牛粪富含氮、 磷、 有机质等易引起富营养化的物质，若不经处理而直接排放，容易增加环境负荷并造成周围环境恶化. 目前，牛粪典型的处理方式是厌氧消化产沼气，然而厌氧消化系统中两类主要功能菌群(产酸发酵菌群和产甲烷菌群)在营养需求、 环境适应性、 生理代谢过程等方面存在较大差异^[1]，易导致该系统较难平衡和控制，运行稳定性欠佳^[2]，阻碍了该技术的推广和商业化^[3]，因此，亟待发展替代性技术来实现牛粪的高效处理和资源化.

最近有研究人员发现，MFC技术不仅可以利用如乙酸钠^[4]、 葡萄糖^[5]等简单纯有机物基质产电，而且还能利用生活污水^[6]、 啤酒酿造废水^[7]、 剩余污泥^{[8, 9]}、 牛粪^{[10, 11, 12]}等混合复杂有机物基质产电，其反应条件温和，容易控制. 在这些复杂有机物基质中，由于牛粪富含纤维素、 木质素等不易被微生物分解利用的有机物质，研究者不断尝试使用不同的MFC反应器及强化措施来提高功率密度，如Lee等^[13]利用过筛牛粪转化电能，在单阴极和双阴极微生物燃料电池中分别可获得0.2 W ·m^-3和0.3 W ·m^-3的最高功率密度； Kiely等^[14]使用空气阴极MFC以牛粪渗滤液为基质可获得的最高功率密度为4.73 W ·m^-3，Zhang等^[15]利用生物阴极MFC来提高牛粪燃料电池的输出功率，在6%总固体浓度下，功率密度最高可达15.1 W ·m^-3. 然而，就目前MFC研究而言，研究者多注重短期的污染物去除和产电效果，往往忽略了长期运行稳定性方面的探索. 而长期运行稳定性是MFC技术的一项重要特征，是MFC技术能否走向实际应用关键所在，对其进行研究具有重要的现实意义.

因此，本研究通过构建生物阴极MFC，将其长期运行处理牛粪并回收电能，考察牛粪MFC产电特征、 能量回收效能、 有机物降解效率等随运行时间的变化情况，判断其长期运行稳定性； 同时通过分析MFC在稳定运行阶段阳极微生物群落结构组成，以探索牛粪MFC的运行稳定性状况下发挥产电作用的关键微生物种群.

1 材料与方法 1.1 实验装置与启动 1.1.1 实验装置

反应器(图 1)由三室组成，包括一个阳极室(圆柱形，φ100 mm×90 mm)和两个相同的阴极室(长方体，80 mm×80 mm×50 mm)，在阳极室侧壁，开有两个对称的80 mm×80 mm长方形窗口，用以衔接两阴极室，阴极室和阳极室用质子交换膜(Nafion 117，Dupont公司)隔开. 两个阴极室用φ10 mm直径的乳胶管连接，让阴极电解液在两个阴极室之间自由流通. 反应器阳极室总容积为706 mL，有效溶液体积为617 mL； 阴极总容积为640 mL，有效溶液体积为321 mL. 阴极室底部铺有塑性曝气条，运行后曝气量为150 mL ·min^-1. 阴阳电极材料均由石墨刷(石墨纤维型号为STS4024K； 由TohoTenax公司生产)组成，减小MFC阳极的传质内阻并促进有机物的迅速降解，对阳极液进行定时搅拌(搅拌器每隔1 h搅拌3 min). 此外，将Ag/AgCl参比电极(0.195 V vs. 标准氢电极，SHE)插入阳极室检测阳极相对电势.

图 1

Fig. 1

图 1 反应器结构示意 Fig. 1 Schematic drawing of the reactor 1.石墨刷； 2.质子交换膜； 3.Ag/AgCl参比电极； 4.搅拌桨； 5.进水口； 6.出水口； 7.电阻

实验用牛粪取自哈尔滨市香坊奶牛场，均为当天排泄物，其性质为：pH值=6.97±0.21、 总固体浓度(total solids，TS)=17.8%±1.6%、 挥发性固体浓度(volatile solids，VS)=86.2%±3.1%、 纤维素含量=34.7%±2.6%、 半纤维素含量=22.5%±1.2%、 木质素含量=23.6%±4.7%、 总碳(total carbon，TC)=41.3%±2.5%、 总氮(total nitrogen，TN)=3. 3%±0.2%，氨氮(NH⁺₄-N)=5 874 mg ·kg^-1±322 mg ·kg^-1，总磷(total phosphorus，TP)=1.57%±0.22%. 其中pH和TS基于牛粪湿体积计算，其余各项基于干体积测量和计算. MFC阳极基质采用TS=6%的牛粪与蒸馏水混合液(TCOD=50 297 mg ·L^-1±1 436 mg ·L^-1，TN=1 453 mg ·L^-1±269 mg ·L^-1). 阳极启动时，将阳极腔体装满6%TS浓度的牛粪混合液后，封闭即可，不必外加接种物. 生物阴极培养液每L包括：1.0 g NH₄Cl； 1.2 g K₂HPO₄； 0.5 g MgSO₄； 0.5 g KCl； 0.14 g KH₂PO₄； 0.01 g Fe₂(SO₄)₃ ·H₂ O； 0.02 g酵母提取物； 培养液添加10 mL微量元素溶液，其成分和生物阴极接种方法见文献^[16]. 1.2 实验方法 1.2.1 电化学测试和计算

MFC电压通过多功能双通道电压信号采集器(12位A/D芯片，U. S. )完成，采样精度和频率分别为10^-3 V和60 s/频次，阴、 阳极电势使用Ag/AgCl电极作为参比电极测定. 在本研究中，当MFC经过平稳的产电期，阳极电势持续保持在-0.20 V、 3 d以上时，被认为是一个周期的结束. 电池极化曲线使用手动法测定：在电池开路12 h时，连接可变电阻箱，电阻值由大到小调节，利用万用表(Agilent HP 34970，U. S. )测定不同外电阻(Rext)下的电压值E，经欧姆定律I=E/Rext 获得对应的电流密度值，绘制成极化曲线，MFC内阻由梁鹏等^[17]提供的方法测得，而功率密度曲线由公式P=E·I计算出功率密度后结合电流密度值绘制而成. 库仑效率(CE)计算依下式进行：

取样时先利用设置在MFC阳极室的搅拌器充分搅拌15 min以上，将底部牛粪充分悬浮和溶液混合后，迅速利用自制的小型桶装污水采样器(φ=20 mm，高为70 mm)伸入反应器不同部位进行取样，每次取3个样品进行测试. 常规指标TCOD、 TC、 TN、 NH⁺₄-N、 TS、 VS的定量分析按照标准方法进行^[18]. 阳极电解液pH值用pH计(pHS-3C型，上海雷磁)进行测试，纤维素、 半纤维素、 木质素含量测定方法参见文献^[19].

在MFC运行稳定后收集阳极电极表面生物膜，采用细菌基因组提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)对总DNA进行提取. 采用带有40 bp“GC夹子”的细菌通用BSF8引物和BSR534引物对16S rRNA V1~V3高变区进行扩增，再利用Dcode^TM基因突变检测系统(Bio-Rad公司)对反应产物进行分离，变性胶梯度为30%~70%. DGGE胶经扫描记录后对可见条带全部回收并PCR扩增，扩增产物链接pMD18-T载体(TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒)并转化E. coli JM109，挑选阳性转化子进行DNA测序(ABI Prism^® 3100遗传分析仪)，基因序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)和RDP(Ribosomal Database Project)基因数据库进行比对分析，并将序列提交于NCBI数据库，登录号为KF052629~052646. 在基因信息比对的基础上，下载各序列的近缘序列，采用MEGA 5.05构建序列进化树^[20].

2 结果与讨论

图 2为牛粪MFC运行一个周期的阴极电势、 阳极电势和功率密度变化情况. 结果显示，启动后，电池电势经历短暂的下降阶段后迅速回升，在第12d，100 Ω外电阻下，电池电势可达到477 mV，表明牛粪生物阴极MFC此时已启动成功. 随后，电池电势继续上升，在第50 d达到719 mV，并在剩余的运行时间保持平稳. 与电池生物阴极启动过程相比，阳极启动过程偏短. 阳极电势在第8 d即可达到-200 mV(vs. Ag/AgCl参比电极)，并在第21 d降低到-400 mV. 在21~156 d时间段内，阳极电势十分平稳，一直保持在-475~-400 mV之间，表明MFC可利用牛粪长期稳定产电. 但在持续运行156 d之后，可能是由于阳极液中可利用有机物不断减少，难于满足产电微生物的代谢需求，阳极瞬时积累电子减少，电势开始上升.

图 2

Fig. 2

图 2 牛粪MFC长期运行功率密度、阴阳极电势变化图 (Rext=100 Ω) Fig. 2 Temporal variation of anode potential,cathode potential and power density of biocathode MFC with diary manure as anode substrate(based on external resistance of 100 Ω)

如图 2显示，功率密度变化直接受阳极电势影响，在启动初期，功率密度存在短暂的停滞期，然后逐步上升，在第7 d即可达到1.2 W ·m^-3(Rext=100 Ω). 随后，随着阳极电势持续降低，电池功率密度持续升高，在第44 d上升到8.2 W ·m^-3，但功率密度最高值出现在启动后第119 d(8.5 W ·m^-3)，这表明牛粪MFC理想产电状态持续时间较长，正如统计数据显示，在启动后的第25~140 d(约占67.3%整个运行期时长)，电池功率密度可持续保持在8.0 W ·m^-3左右. 在171 d的运行期内，电池功率密度平均为6.77 W ·m^-3±2.11 W ·m^-3. 而电池功率密度≥6 W ·m^-3的时间超过137 d，占到总运行天数的81.7%. 充分表明，生物阴极微生物燃料电池能够利用牛粪长期稳定、 高效地产电，MFC在处理牛粪并回收能量方面优势明显.

反应器启动后第70 d，利用调节电阻法测定了MFC极化曲线(图 3). 极化曲线显示，MFC开路电压为0.874 V，内阻为22.1 Ω，内阻与电池总体积比约为16.4 Ω·L^-1. 电池的功率密度曲线显示，牛粪MFC此时的最高功率密度可达14.1 W ·m^-3，对应电流密度高达32.0 A ·m^-3，这是牛粪MFC开路电压较高、 内阻较小的必然结果. 以往利用牛粪产电的同类研究显示，MFC开路电压均小于0.57 V，电池内阻均大于47 Ω，内阻与电池总体积比≥27.2 Ω ·L^-1，因此功率输出只有0.2~4.7 W ·m^{-3[12, 13, 14, 15, 16, 21]}，远小于本研究获得的功率输出.

图 3

Fig. 3

图 3 牛粪MFC运行第70 d极化曲线和功率密度曲线 Fig. 3 Polarization curves and power output vs. current plots of MFC using diary manure as anode substrate on the seventieth operational day

图 4是牛粪MFC运行期内不同运行阶段每30 d的TCOD去除量和库仑效率变化. 其中显示，随运行时间的延长，牛粪每30 d的TCOD去除量呈明显的下降趋势，而库仑效率则呈上升趋势. 如，在0~30 d，反应器 TCOD去除量为7342 mg ·L^-1±742 mg ·L^-1，库仑效率为10.9%±2.0%； 而在121~150 d，TCOD去除量为只有3 514 mg ·L^-1±517 mg ·L^-1，库仑效率提高到17.5%±3.3%. 在0~30 d的TCOD去除量是121~150 d的2.1倍，其库仑效率只有121~150 d的62%. TCOD去除量递减结果表明：在运行初期，牛粪含有机物种类和数量都较多，其中易降解物质在这一时期最为丰富，即可被细菌迅速直接利用的简单有机物质较多，滋生了大量与产电无关的细菌参与代谢而消耗TCOD，从而导致MFC库仑效率较低. 此阶段TCOD去除速率较快，但库仑效率偏低； 然而，到了运行阶段的中后期，牛粪中易降解物质减少，微生物不得不转而水解利用牛粪中的主体物质——纤维素、 半纤维或木质素等物质，此类物质分解困难，TCOD去除速率开始受到限制，与运行前期相比，相同时间内TCOD去除量减少，分解的能量优先被产电相关菌群利用，库仑效率反而升高. MFC运行一个周期(171 d后)，TCOD总去除率为51.0%，出水中TCOD和TN含量分别为24 642 mg ·L^-1±1 127 mg ·L^-1和251 mg ·L^-1±42 mg ·L^-1.

图 4

Fig. 4

图 4 阳极液TCOD月去除量和库仑效率 Fig. 4 TCOD removal and average CE per month in MFC using diary manure as anode substrate in long-term operation Rext=100 Ω，误差值为3次测量标准差

反应器运行平稳后，使用DGGE对阳极生物膜微生物群落结构分析显示(图 5)，图谱中共有18个明显的主条带，表明在阳极表面至少有18个优势细菌群落存在，多样性十分丰富，群落结构较为稳定，在利用牛粪产电的过程中发挥着重要作用.

图 5

Fig. 5

图 5 DGGE图谱 Fig. 5 DGGE profile

将DGGE条带切割后进行克隆后测序，共获得18条完整的DNA序列，以99%的相似度对序列进行同源性分析，共获得18个分类操作单元(operational taxonomic units，OTUs)，利用NCBI和RDP(ribosomal database project)数据库对OTUs进行比对分析. 结果显示，18个OTUs 分别与Proteobacteria(45%，8 OTUs)、 Bacteroidetes(22%，4 OTUs)、 Firmicutes(17%，3 OTUs)、 Actinobacteria(11%，2 OTUs)、 Chloroflexi(6%，1 OTU)等细菌门的微生物序列有较好的同源关系(≥92%)(如图 6)，其中在Proteobacteria中α-Proteobacteria纲包含6个OTUs，占有绝对优势，而β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria纲各包含一个OTU，优势不明显. OTUs比对结果表明，在牛粪MFC阳极生物膜中，Proteobacteria、 Bacteroidetes、 Firmicutes门细菌具有较大的优势地位，这与前面研究者的研究结果十分相似，如Clauwaert等^[22] 比较研究了8个不同类型的反应器，发现，Proteobacteria的4个纲(α-Proteobacteria、 β-Proteobacteria、 γ-Proteobacteria、 δ-Proteobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌是MFC阳极微生物中的主要类群. 而Xing等^[23]发现α-Proteobacteria、 Bacteroidetes、 Firmicutes和δ-Proteobacteria是阳极微生物的主要类群，而γ-Proteobacteria和Chloroflexi 优势地位次之. Kiely等^[24]研究表明，长期运行的空气阴极MFC，在利用简单有机物如甲酸、 乙酸、 乙醇等作基质时，Firmicutes细菌一般所占比例较小或不存在，但是，当利用需要参与TCA循环逐步降解的复杂有机物如：乳酸、 蔗糖、 淀粉、 纤维素等基质时，Firmicutes细菌所占比例较大，常是优势种群，可能与Firmicutes门细菌能利用复杂有机物产电有关. Wang等^[25]利用富含纤维素和木质素的玉米秸秆直接产电研究表明，Firmicutes门细菌是MFC阳极生物膜中的绝对优势种群，这与本研究微生物群落分析结果较为吻合，由于阳极底物牛粪也同样富含纤维素和木质素等物质，需要厚壁菌门(Firmicutes)细菌将其有效降解，并释放电子. 同样，放线菌门(Actinobacteria)(图 6)在阳极的富集也与牛粪富含纤维素等难降解物质有关，因为Actinobacteria门的许多细菌被认为是降解纤维素的有效种群^[26].

图 6

Fig. 6

图 6 牛粪MFC阳极生物膜细菌V3区序列多样性统计分析 Fig. 6 Taxonomic breakdown of bacterial V3 tags from the anode

图 7为DGGE分离条带OTUs分子进化树. 其中显示，在隶属于α-Proteobacteria纲的Band 9、 10、 11、 12、 16、 17条带中，Band 9、 10、 11、 12的亲缘关系较为相近，同属于根瘤菌目(Rhizobiales)，在属的水平上分别与Bradyrhizobium、 Devosia、 Pseudaminobacter、 Methylocystis等属的细菌有较好的同源性，而条带Band 16和17分别与Rhodobacter和Sphingomonas属16S rRNA序列具有≥95%的相似性. 据目前研究报道，在已分离具有产电能力的微生物纯培养体中，有多株细菌隶属于根瘤菌目(Rhizobiales)，如Ochrobactrum antrophi YZ-1^[27]和Rhodopseudomonas palustris DX-1^[28]等，因此推测，在本研究中阳极生物膜富集根瘤菌目细菌，可能与利用牛粪有机物产电存在直接关系. 条带Band 13和14分别与Zoogloea和Acinetobacter属细菌存在较近的亲缘关系，Zoogloea属细菌以容易产生菌胶团而著称，其在牛粪MFC阳极表面的富集说明牛粪在反应器中分解活动旺盛，能够产生大量的糖类物质以供Zoogloea细菌生成菌胶团，改造光滑的石墨纤维电极表面，利于其它菌类附着生成生物膜，高效降解有机物并向电极释放电子.

图 7

Fig. 7

图 7 基于16S rDNA阳极微生物优势种群进化树 Fig. 7 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of dominant populations from anode

Band 1、 3、 5的序列均与Clostridium属细菌16S rRNA存在较好的同源性关系，有研究证实Clostridium属的细菌常常是在MFC中利用纤维素等复杂有机物产电的关键种群^[15,25]，此外被分离的Clostridium beijerinckii、 Clostridium butyricum细菌种的纯培养体在2004年已被证实可以利用淀粉高效产电^[29]，被研究者认为是典型的产电菌种. 如前所述，Actinobacteria门细菌常出现在富含难降解有机物环境中，隶属于Actinobacteria门的Band 15和18分别与Cellulomonas(纤维素单胞菌属)和Brooklawnia属细菌存在高度同源性，其中Cellulomonas属细菌是细菌界具有代表性的一类纤维素降解的菌群^[26]. 条带Band 4、 6、 7和8的序列均属于拟杆菌门，其中条带Band 7(拟杆菌属，Bacteroides)在GenBank中存在相似度≥95%的序列； Band 4和6分别与紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)和腐螺旋菌科(Saprospiraceae)细菌16S rRNA序列存在较高的相似度； 而Band 8与现有拟杆菌门未分类细菌序列存在＞98%相似度； 这表明条带Band 4、 6、 8所代表的细菌种为目前还未被人类所分离鉴定的新细菌种，其属性和价值有待进一步挖掘和研究.

3 结论

实验研究结果显示，生物阴极MFC可利用牛粪长期稳定产电，内电阻小，功率密度高，并且能量回收效率随运行时间的延长而增加，TCOD去除效率随时间增加而降低. 阳极微生物群落结构分析显示，变形菌门、 拟杆菌门、 厚壁菌门是阳极生物膜中的主要菌群，其中一些已证明有产电能力和纤维素高效降解能力的细菌种在阳极表面富集.