌有3种代谢类型，分别是CO₂营养型、 甲基营养型和乙酸营养型^[26]. 3种代谢途径的典型反应和自由能如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 不同代谢类型产甲烷菌的典型反应和典型微生物[26] Table 2 Free energies and typical organisms of methanogenesis reactions 反应式 ΔG0’a(以CH4计)/kJ·mol-1 产甲烷菌类群 Ⅰ. CO2-type 4 H2+CO2 CH4+2 H2O -135 Most methanogens 4 HCOOHCH4+3 CO2+2 H2O -130 Many hydrogenotrophic methanogens CO2+4 isopropanolCH4+4 acetone+2 H2O -37 Some hydrogenotrophic methanogens 4 CO+2H2OCH4+3 CO2 -196 Methanothermobacter and Methanosarcina Ⅱ. Methylated C1 compounds 4 CH3OH3 CH4+CO2+2 H2O -105 Methanosarcina and other methylotrophic methanogens CH3OH+H2 CH4+H2O -113 Methanomicrococcus blatticola and Methanosphaera 2 (CH3)2-S+2 H2O3 CH4+CO2+2 H2S -49 Some methylotrophic methanogens 4 CH3-NH2+2 H2O3 CH4+CO2+4 NH3 -75 Some methylotrophic methanogens 2 (CH3)2-NH+2 H2O3 CH4+CO2+2 NH3 -73 Some methylotrophic methanogens 4 (CH3)3-N+6 H2O9 CH4+3 CO2+4 NH3 -74 Some methylotrophic methanogens 4 CH3NH3Cl+2 H2O3 CH4+CO2+4 NH4Cl -74 Some methylotrophic methanogens Ⅲ. Acetate CH3COOHCH4+CO2 -33 Methanosarcina and Methanosaeta

表 2 不同代谢类型产甲烷菌的典型反应和典型微生物[26] Table 2 Free energies and typical organisms of methanogenesis reactions

产甲烷菌的代谢具有区别于其他微生物的明显生化特征，产甲烷菌细胞内有独特的辅助因子参与甲烷的合成，这些辅助因子包括: ①甲烷呋喃(MFR)，把CO₂还原为甲酰基水平并使其与呋喃的氨基侧链结合，然后转移给第二个辅酶； ②、 四氢甲烷蝶呤(MP，F342因子)，辅助甲酰基还原为甲基. 在细胞内以H₄MPT形式存在； ③辅酶M，(CoM)，甲基的载体； ④辅酶F430，作用与辅酶M作用相似； ⑤辅酶F420，可在低氧化还原电势下做双电子载体； ⑥辅酶HS-HTP，在甲烷形成的最终步骤中作为甲基还原酶的电子供体. 其中前4种辅酶是作C1的载体的辅酶，另外两种是参与氧化还原反应的辅酶.

大多数的产甲烷菌可以利用氢作为电子供体将CO₂还原为甲烷[图 1(a)]. 宏基因组研究发现产甲烷菌利用H₂和CO₂生成甲烷的过程中有200多个基因参与^[27]. 许多CO₂营养型产甲烷菌既可以利用氢作为电子供体也可以以甲酸作为电子供体. 这些微生物可以通过甲酸脱氢酶将甲酸氧化为CO₂然后进入CO₂代谢途径. CO₂首先与MFR结合并被还原为甲酰基水平. 然后甲酰基转移到H₄MPT上，形成次甲基复合物并进一步形成亚甲基复合物和甲基复合物. 然后甲基转移给CoM，形成甲基-CoM复合物. 最后一步由甲基辅酶M还原酶(Mcr)将甲基还原为甲烷. 第二种产甲烷代谢类型为甲基营养型，可利用的底物包括甲醇，含甲基的胺类(甲胺、 二甲胺、 三甲胺、 和四甲基铵)，含甲基的硫化物(甲硫醇和二甲基硫)[图 1(b)]. 能够利用甲基化合物的产甲烷菌只局限于甲烷八叠球菌目以及甲烷杆菌目的甲烷球形菌. 甲基化合物在代谢时首先通过一个中间蛋白将甲基转移给CoM形成甲基—CoM复合物. 甲基—CoM复合物进入产甲烷代谢通路最终被还原为甲烷. 第三种营养类型为乙酸营养型[图 1(c)]. 乙酸是微生物厌氧代谢过程的主要的中间产物，大约有三分之二生物成因的甲烷是乙酸代谢的结果. 但是到目前为止只发现了2个属(甲烷八叠球菌属，Methanosarcina和甲烷鬃菌属，Methanosaeta)的产甲烷菌可以利用乙酸产甲烷. 这两个属的产甲烷菌通过解乙酸反应分解乙酸然后将羧基氧化为CO₂，将甲基还原为甲烷. 甲烷八叠球菌属的微生物生长较快，利用乙酸时第一步将乙酸活化需要消耗一个高能磷酸键，对乙酸的浓度要求较高. 同时甲烷八叠球菌属的微生物代谢底物较为广泛，并且有些微生物利用甲醇和甲胺的倾向比利用乙酸更大一些，有些也可以利用氢气作为电子供体. 甲烷鬃菌属的产甲烷菌生长缓慢只能利用乙酸，利用乙酸时第一步将乙酸活化需要消耗两个高能磷酸键，对乙酸有很高的亲和力^[28].

图 1

Fig. 1

图 1 产甲烷菌产甲烷代谢途径 [26] Fig. 1 Pathways of methanogenesis by methanogens (a)以H2/CO2或甲酸盐为底物的代谢途径； (b)以甲醇为底物的代谢途径； (c)以乙酸盐为底物的代谢途径

4 产甲烷菌的生态学研究

产甲烷菌广泛分布于自然界各种厌氧环境中，尤其是有机质含量高、 氢含量在7~10 nmol ·L^-1，缺乏NO^-₃、 Fe³⁺和SO^2-₄等电子受体，氧化还原电位低于-200 mV的厌氧环境中(-320 mV以下正常生长，-160 mV时可以生长繁殖但极为缓慢)^{[26, 29, 30]}. 水稻田内甲烷菌分布广泛，成为产甲烷菌生态学研究的热点^[28]. 水稻田土壤中乙酸型产甲烷菌的数量(以干土计，下同)在10⁶~10⁸个 ·g^{-1[31, 32]}. 在乙酸营养型产甲烷菌中甲烷鬃菌属在利用乙酸时比甲烷八叠球菌属消耗更多的能量，所以对乙酸的亲和力更强，可以在乙酸含量小于100μmol ·L^-1的环境中生长. 甲烷八叠球菌属对乙酸含量要求较高，但是生长速度快，并可以利用H₂和CO₂作为底物. 这可能是甲烷鬃菌属和甲烷八叠球菌属在环境中分布的生态学机制之一. 氢营养型产甲烷菌在环境中的分布也非常广泛，大部分的产甲烷菌都可以利用H₂和CO₂作为底物. 在水稻田土壤中，氢营养型产甲烷菌的数量在10⁶个 ·g^{-1 [31]}. 其中存在一类重要的对氢具有高亲和力的产甲烷菌：Methanocellales[之前为Rice Cluster Ⅰ (RC-Ⅰ)]. 这类微生物适应了根际的特殊环境，对H₂的亲和力较高，对氧有一定的耐受能力，是根际甲烷释放的主要贡献者^[33]. 但是对这类产甲烷菌的分离培养似乎异常困难. 近年来研究发现产甲烷菌尤其是甲烷八叠球菌也广泛分布于氧含量高的环境^[34,35]. 目前这种氧耐受机制还不清楚，可能一方面是由于这类微生物基因组中含有能够消除氧毒性的基因如过氧化氢酶基因，另一方面是由于周围好氧微生物对氧的代谢保护了产甲烷菌^[36,37]. 动物的胃肠道系统中的产甲烷菌以甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)居多，并且都是氢营养型^{[30, 38]}. 产甲烷菌一方面可以维持H₂的平衡，另一方面可以帮助寄主动物从食物中获得更多的能量. H₂的浓度成为这种环境中影响产甲烷菌生态学分布的主要原因.

影响环境中产甲烷菌分布的因素还包括温度、 有机质含量、 NO^-₃、 Fe³⁺和SO^2-₄等电子受体含量、 植被类型(土壤)等. 温度的变化可以影响所有的生化过程，包括产甲烷菌的代谢以及为产甲烷菌提供底物的微生物的代谢活性. 同时温度也会影响土壤的含水量，改变土壤的透气性对O₂和CH₄的扩散产生影响，进而影响产甲烷菌. NO^-₃、 Fe³⁺和SO^2-₄等电子受体存在时，相应的微生物，如硝酸盐还原菌、 铁还原菌、 硫酸盐还原菌，可以利用这些作为电子受体与产甲烷菌竞争底物. 同时NO^-₃作为反硝化作用的底物会产生NO、 N₂ O等，这些中间产物对产甲烷菌造成不良影响. 植被类型对产甲烷菌的影响一方面是植物根系分泌物、 凋落物等作为产甲烷菌的底物，另一方面作为甲烷释放和氧气扩散的通道来影响产甲烷菌的分布.

5 产甲烷菌研究展望

多年的研究成果表明，纯培养产甲烷菌的代谢过程和生化特性等相对清楚，但是分子生物学技术揭示环境中存在的尚不可培养的产甲烷微生物，其可能存在新的生化特性有待于人们去认识，但必须获得纯培养物，因此如何发现新的培养条件和技术而获得纯培养甲烷菌是重要的研究方向之一. 另一方面，由于甲烷产生与环境和能源密切相关，应用分子生物学高通量测序技术、 同位素标记技术、 基因芯片技术等对产甲烷菌的生态学机制研究，揭示微生物群落和功能相关性，都具有重要的理论和实际意义.