有机锡类化合物(organic tin compounds,OTC)是目前已知唯一的金属化合物类内分泌干扰物，也是人为引入水环境中最毒的化学物质之一^[1]. 有机锡作为塑料稳定剂、 防腐剂、 海洋建筑和船舶防污涂料等大量使用，导致了全球性的水体和沉积物污染. 其中，在环境中残留量及毒性最大的 OTC 是三丁基锡(TBT)和三苯基锡(TPhT)，其高毒性和持久性使水体有机锡污染受到广泛关注^[2,3].

在适宜条件下，OTC可通过光解、 化学降解及生物降解等途径从环境中去除. 而那些不暴露于紫外线下的 OTC的去除主要靠微生物作用^[4,5]. 对于OTC等疏水性有机污染物而言，其低水溶性极大地限制了其微生物降解和污染环境生物修复. 目前OTC的微生物降解研究大多关注于菌种选育、 降解过程中环境及其他影响因素的优化和降解产物检测方法改进等方面^{[6, 7, 8]}. 然而，有关TPhT生物降解机制和通过表面活性剂增强其降解性能的报道较少，TPhT降解与菌体营养代谢的关系，以及TPhT降解过程中各苯环的脱苯是同步还是逐步发生还不明确. 为解决这些问题，从而阐明降解菌降解TPhT的速效机制，本研究以TPhT作为对象，选用在食品工业、 化妆品和医药工业中广泛应用的非离子表面活性剂吐温80为增溶剂，考察吐温80对TPhT的增溶作用，探究TPhT和降解菌之间的相互影响，分析降解过程菌体的离子释放和吸收，通过产物分析探索TPhT的降解途径. 1 材料与方法 1.1 实验材料

TPhT储备液：称取1 g TPhT，溶于1 L色谱级甲醇，即得1 g ·L^-1的TPhT储备液，4℃下保存待用.

实验菌种：TPhT降解菌由本课题组于有机锡污染的环境中筛选获得.

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH至7.2~7.4.

无机盐培养基：NaHPO₄ ·12H₂ O、 KH₂PO₄、 NH₄Cl和MgSO₄的浓度分别为150、 50、 30和15 mg ·L^-1.

在50 mL锥形瓶中，加入200 μL 100 mg ·L^-1 TPhT标准使用液，待甲醇挥发后加入一定量的吐温80母液，补充双蒸水使得体系为20 mL，吐温80的浓度分别为0、 5、 10、 20、 30、 40、 50和80 mg ·L^-1，将各溶液超声水浴30 min后，置于30℃，130 r ·min^-1的摇床振荡24 h，然后静置平衡12 h，于6 000 r ·min^-1离心10 min，移取10 mL离心的上清液，用等体积的乙酸乙酯超声辅助萃取2次，用流动相定容后进行高效液相色谱检测. 实验中每一处理设3个平行，重复2次.

将降解菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，于30℃，130 r ·min^-1的摇床中活化24 h，再次接种到牛肉膏蛋白胨培养液扩大培养12 h后，6 000 r ·min^-1离心10 min获得菌体. 菌体用无菌蒸馏水清洗3次，配成干重为3 g ·L^-1的菌悬液待用.

在锥形瓶中加入TPhT待甲醇挥发后加入菌悬液，并加入一定量的吐温80母液，补充无机盐培养基至降解体系总体积为20 mL，使得TPhT的浓度为1 mg ·L^-1，投菌量干重为0.3 g ·L^-1，吐温80的浓度为0、 5、 10、 20、 30、 40、 50和80 mg ·L^-1，在30℃、 130 r ·min^-1的摇床振荡降解48 h. 1.4 菌体降解TPhT过程对Biolog ECO板碳源的利用效果

分别取降解TPhT 1 h和48 h的样品稀释后加入Biolog ECO板中，于30℃恒温培养，在0~168 h内每间隔24 h测定其在590 nm处的吸光度值，考察不同条件下菌体降解TPhT过程中对碳源的利用能力，并设置不加污染物的对照实验，每组设3个平行. 1.5 菌体降解TPhT过程中的离子代谢

取实验1.3.2节中降解TPhT 48 h的实验体系于6 000 r ·min^-1离心10 min，所得上清液过0.22 μm的滤膜，使用ICS-900离子色谱仪检测Cl^-、 PO^3-₄、 Na⁺、 NH⁺₄、 K⁺、 Mg²⁺浓度，设置不加TPhT作为对照，每组3个平行.

样品的预处理：1 mg ·L^-1 TPhT在投菌量为0.3 g ·L^-1的20 mL降解体系中分别降解1~7 d后，用20 mL正己烷超声萃取2次，合并有机相在25℃下旋转蒸发，加入5 mL甲醇洗脱，加入 5 mL 醋酸钠/冰乙酸缓冲溶液(pH=4.5)和2 mL 2%的四乙基硼化钠溶液，超声 15 min，加入 5 mL正己烷，超声 15 min，静置分层，取上层有机相进行GC-MS分析.

GC条件：DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)； 柱温采用程序升温. 升温程序：初温50℃，保持1.5 min后以 10℃ ·min^-1速率升至 300℃，保持4 min； 进样口温度280℃； 载气为高纯氦(纯度>99.999%)，流速1.1 mL ·min^-1； 不分流进样，1.0 min后开阀； 进样量为1 μL.

MS条件：电离方式为电子轰击； 电子能量70 eV，离子源温度 250℃，溶剂延迟 2.6 min，根据各种苯基锡化合物的保留时间及特征离子峰进行定量分析.

2 结果与分析 2.1 吐温80对TPhT的增溶作用

图 1显示TPhT的溶解度随着吐温80浓度的增加而增加，吐温80浓度为80 mg ·L^-1时，TPhT的溶解度最大. 非离子型表面活性剂的稳定性高，不易受无机盐干扰，在水与有机溶剂中常有较好的溶解性能. 在污染环境修复中，非离子型表面活性剂是被采用最多的一类表面活性剂. 吐温80是一种非离子表面活性剂，由于其毒性低、 用量小等特点已被广泛用作增溶剂、 乳化剂等，其临界胶束浓度为13~15 mg ·L^{-1 [9,10]}.

图 1

Fig. 1

图 1 吐温80对TPhT的增溶作用 Fig. 1 Solubilization effect of Tween 80 on TPhT

当表面活性剂的质量浓度较低时，主要以单体的形式存在； 当浓度增大到一定值后，活性剂分子会形成球状、 层状或棒状的胶束，亲油基团彼此靠在一起，而亲水基团向外伸向水相^[11]. 溶液中的表面活性剂胶束和单体对有机物具有增溶作用，可大大提高有机污染物在溶液中的溶解度^[12]. 吐温80对TPhT的增溶作用有利于菌体对其生物降解.

TPhT水溶性差、 生物有效性差等特点导致了其生物降解延缓. 研究^[13,14]发现TPhT需要经过较长的时间才能被降解得较完全. 因此添加一定浓度的吐温80，增大TPhT在水中的溶解度，从而快速提高TPhT的降解. 图 2所示，体系中加入吐温80后，降解2 d后TPhT的残余浓度均低于菌体单独降解TPhT的对照组. 并且当吐温80浓度为80 mg ·L^-1时，降解效果最好，20、 50 mg ·L^-1时次之，但相差不大，TPhT残余浓度为50%左右. 考虑到80 mg ·L^-1的浓度偏大，故后续实验中吐温80浓度定为50 mg ·L^-1.

图 2

Fig. 2

图 2 吐温80对TPhT降解的影响 Fig. 2 Effect of Tween 80 on TPhT degradation

吐温80对苏云金芽孢杆菌降解TPhT的促进作用与如下原因有关. 首先，吐温80提高了TPhT溶解度(图 1)，从而有利于菌体吸附溶解的TPhT，并进一步通过膜运输使之进入细胞内. 由于TPhT的生物降解主要发生在细胞内，因此，该促进作用有助于提高TPhT的降解率^[8,15]. 吐温80对三丁基锡的处理也达到了类似的效果，1单位临界胶束浓度的吐温80可以将三丁基锡的溶解度提高13%^[16]. 此外，吐温80能调节细胞表面的疏水性，提高菌体和TPhT的亲和性，从而增加TPhT的生物降解. 除了这些原因，在本实验中使用的表面活性剂也可作为碳源供细胞新陈代谢过程中使用^[8].

图 3为降解TPhT 1 h和48 h后菌体对碳源的利用效果. 每孔平均吸光度变化(AWCD)是Biolog-ECO板上31种底物碳源平均颜色变化率，反映微生物群落代谢的总体活性，是衡量微生物利用碳源能力的重要指标^{[17, 18, 19]}.

图 3

Fig. 3

图 3 处理TPhT 1 h和48 h后菌体对碳源的利用效果 Fig. 3 Utilization of carbon nutrients by cells after degradation of TPhT for 1 h and 48 h

降解TPhT 1 h后菌体对碳源的利用效果如图 3(a)所示，随着培养时间的延长，AWCD值呈现先增加后逐渐趋于稳定的趋势. 在TPhT存在的情况下，菌体对31种底物碳源的综合利用能力均强于对照组，说明TPhT在一定程度上刺激了菌体的活性，从而促进了菌体对ECO板底物碳源的利用. 而添加了吐温80的实验组，其AWCD值低于不加吐温80的实验组，说明在吐温80存在的情况下，菌体将吐温80作为碳源加以利用，而对底物碳源的利用有所降低.

降解TPhT 48 h后，AWCD值也是随时间延长先增加再趋于稳定，但到达平衡的时间有所延长，而且平衡时的AWCD值高于降解TPhT 1 h后的菌体. 该结果说明在48 h的降解过程中，菌体已适应了TPhT的毒性，并能够利用TPhT做为能源物质进行新陈代谢，使得体系中菌体含量多于仅短时间接触TPhT的实验组.

TPhT的高脂溶性导致了其易于与细胞接触并侵入细胞^[20]，进而引起细胞内外阴阳离子的变化. 同时，由于TPhT微生物降解是代谢依赖过程，TPhT的降解效果在一定程度上与营养物质的利用相关. 为了分析TPhT生物降解与离子代谢的关系，本实验检测了降解2 d后体系中几种常规代谢离子的浓度. 图 4中的离子浓度是减去对照后的结果，故正值表示菌体释放离子，负值意味着细菌从无机盐体系中吸收离子.

图 4

Fig. 4

图 4 吐温80对TPhT降解过程中阴阳离子的影响 Fig. 4 Effect of Tween 80 on ions release during TPhT degradation

受到渗透压或其他胁迫及培养基成分变化时，细胞会开放膜通道，使得细胞内外的营养物质或离子发生运输^[21,22]. 不同价态离子的膜通道可被众多不同的因素激活，如胞内和胞外信使、 化学试剂和渗透压等^[23]. 因此，在没有TPhT和吐温80的空白对照体系中，细菌向体系释放Cl^-、 PO^3-₄、 Na⁺、 NH⁺₄、 K⁺和Mg²⁺，这可能是因为TPhT的膜通透性作用，对菌体产生了一定的毒性影响，从而促进了胞内离子的释放. 在以脂质膜和红细胞膜为代表物开展的研究中，也证实了TPhT可以与细胞膜中的脂质和蛋白质等成分发生作用，并改变膜结构^[24,25]. 实验结果表明，吐温80的投加导致这些离子的释放量减少或吸收量增加，其中，菌体对Cl^-、 PO^3-₄和K⁺呈现了吸收的趋势. 随着表面活性剂浓度的增加，这些离子浓度的变化趋势呈现一定的差异.

由于Na⁺和K⁺在细胞中含量丰富，其释放被看做是膜通透性改变的标志^[26]. 例如，TPhT对假丝酵母的毒性评估依据就是K⁺的释放和膜流动性的改变^[27]. 图 4(a)显示，吐温80致使Na⁺和K⁺的释放显著减少，说明吐温80减轻了TPhT对菌体的毒性作用，避免了菌体大量死亡或膜通透性过大出现的胞内离子大量外流. K⁺的吸收则进一步说明了吐温80改善了菌体在降解TPhT过程的代谢. 该改善作用也与吐温80对菌体降解TPhT的促进有关. 菌体对TPhT降解量的增加相应地也需要增加对胞外离子的吸收. 5 mg ·L^-1的吐温80使得Mg²⁺释放量略有减少，之后随着吐温80浓度的增加而保持稳定状态. 在许多生物过程中，Mg²⁺是不可或缺的辅助因子，特别在酶活性、 代谢调控和维持核酸结构稳定性等方面^[28,29]. Mg²⁺释放量的减少有利于维持菌体的正常生理代谢. NH⁺₄是菌体蛋白N末端结构域的组成成分，这些成分可以降解产生氨基酸残基和NH⁺₄. 而NH⁺₄的释放可能是因为TPhT导致部分含NH⁺₄的细胞分子降解引起的. 图 4(b)证实在所有检测的离子中，PO^3-₄的浓度变化最为明显，未加吐温80时菌体向体系释放PO^3-₄，添加吐温80后，菌体从体系中吸收PO^3-₄，且PO^3-₄的吸收量随着吐温80的浓度增加而增加. 细胞内存在大量的磷酸盐，如磷酸肌酸、 磷酸胍、 ATP和ADP等^[30]. 在细胞内磷酸化反应中，活细胞可以通过细胞膜吸收PO^3-₄. 菌体从体系中吸收PO^3-₄说明细胞在降解TPhT的过程中需要大量的能量. Cl^-的变化规律与PO^3-₄相似. 有报道称有机锡化合物可以调节卤化物和其他无机阴离子通过生物膜的交换扩散^[31]，还可以通过氯化物的交换扩散机制运输有机阴离子通过脂双层^[15]. 表 1的相关性分析显示，吐温80浓度与Mg²⁺在0.05水平上显著负相关. 此外，这些离子相互之间在0.01水平上具有显著性，意味着一些离子的释放可能同其他离子的外排相耦合.

表 1(Table 1)

表 1 吐温80的浓度与各离子浓度变化的相关关系 1) Table 1 Correlation between Tween 80 concentration and ion concentration Tween 80 Cl- PO3-4 Na+ NH+4 K+ Mg2+ Tween 80 1 Cl- -0.576 1 PO3-4 -0.599 0.988** 1 Na+ -0.442 0.942** 0.964** 1 NH+4 -0.415 0.882** 0.851** 0.853** 1 K+ -0.697 0.967** 0.975** 0.913** 0.877** 1 Mg2+ -0.739* 0.960** 0.970** 0.906** 0.839** 0.990** 1 1)*表示在P=0.05水平时的相关性；**表示在P=0.01水平时的相关性

表 1 吐温80的浓度与各离子浓度变化的相关关系 1) Table 1 Correlation between Tween 80 concentration and ion concentration

图 5显示，在7 d内TPhT逐渐被菌体降解转化成毒性较小的二苯基锡(DPhT)和一苯基锡(MPhT). 但是在降解后的溶液中，没有检测到苯，这意味着苏云金芽孢杆菌对TPhT的降解是从裂解苯环开始的，而不是始于苯环和锡原子之间共价键的断裂. 第3~7 d TPhT的降解速度明显低于前两天. 造成该结果的原因主要与以下3个方面原因有关：①随着浓度的下降，残余的TPhT接触细胞并与官能团或酶等结合的机会也相应减少； ②随着TPhT的降解，无机盐营养体系中养分被消耗而逐渐减少，图 4已证实了体系离子浓度的变化情况； ③菌体的生物量和细胞代谢活性受到TPhT的负面影响. 在短芽孢杆菌对TPhT的生物降解中已经发现在TPhT和其代谢产物作用下一些细胞发生了凋亡^[8].

图 5

Fig. 5

图 5 三苯基锡及其降解产物的浓度随时间的变化 Fig. 5 Changes in the concentration of TPhT and its degradation products with time

随着时间的延长，DPhT的浓度几乎呈线性下降，说明TPhT转化为DPhT后被进一步降解. 然而，MPhT的初始浓度较低，大概在0.08~0.11 μmol ·L^-1. 这有可能是因为MPhT快速转化为无机锡，又或者是在第一天TPhT和DPhT降解为MPhT的速率缓慢. 降解3 d后，MPhT的浓度高于DPhT. 由于TPhT的结构中3个苯环均直接与锡原子相连接，所以这些苯环可能同步裂解或是分别裂解，从而导致了TPhT可以同时降解成DPhT和MPhT； 而且DPhT也可以降解为MPhT，从而导致了此时MPhT的累积.

为了验证上述推论，用苏云金芽孢杆菌分别降解了初始浓度为1 mg ·L^-1的DPhT和MPhT(图 6). 图 6表明，苏云金芽孢杆菌不仅能降解TPhT，而且能降解其产物DPhT和MPhT. 从图 6(b)可以看出菌体在降解DPhT的过程中会产生MPhT，且随着降解时间的推移，生成的MPhT又被进一步降解. 而自第3 d起MPhT的浓度便逐渐降低，说明MPhT的降解速率要高于生成速率，因此，MPhT被生物转化成无机锡的过程不是TPhT降解的限速步骤. MPhT在第3 d的累积(图 5)证实了MPhT是DPhT的降解产物外，还有一部分MPhT是由TPhT直接降解而成的. 相对于TPhT而已，MPhT的毒性较低. 此外，就3种苯基锡的分子结构复杂程度来说，TPhT的结构最复杂，分子最大，菌体对其利用不如DPhT、 MPhT容易. 故随着降解时间的延长，MPhT降解率显示逐渐增加的趋势.

图 6

Fig. 6

图 6 一苯基锡和二苯基锡的生物降解效果 Fig. 6 Changes in the concentration of MPhT and DPhT with time

运用动力学模型中常用的准一级动力学方程和准二级动力学方程对MPhT、 DPhT、 TPhT这3种苯基锡的降解过程进行拟合，发现准二级动力学方程 能够很好地描述3种苯基锡的降解规律(表 2)，其中r2值均大于0.960. 而拟合结果表明可以利用准二级动力学模型预测菌体在不同时间里对3种苯基锡的降解规律.

表 2(Table 2)

表 2 3种有机锡微生物降解过程的动力学方程拟合参数 Table 2 Parameters of the kinetic models used to describe the biodegradation of three kinds of OTC 处理 准一级动力学方程 lg(qe－q)=lgqe－kt/2.303 准二级动力学方程 t/qt=1/(kqe2)+t/qe k qe r2 k qe r2 MPhT 0.429 0.008 0.967 15.963 0.011 0.994 MPhT+Tween 80 0.421 0.010 0.929 10.343 0.014 0.960 DPhT 0.537 0.005 0.988 67.427 0.006 0.983 DPhT+Tween 80 0.535 0.006 0.996 60.961 0.007 0.994 TPT 0.475 0.002 0.815 255.886 0.004 0.985 TPhT+Tween 80 0.850 0.006 0.995 117.948 0.006 0.984

表 2 3种有机锡微生物降解过程的动力学方程拟合参数 Table 2 Parameters of the kinetic models used to describe the biodegradation of three kinds of OTC

(1)投加量在5~80 mg ·L^-1范围内，TPhT的溶解度随着吐温80浓度的增加而增加. 苏云金芽孢杆菌和吐温80共同处理1 mg ·L^-1 TPhT 2 d后，TPhT残余浓度降为48.4%.

(2)菌体处理TPhT过程会向无机盐体系释放一定量的Na⁺、 NH⁺₄、 K⁺、 Mg²⁺、 PO^3-₄和Cl^-，吐温80的加入可显著地降低细胞内Na⁺、 NH⁺₄和Mg²⁺的释放，增加菌体对细胞外Cl^-、 PO^3-₄和K⁺的吸收.

(3)苯基锡的生物降解始于苯环裂解，TPhT中各苯环的开环反应可以单独进行，亦可同步发生，进而产生DPhT、 MPhT和无机锡.